물방울 디지털 트랩 (ddTRAP): Telomere 반복 증폭 프로토콜의 적응은 디지털 중 합 효소 연쇄 반응에 액 적

요약

저희는 액 적 디지털 중 합 효소 연쇄 반응에 사용 되는 표준 telomere 반복 증폭 프로토콜 (TRAP) 분석 법을 성공적으로 전환 했습니다. DdTRAP 이라고 불리는이 새로운 분석은 더 민감하고 정량적 이며, 다양 한 인간 세포 내에서의 텔로 활동에 대 한 더 나은 검출 및 통계적 분석을 가능 하 게 합니다.

초록

Telomere 반복 증폭 프로토콜 (TRAP)은 주어진 샘플 내에서 텔로 활성을 검출 하기 위해 가장 널리 사용 되는 분석 법입니다. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 방법은 대부분의 세포 용 해물에서 효소 활성을 강력 하 게 측정할 수 있습니다. 형광 표지 된 프라이 머를 사용한 겔 기반 트랩은 시료 처리량을 제한 하 고 시료의 차이를 검출 하는 능력은 효소 활성의 2 배 또는 그 이상의 변화에 제한 됩니다. 물방울 디지털 트랩 인 ddTRAP은 기존의 트랩 분석에서 수정 된 매우 민감한 접근 방식으로, 사용자가 96 샘플에 대 한 강력한 분석을 수행 하 고 DNA (텔로 확장 제품의 절대 정량화를 얻을 수 있게 합니다. ) 각 PCR 내 입력. 따라서 새로 개발 된 ddTRAP 분석은 기존의 겔 기반 트랩 분석의 한계를 극복 하 고 실험실 및 임상 설정 내에서 텔로 활동을 측정 하는 보다 효율적이 고 정확 하며 정량적 인 접근법을 제공 합니다.

서문

텔로 미 어는 선형 염색체의 말단에 있는 동적인 DNA 단백질 복합물입니다. 인간 말단 소 립은¹번에서 12hexameric kilobases 사이의 길이에 따라 달라 지는 5 '-TTAGGG_n 의 반복의 배열로 구성 된다. 말단 소 립을 유지 하는 ribonucleoprotein 효소 인 인간 텔로는, 헬 라 세포 용 해물 (암 세포 라인)에서 먼저 동정 되었다. 말단 소 립 및 텔로는 게놈 보호, 유전자 조절 및 암 세포 불멸^3,5,⁶과 같은 생물학적 과정의 스펙트럼에서 중요 한 역할을 한다.

인간의 텔로는 주로 두 가지 주요 구성 요소, 즉 텔로 역 역전사 및 텔로 RNA (각각 hTERT 및 hTERC)로 구성 됩니다. 상기 단백질 서브 유닛 hTERT는, 텔로 효소의 촉매 활성 역 역전사 성분 이다. RNA 템플릿 hTERC는 말단 소 립을 연장 및/또는 유지 하기 위해 템플릿과 텔로을 제공 한다. 대부분의 인체 체세포 조직에는 검출 가능한 텔로 활동이 없습니다. 텔로의 부족과 함께 dna의 지체 가닥의 끝을 확장 하는 DNA 중 합 효소의 무 능력은 세포 분열의 매 라운드 후에 말단 소 립의 점진적 단축으로 이끌어 냅니다. 이 현상은 세포가 복제 적인 노 쇠의 상태를 입력 하는 결정적으로 단축 된 길이에 도달할 때까지 대부분의 체세포에 있는 telomere 단축으로 이끌어 냅니다. 세포 분열의 최대 횟수는 그것의 telomere 길이에 의해 결정 되 고 지속적인 세포 분할에이 블록은 발암에 진행을 방지 하는 것으로 생각 된다⁷. 암 세포는 telomere 유도 된 복제 노 광을 극복 하 고 그들의 말단 소 립을 유지 하기 위해 텔로를 이용 하 여 증식을 계속할 수 있다. 암의 약 90%는 텔로를 활성화 하 고, 암 탐지와 처리 둘 다에 있는 텔로 활동을 비판적으로 중요 하 게 합니다.

