ARMADILHA digital da gota (ddTRAP): adaptação do protocolo da amplificação da repetição de telomere à reacção em cadeia da polimerase de droplet Digitas

Resumo

Nós convertemos com sucesso o ensaio padrão do protocolo da amplificação da repetição do telomere (armadilha) a ser empregado em reações Chain digitais do polymerase da gota. Este novo ensaio, chamado ddTRAP, é mais sensível e quantitativo, permitindo uma melhor detecção e análise estatística da atividade de telomerase dentro de várias células humanas.

Resumo

O protocolo da amplificação da repetição do telomere (armadilha) é o ensaio o mais extensamente usado para detectar a atividade do telomerase dentro de um dado uma amostra. A reacção em cadeia do polymerase (PCR)-baseou o método permite medidas robustas da atividade de enzima da maioria de lysates da pilha. A armadilha baseada em gel com primers com rótulo fluorescente limita a taxa de transferência da amostra, e a capacidade de detectar diferenças nas amostras é restrita a duas vezes ou mais alterações na atividade enzimática. A armadilha digital da gota, ddTRAP, é uma aproximação altamente sensível que seja modificada do ensaio tradicional da armadilha, permitindo que o usuário realize uma análise robusta em 96 amostras por a execução e obtenha a quantificação absoluta do ADN (produtos da extensão do telomerase ) de entrada dentro de cada PCR. Conseqüentemente, o ensaio recentemente desenvolvido de ddTRAP supera as limitações do ensaio tradicional gel-baseado da armadilha e fornece uma aproximação mais eficiente, exata, e quantitativa para medir a atividade do telomerase dentro do laboratório e das configurações clínicas.

Introdução

Telômeros são complexos de proteína de DNA dinâmicos nas extremidades dos cromossomas lineares. Os telômeros humanos são compostos de uma matriz de 5 '-TTAGGG_n repetições hexamérica que variam de comprimento entre 12 – 15 kilobases (KB) ao nascimento¹. A telomerase humana, a enzima ribonucleoproteína que mantém os telómeros, foi identificada pela primeira vez em lisados de células HeLa (linha celular cancerosa)². Juntos, telómeros e telomerase desempenham um papel importante em um espectro de processos biológicos, como proteção do genoma, regulação gênica e imortalidade de células cancerosas^3,4,5,6.

O telomerase humano é compreendido primeiramente de dois componentes chaves, a saber o transcriptase reverso do telomerase e o RNA do telomerase (hTERT e hTERC, respectivamente). O subunit da proteína, hTERT, é o componente reverso catalètica ativo do transcriptase da enzima do telomerase. O molde do RNA, hTERC, fornece o telomerase com o molde para estender e/ou manter telômeros. A maioria dos tecidos somáticos humanos não têm atividade de telomerase detectável. A incapacidade de DNA polimerase para estender o fim da costa retardada de DNA, juntamente com a falta de telomerase leva ao encurtamento progressivo de telômeros após cada rodada de divisão celular. Estes fenômenos conduzem ao encurtamento do telomere em a maioria de pilhas somáticas até que alcancem um comprimento crìtica encurtado, por meio de que as pilhas entram em um estado da senescência replicativa. O número máximo de vezes que uma célula pode dividir é ditada pelo comprimento do telômero e este bloco para a continuação da divisão celular é pensado para prevenir a progressão para a oncogênese⁷. As células cancerosas são capazes de superar a senescência replicativa induzida por telômeros e continuam a proliferar utilizando a telomerase para manter seus telómeros. Aproximadamente 90% dos cânceres ativam a telomerase, tornando a atividade de telomerase extremamente importante na detecção e tratamento do câncer.

O desenvolvimento do ensaio TRAP na década de 1990 foi fundamental na identificação dos componentes necessários da enzima telomerase, bem como para a mensuração da telomerase em uma ampla gama de células e tecidos, tanto normais quanto cancerosas. O ensaio de PCR baseado em gel original utilizou substratos de DNA rotulados radioativamente para detectar atividade de telomerase. Em 2006, o ensaio foi adaptado para uma forma não radioativa usando substratos fluorescenterotulados^8,9. Usando substratos fluorescente etiquetados, os usuários puderam Visualizar os produtos da extensão do telomerase como as faixas em um gel expondo o ao comprimento de onda correto da excitação. A sensibilidade do ensaio TRAP e sua capacidade de detectar atividade de telomerase em lisados de células brutas fez deste ensaio o método mais utilizado para a detecção de atividade de telomerase. No entanto, o ensaio TRAP tem limitações. O ensaio é baseado em gel, dificultando a realização das repetições necessárias em estudos de moderada a alta produtividade, e assim, a análise estatística adequada raramente é alcançada. Além disso, o ensaio baseado em gel é difícil de quantificar de forma confiável devido à incapacidade de detectar menos de duas diferenças na atividade de telomerase entre as amostras. Superar essas duas limitações é fundamental para ensaios de atividade enzimática, como o TRAP, para se deslocar para as configurações clínicas ou da indústria para a detecção de atividade de telomerase em amostras de pacientes ou estudos de projeto de drogas.

O PCR de Digitas foi desenvolvido inicialmente no 1999 como meios converter a natureza exponencial e análoga do PCR em um ensaio linear e digital¹⁰. O PCR digital do droplet (ddPCR) é a inovação a mais recente da metodologia digital original do PCR. O PCR digital da gota veio aproximadamente com o advento do microfluídica avançado e da química da emulsão do óleo-em-água para gerar confiantemente gotas estáveis e ingualmente feitas medida. Ao contrário do PCR gel-based e mesmo quantitativo (qPCR), ddPCR gera a quantificação absoluta do material da entrada. A chave para ddPCR é a geração de ~ 20.000 reações individuais por particionamento de amostras em gotas. Após o PCR do ponto final, o leitor da gota examina cada gota em um fluxo-cytometer-como a forma, contando, dimensionando, e registrando a presença ou a ausência de fluorescência em cada gota individual (isto é, ausência ou presença de amplicons do PCR em cada gota). Em seguida, usando a distribuição de Poisson, as moléculas de entrada são estimadas com base na proporção de gotas positivas para o número total de gotículas. Este número representa uma estimativa do número de moléculas de entrada em cada PCR. Além disso, o ddPCR é executado e analisado em uma placa do 96-well que permita que o usuário execute muitas amostras, assim como executa réplicas biológicas e técnicas para a análise estatística apropriada. Em conseqüência, nós combinamos a natureza poderosa da quantificação e da moderado-taxa de ddPCR com o ensaio da armadilha para desenvolver o ensaio de ddTRAP¹¹. Este ensaio é projetado para que os usuários estudem e quantifiquem de forma robusta a atividade de telomerase absoluta a partir de amostras biológicas^11,12. A sensibilidade do ddTRAP permite a quantificação da atividade de telomerase de amostras limitadas e preciosas, incluindo medições de células únicas. Além disso, os usuários também podem estudar os efeitos de manipulações de telomerase e/ou drogas com quantificação absoluta de menos de duas alterações (~ 50% de diferenças). O ddTRAP é a evolução natural do ensaio TRAP na natureza digital e de maior rendimento de experimentos laboratoriais modernos e ambientes clínicos.

Protocolo

1. preparação e armazenamento do tampão

1. Prepare 50 ml de 1x estoque RNase-/DNase-Free NP-40 lysis buffer (10 mm Tris-HCl [pH 8,0], 1 mm MgCl_1,2mm etilenodiaminotetracético ácido (EDTA), 1% [VOL/VOL] NP-40, 10% [VOL/VOL] glicerol, 150 mm NaCl, 5 mm β-Mercaptoetanol e 0,1 mm 4- cloridrato de fluoreto de benzenesulfonilo (AEBSF)). Este tampão pode ser aliquotado e armazenado em-20 ° c para o uso futuro. Evite ciclos de congelamento/descongelação para obter uma lise ideal das células.
2. Prepare 50 mL de 10x estoque RNase-/DNase-free buffer de extensão de armadilha (200 mM Tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl₂, 630 mm kcl, 0,5% [VOL/VOL] Tween 20, e 10 mm etileno glicol-bis (β-aminoetil éter)-N, N, n ′, n′-Tetraacetic ácido (EGTA)). Esta memória intermédia pode ser aliquotada em alíquotas de 1 mL e armazenada a-20 ° c para utilização futura.