1990 년대에 있는 함정 분석의 발달은 텔로 효소의 필요한 성분의 식별 뿐만 아니라 정상과 암 모두의 광범위 한 세포 및 조직에서 텔로의 측정에 중요 한 역할을 했습니다. 본래의 젤 기반 PCR 분석 법은 방사선 학적으로 표지 된 DNA 기질을 사용 하 여 텔로 활성을 검출 합니다. 2006에서, 분석은 형광 표지 된 기판^8,9를 사용 하 여 비 방사성 형태로 적응 되었다. 형광 표지 된 기질을 사용 하 여, 사용자는 정확한 여기 파장에 노출 하 여 젤에 밴드로 텔로 확장 제품을 시각화할 수 있었습니다. 트랩 분석의 민감도와 조 세포 용 해물에서 텔로 활성을 검출 하는 능력은이 분석을 텔로 활성 검출을 위해 가장 널리 사용 되는 방법으로 만들었다. 그러나, 함정 분석에는 한계가 있습니다. 이 분석은 젤 기반으로, 보통에서 고 처리량 연구에 필요한 복제를 수행 하는 것을 어렵게 만들고, 따라서 적절 한 통계 분석이 거의 이루어지지 않습니다. 더욱이, 겔 계 분석은 샘플 들 간의 텔로 활성에서의 두 배 차이 미만의 검출의 무 능력으로 인하여 신뢰성 있게 정량화 하기 어렵다. 이러한 두 가지 한계를 극복 하는 것은 환자 샘플 또는 약물 설계 연구에서 텔로 활성의 검출을 위한 임상 또는 산업 설정으로 이동 하는 트랩 등의 효소 활성 분석에 중요 하다.

디지털 PCR은 초기에 PCR의 지 수 및 아날로그 특성을 선형 및 디지털 분석 (¹⁰)으로 변환 하는 수단으로 1999에서 개발 되었다. 액 적 디지털 PCR (ddPCR)은 본래 디지털 PCR 방법론의 가장 최근의 혁신 이다. 액 적 디지털 PCR은 안정적이 고 균일 한 크기의 방울을 안정적으로 생성 하는 고급 미세 유체 및 수 중유 에멀젼 화학의 출현으로 탄생 했습니다. 겔 계 및 정량 PCR (qPCR)과는 달리, ddPCR은 투입 물질의 절대 정량화를 생성 한다. DdPCR의 핵심은 샘플을 방울로 분할 하 여 ~ 2만 개별 반응의 생성입니다. 종말 점 PCR 다음에, 액 적 독자는 각 물방울에 있는 형광의 존재 또는 부재를 계산 하 고, 크기 조정 하 고, 기록 하는 유 세포 미터와 같은 유행에 있는 각 방울을 검사 합니다 (즉, 각 물방울에 있는 PCR 앰 플 아이콘의 유무 또는 존재). 그런 다음 푸아송 분포를 사용 하 여 입력 분자는 총 물방울 수에 대 한 양의 물방울의 비율을 기준으로 추정 됩니다. 이 숫자는 각 PCR의 입력 분자 수의 추정치를 나타냅니다. 또한, ddPCR은 96-웰 플레이트에서 수행 되 고 분석 되어 사용자가 많은 샘플을 실행 하 고 적절 한 통계 분석을 위해 생물학적 및 기술적 복제를 수행할 수 있습니다. 이에 따라 ddPCR의 강력한 정량 및 적정 처리량 특성을 결합 하 여 Ddpcr 분석 (¹¹)을 개발 하였다. 이 분석은 사용자가 생물학적 샘플^11,12에서 절대 텔로 활성을 연구 하 고 견고 하 게 정량화 하도록 설계 되었습니다. DdTRAP의 민감도는 단일 셀 측정을 포함 하 여 제한적이 고 귀중 한 샘플 로부터 텔로 활성의 정량화를 가능 하 게 합니다. 또한, 사용자는 텔로 조작 및/또는 약물의 두 가지 변화 (~ 50% 차이) 미만의 절대적인 정량화를 통해 효과를 연구할 수 있습니다. DdTRAP은 현대 실험실 실험과 임상 설정의 디지털 및 높은 처리량 특성에 대 한 트랩 분석의 자연 스러운 진화입니다.

프로토콜

1. 버퍼 준비 및 저장

1. 1x 주식의 50 mL를 준비 rnase-무료 NP-40 용 해 완충 액 (10mm 트리 스-HCl [pH 8.0] 1 mm mgcl 2mm ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 1% 【 vol/vol 】 40, 진단을, 5mm×5mm β ・ 0.1 mm 4 ~ 10% 150 플 루 오 르 benzenesulfonyl 히드로 클로 라 이드 (AEBSF)). 이 버퍼는 향후 사용을 위해-20°c에서 저장 및 저장할 수 있습니다. 세포의 최적의 용 해를 얻기 위해 동결/동결 해제 주기를 피하십시오.
2. 10 배 스톡 50 mL를 준비 합니다 RNase-프리 트랩 확장 버퍼 (200 mM 트리 스-HCl [pH 8.0] 15mm MgCl₂, 630 밀리미터 KCl, 0.5% [vol/Vol] 트윈 20 및 10mm 에틸렌 글리콜 비스 (β 아미노 에틸 에테르) n, n, n ', 네 스 트 라 아세트산 (egta)). 이 완충 액은 1 mL의 알리 쿠 트에 들어 있으며 추후 사용을 위해-20°c에서 보관할 수 있습니다.