2. lise celular

1. Preparação das células
   1. Descongelar uma alíquota congelada de tampão de Lise NP-40. Uma vez descongelado, coloque o tampão de Lise no gelo. Adicionar fluoreto de fenilmetilsulfonila (inibidor da protease de PMSF) ao tampão de Lise NP-40 para atingir uma concentração final de 0,2 mM.
      Observação: isso deve ser feito imediatamente antes de lisar as células.
   2. Retire qualquer excesso de líquido das pelotas de células coletadas para garantir um pellet de células secas. Note-se que as pelotas de células, se recém-coletadas ou previamente congeladas (-80 ° c ou flash congelado em líquido N₂), não devem conter quaisquer soluções remanescentes de centrifugações anteriores, pois estas soluções podem interferir com os procedimentos a jusante.
   3. Cresça, colete e congele as linhas celulares telomerase-positivas e telomerase-negativas (fibroblastos BJ, IMR-90 ou U2OS) para utilizá-los como controles positivos e negativos. Utilize novos lysates de controlo sempre que o ensaio for efectuado para garantir a reprodutibilidade do ensaio.
      Nota: recomenda-se que uma grande cultura de células telomerase-negativas é cultivada e aliquotada antes do congelamento para remover quaisquer artefatos relacionados à cultura do tecido que podem ser introduzidos durante a cultura de longo prazo das linhas celulares para ajudar a garantir resultados reprodutíveis de a amostra de controle negativo.
   4. Coloque as pelotas de células no gelo. Se as células estivessem congeladas, deixe-as descongelar brevemente no gelo.
      Nota: os tamanhos típicos da pelota da pilha para o ddTRAP estão entre 500.000 e 1 milhão pilhas. As pelotas menores da pilha podem igualmente ser usadas se necessário, mas o número da pilha deve/idealmente deve ser sabido. O ddTRAP pode igualmente ser executado baseado na entrada da proteína usando um ensaio da proteína de BCA (a entrada é geralmente 1 μg).
2. Lysing das pilhas
   1. Lyse as células no tampão de Lise NP-40. Manter uma equivalência celular de 25.000 células/μL de buffer. Por exemplo, lyse um pellet (contendo 1 milhão células) em 40 μL de tampão de Lise NP-40. Gentilmente pipeta o lisado para cima e para baixo, a fim de quebrar as células abertas. Tente evitar fazer bolhas.
   2. Permitir que as células a lyse no gelo por 30 min. Certifique-se de vórtice suavemente o lisado para evitar clusters de restos de células de formação. Isso pode ser feito a cada 10 min e destina-se a manter o lisado uma mistura homogeneizada.
   3. Diluir o lisado celular (25.000 células/μL) 1:20 no tampão de Lise NP-40, tornando a nova célula equivalência 1.250 células/μL. Por exemplo, diluir 5 μL de lisado celular em 95 μL de tampão de Lise.

3. reação da extensão de telomerase

1. Prepare uma mistura mestra (tabela 1) para a reação de extensão de telomerase (por reação).
   Nota: é melhor preparar a mistura mestra de reação de extensão durante a lise da célula e armazená-la no gelo.
   1. Pipet 48 μL da mistura mestra da extensão em cada tubo do PCR.
   2. Adicionar 2 μL do lisado diluído (1.250 células/μL) à reacção de extensão. O volume total deve agora ser 50 μL com uma equivalência celular final de 50 células/μL.
2. Realize a reação de extensão da telomerase (tabela 2).
3. Armazene os produtos da extensão do telomerase em 4 ° c por até 3 – 5 dias; no entanto, é ideal para usar os produtos de extensão dentro do primeiro 24 h.

4. configuração digital do PCR da gota

1. Prepare uma mistura mestra (tabela 3) para o ddtrap (por reação).
   Nota: uma vez que os reagentes estão à temperatura ambiente, não os coloc ou a mistura mestra no gelo. Colocando a mistura no gelo pode aumentar a viscosidade e levar à formação de gotas pobres. O polymerase do ADN no Supermix de ddPCR é um começo quente e deve ser estável na temperatura ambiente. A supermistura ddPCR pode ser armazenada a 4 ° c após um descongelamento inicial de-20 ° c.
   1. Pipet 19,8 μL da mistura mestra de ddPCR em cada tubo do PCR.
   2. Adicionar 2,2 μL da reacção de extensão a cada tubo. Note que o volume total deve ser agora de 22 μL.
      Nota: a quantidade total de amostra necessária para um ddTRAP é de 20 μL (equivalência celular de células 100). O volume extra é uma precaução para o erro do pipeta ou a perda da amostra.
2. Configure o cartucho de geração de gotas.
   Nota: o cartucho contém três colunas diferentes de poços rotulados.
   1. Carregar 20 μL da reacção preparada de acordo com o passo 4.1.2 para o poço da amostra (poço médio) no cartucho. Evite bolhas ao Pipetar a amostra.
      Nota: se existirem bolhas, toque suavemente no lado do cartucho de modo a que estas bolhas venham para o topo da solução.
   2. Carregar 70 μL de óleo de geração de gotas no poço de óleo (poço esquerdo).
      Nota: a fim evitar a contaminação, use estritamente um jogo separado das pipetas e das pontas para etapas da geração da gota do ddPCR. A ordem de carregamento do cartucho é importante. A amostra deve ser carregada antes de carregar o óleo como o óleo é mais pesado e vai encher as câmaras microfluídicos e levar a formação de gotas pobres. O número mínimo de exemplos que podem ser executados é oito. Todos os poços do cartucho devem ser carregados com a amostra, pois qualquer poço vazio levará a uma parada na geração de gotas a partir do gerador de gotículas. Se não estiverem disponíveis amostras adequadas para carregar todos os oito poços dentro de um cartucho, 20 μL de mistura mestra ddTRAP (passo 4,1) podem ser carregados nos cartuchos restantes.
   3. Fixe a junta no lugar, amarrando-o até as extremidades do cartucho.
      Nota: a falta ou colocação inadequada da junta impedirá o gerador de gerar gotículas.
   4. Coloque o cartucho carregado e montado no gerador de gotas.
      Nota: o cartucho é reconhecido por um ímã no gerador, que informará o usuário quando o cartucho é coloc corretamente.
3. Retire o cartucho uma vez que as gotas são geradas e o ciclo está completo (~ 60 – 90 s).
   1. Retire suavemente a junta do cartucho. Pipet as gotas recentemente geradas (direita bem), usando uma pipeta multicanal, em uma placa do PCR do 96-poço.
      Nota: o volume aproximado para a emulsão de gota recém-gerada deve ser de 40 – 43 μL.
   2. Aqueça a placa com selos da placa do PCR da folha de alumínio uma vez que todas as amostras são carregadas na placa do 96-well a fim impedir a evaporação durante as etapas do PCR.
4. Coloque a placa de 96-poços no termocicreador e realize a seguinte reação de PCR (tabela 4).
   Nota: todas as taxas de rampa entre as etapas da temperatura devem ser ajustadas a 2,5 ° c/s a fim aquecer corretamente as reações.

5. deteção de produtos da extensão do telomerase

1. Coloque a placa de 96-poços no leitor de gotas.
   Nota: Certifique-se de que orienta correctamente a placa de modo a que a amostra a1 corresponda com a do suporte.
   1. Abra o software associado ao leitor de gotas. Clique duas vezes no primeiro bem a1 para abrir a tela de editor de amostra/poço.
   2. Clique em experimento e selecione ABS no menu suspenso.
      Nota: o experimento define o tipo de ensaio a ser utilizado (i.e., quantificação absoluta ou ensaio de número de cópia gênica). ABS significa quantificação absoluta.
   3. Selecione QX200 ddPCR Evagreen Supermix para garantir que o método de detecção correto seja empregado pelo leitor. Clique em aplicar no lado direito inferior da tela do editor de poços para salvar as configurações definidas pelo usuário em todos os poços destacados.
      Nota: Supermix define o tipo de mistura de PCR e química de detecção que será lido pelo leitor.
   4. Estale sobre o alvo na tela do editor do poço do software a fim definir a amostra.
   5. Defina o tipo de exemplo clicando no menu suspenso de destino e selecionando desconhecido, referênciaou NTC (controle no-template).
      Nota: desconhecido se referiria a uma amostra experimental, a referência poderia ser uma amostra de controle da atividade telomerase conhecida, e um NTC é um controle crítico para a determinação da validade do ensaio em termos de contaminação e sinal de fundo.
   6. Identifique todas as amostras na seção nome da amostra e clique em aplicar para garantir que os poços destacados sejam editados apropriadamente.
2. Clique em executar para executar/ler a placa. Selecione colunas ou linhas na tela Opções de execução quando solicitado a informar a máquina sobre a orientação na qual a placa deve ser lida.