2. 세포 용 해

1. 세포의 제조
   1. NP-40 용 해 완충 액의 냉동 분 취를 해 동. 동결 된 후, 얼음에 용 해 완충 액을 놓습니다. NP-40 용 해 완충 액에 phenylmethylsulfonyl 불 화물 (PMSF 프로 테아 제 억제제)을 첨가 하 여 0.2 mM의 최종 농도에 도달 한다.
      참고: 이것은 세포를 일차 직전에 수행 해야 합니다.
   2. 수집 된 셀 펠 릿에서 여분의 액체를 제거 하 여 건조 세포 펠 렛을 확인 합니다. 셀 펠 릿은 갓 수집 했거나 이전에 냉동 (-80 ° c 또는 액체 N2에서 냉동 한경우)에는 이러한 솔루션이 다운스트림 절차를 방해할 수 있으므로 이전 원심 분리에서 남은 솔루션을 포함 하지 않아야 합니다.
   3. 양성 및 음성 대조로 사용 하기 위해 텔로 및 텔로 세포 주 (BJ 섬유 아 세포, IMR-90 또는 U2OS) 모두를 성장, 수집 및 동결 합니다. 분석을 수행할 때마다 새로운 제어 용 해물을 사용 하 여 검사 재현성을 보장 합니다.
      주: 텔로 세포의 큰 배양이 성장 하 고 동결 이전에 인용 되는 것은 세포 주의 장기 배양 중에 도입 될 수 있는 임의의 조직 배양 관련 아티팩트를 제거 하 여 재현 가능한 결과를 보장 하도록 하는 것이 좋다 음성 대조 군 샘플.
   4. 얼음에 셀 펠 릿을 놓습니다. 세포가 동결 된 경우, 얼음에 잠시 해 동 할 수 있습니다.
      참고: ddTRAP에 대 한 일반적인 셀 펠 릿 크기는 50만과 100만 셀 사이입니다. 더 작은 세포 펠 릿은 또한 필요 하다 면 사용 될 수 있지만, 세포 수는/이상적으로 알고 있어야 합니다. DdTRAP은 BCA 단백질 분석을 사용 하는 단백질 입력에 기초 하 여 수행 될 수도 있습니다 (일반적으로 입력은 1 µ g).
2. 세포의 lysing
   1. NP-40 용 해 완충 액에서 세포를 분해 한다. 25000 셀/µ L의 버퍼의 셀 동등성을 유지 합니다. 예를 들어 40 µ의 NP-40 용 해 완충 액에서 100만 세포를 함유 하는 펠 렛을 lyse. 세포를 열기 위해 분해 하기 위해 분해 물을 부드럽게 삐. 거품을 하지 않도록 하십시오.
   2. 세포가 얼음에 30 분간 분해 되도록 하십시오. 세포 파편의 다발이 형성 되는 것을 막기 위하여 용 해물에 부드럽게 소용돌이를 확인 하십시오. 이것은 10 분 마다 수행 될 수 있고 파쇄 물이 균질 화 된 혼합물을 유지 하는 것을 의미 한다.
   3. 세포 용 해물 (25000 세포/µ L) 1:20을 NP-40 용 해 완충 액에 희석 하 여 새로운 세포 동등성 1250 세포/µ L을 제조 하였다. 예를 들어, 세포 용 해물 5 µ L을 용 해 완충 액의 95 µ L에 희석 시킨다.

3. 텔로 확장 반응

1. 텔로 확장 반응 (반응 당)을 위한 마스터 믹스 (표 1)를 준비 한다.
   참고: 세포 용 해 동안 확장 반응 마스터 믹스를 준비 하 고 얼음에 저장 하는 것이 가장 좋습니다.
   1. 확장 마스터의 pipet 48 µ L은 각 PCR 튜브에 혼합 됩니다.
   2. 희석 된 (1250 세포/µ L) 파쇄 물의 2 µ L을 확장 반응에 첨가 한다. 총 볼륨은 이제 50 µ L 50 셀/µ L의 최종 셀 동등성을 가져야 합니다.
2. 텔로 확장 반응을 수행 한다 (표 2).
3. 텔로 연장 제품을 최대 3 ~ 5 일 동안 4°c에 보관 하십시오. 그러나 처음 24 시간 내에 확장 제품을 사용 하는 것이 최적 입니다.

4. 액 적 디지털 PCR 설정

1. DdTRAP (반응 당)에 대 한 마스터 믹스 (표 3)를 준비 합니다.
   참고: 시 약이 실 온에 있으면 그들 또는 마스터 믹스를 얼음 위에 두지 마십시오. 얼음에 믹스를 배치 하면 점도가 증가 하 고 불량 한 방울 형성으로 이어질 수 있습니다. DdPCR 수퍼 믹스의 DNA 중 합 효소는 뜨거운 시작 이며 실 온에서 안정적 이어야 합니다. 상기 ddPCR 슈퍼 믹스는-20°c에서 초기 해 동 후 4°c에서 보관할 수 있다.
   1. Pet 19.8의 ddPCR 마스터의 µ L을 각 PCR 튜브에 섞어 줍니다.
   2. 각 튜브에 확장 반응의 2.2 µ L을 추가 합니다. 총 볼륨이 이제 22 µ L이 되어야 한다는 점에 유의 하십시오.
      참고: ddTRAP에 필요한 총 샘플 양은 20 µ L (셀 동등성 100 셀)입니다. 추가 볼륨은 pipet 오류 또는 샘플 손실에 대 한 예방 조치입니다.
2. 액 적 생성 카트리지를 설치 합니다.
   참고: 카트리지에 레이블이 지정 된 세 개의 다른 웰 열이 포함 되어 있습니다.
   1. Μ 단계 4.1.2에 따라 제조 된 반응의 20 리터를 샘플 웰 (중 웰)을 카트리지에 로드 한다. 샘플을 파이 펫 팅 할 때 기포를 피하십시오.
      참고: 거품이 있는 경우 카트리지의 측면을 가볍게 눌러 이러한 거품이 용액의 상단에 오게 합니다.
   2. 부하 70 µ L 액 적 생성 오일의 오일에 잘 (왼쪽 잘).
      참고: 오염을 방지 하기 위해 별도의 파이 펫 세트와 ddPCR 액 적 생성 단계에 대 한 팁을 엄격 하 게 사용 하십시오. 카트리지를 로드 하는 순서가 중요 합니다. 오일이 무 겁 고 미세 유체 챔버를 채우고 불량 한 액 적 형성으로 이어질 수 있으므로 샘플은 오일을 로딩 하기 전에 로드 해야 합니다. 실행할 수 있는 최소 샘플 수는 8 개입니다. 카트리지의 모든 웰은 빈 우물이 방울 발생기에서 방울 발생의 정지로 이어질 것으로 샘플과 함께 로드 해야 합니다. 카트리지 내에서 8 개의 웰을 모두 로드 하는 데 적합 한 샘플을 사용할 수 없는 경우 µ의 ddTRAP 마스터 믹스 20 개 (단계 4.1)를 나머지 카트리지에 로드할 수 있습니다.
   3. 카트리지 끝까지 테더 링 하 여 가스 켓을 제자리에 고정 합니다.
      참고: 가스 켓의 부족 또는 부적절 한 배치는 발전기가 방울을 생성 하는 것을 방지 합니다.
   4. 적재 및 조립 된 카트리지를 액 적 발생기에 넣습니다.
      참고: 카트리지는 발전기의 자석으로 인식 되므로 카트리지가 올바르게 배치 될 때 사용자에 게 알립니다.
3. 액 적이 생성 되 고 사이클이 완료 되 면 카트리지를 꺼냅니다 (~ 60~90s).
   1. 카트리지에서 가스 켓을 부드럽게 제거 합니다. 새로 생성 된 물방울 (오른쪽)을 멀티 채널 파이 펫을 사용 하 여 96-well PCR 플레이트에 넣습니다.
      참고: 새로 생성 된 액 적 에멀젼의 대략적인 부피는 40-43 µ L 이어야 합니다.
   2. 모든 샘플이 PCR 단계 동안 증발을 방지 하기 위해 96-웰 플레이트에 로드 되 면 알루미늄 호 일 PCR 격판덮개 물개를 가진 격판덮개를 열 밀봉 하십시오.
4. 96-웰 플레이트를 써 모 사이 클론에 넣고 다음과 같은 PCR 반응을 수행 한다 (표 4).
   참고: 온도 단계 사이의 모든 램프 속도는 반응을 제대로가 열 하기 위해 2.5 ° c/s로 설정 해야 합니다.

5. 텔로 확장 제품의 검출

1. 액 적 리더기에 96-웰 플레이트를 적재 합니다.
   참고: A1 샘플이 홀더의 홀더와 일치 하도록 플레이트의 방향을 올바르게 지정 해야 합니다.
   1. 드롭릿 판독기와 관련 된 소프트웨어를 엽니다. 첫 번째 우물 A1 을 두 번 클릭 하 여 샘플/우물 편집기 화면을 엽니다.
   2. 실험 을 클릭 하 고 드롭다운 메뉴에서 ABS 를 선택 합니다.
      참고: 실험 은 사용 되는 분석 법의 유형을 정의 합니다 (즉, 절대 정량화