6. análise dos dados

1. Determine o número de gotas aceitas para cada amostra clicando em poços individuais. Clique duas vezes os poços individuais ou cabeçalhos de coluna/linha para exibir e analisar os dados de exemplo.
   Nota: os critérios mais importantes para se proceder ou não à análise de uma amostra específica é o número de "gotas aceites". Para o ddTRAP, amostras com 10.000 ou mais gotas aceitas são válidas para análise posterior. Os dados podem ser fornecidos ao usuário em muitos formatos, incluindo uma tabela. csv, imagens. jpg, histogramas, etc. Há muitos recursos disponíveis para a análise aprofundada de dados ddpcr, incluindo o ddtrap^11,12. Esses recursos oferecem um guia para analisar os dados do ddtrap, desde a seleção dos limiares^11,12 até a escolha das amostras para posterior análise^11,12, identificando falsos positivos e negativos¹³, e solução de problemas geral¹³.
2. Realce os poços que representam as réplicas de amostra e amostras de NTC. Analise as amostras em comparação com NTC ou linhas de controle negativas, como as células BJ (conforme listado acima na etapa 2.1.2).
   1. Defina manualmente o limite para as amostras clicando no ícone para definir limiares no canto inferior esquerdo da tela. Definir limiares para cada poço individual ou para vários poços de cada vez (recomendado).
      Nota: se o fundo for detectado no NTC, pode ser subtraído de todas as outras amostras para ' normalizar ' o sinal e garantir que apenas o sinal positivo verdadeiro é analisado. Os valores de NTC são tipicamente na escala da molécula 0.2-1/μL para o sistema de amortecedor NP-40 da lise. Outros sistemas e componentes de buffer precisam ser testados (por exemplo, buffers de CHAPS).

Resultados

Usando o ddtrap, a atividade da telomerase foi medida em um painel da pilha que consiste nas seguintes linhas de pilha (Figura 1): cancro de pulmão da pilha CPNPC (H2882, H1299, Calu6, H920, A549, e H2887), cancro de pulmão pequeno da pilha (H82 e SHP77), e telomerase-negativo fibroblastos (BJ). 1 milhão pelotas de células foram lisadas em tampão NP-40, e as reações de extensão de telomerase foram realizadas em triplicatos biológicos. Um controle neg...

Discussão

A medida da atividade da telomerase é crítica a uma pletora de tópicos da pesquisa que incluem, mas não limitado a, cancro, biologia do telomere, envelhecimento, medicina regenerativa, e projeto estrutura-baseado da droga. Telomerase RNPs são de baixa abundância, mesmo em células cancerosas, fazendo a detecção e estudo desta enzima desafiador. Neste artigo, nós descrevemos os procedimentos passo a passo para o ensaio recentemente desenvolvido de ddTRAP para quantificar robustamente a atividade do telomerase nas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl pH 8.0	Ambion	AM9855G	RNAse/DNAse free
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G	RnAse/DNAse free
0.5 M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9261	RNAse/DNAse free
Surfact- Amps NP-40	Thermo Scientific	28324
100% Ultrapure Glycerol	Invitrogen	15514011	RNAse/DNAse free
phenylmethylsulfonyl fluoride	Thermo Scientific	36978	Powder
2-Mercaptoethanol	SIGMA-ALDRICH	516732
Nuclease Free H20	Ambion	AM9932	RNAse/DNAse free
2.5 mM dNTP mix	Thermo Scientific	R72501	2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP
2 M KCl	Ambion	AM9640G	RNAse/DNAse free
100% Tween-20	Fisher	9005-64-5
0.5 M EGTA pH 8.0	Fisher	50-255-956	RNAse/DNAse free
Telomerase Substrate (TS) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
ACX (Revers) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'
Thin walled (250 ul) PCR grade tubes	USA Scientific	1402-2900	strips, plates, tubes etc.
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio Rad	1864034
Twin-Tec 96 Well Plate	Fisher	Eppendorf 951020362
Piercable foil heat seal	Bio Rad	1814040
Droplet generator cartidges (DG8)	Bio Rad	1863008
Droplet generator oil	Bio Rad	1863005
Droplet generator gasket	Bio Rad	1863009
96-well Thermocycler T100	Bio Rad	1861096
PX1 PCR Plate Sealer	Bio Rad	1814000
QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software	Bio Rad	1864001 and 1864003
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004
Nuclease Free Filtered Pipette Tips	Thermo Scientific		10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul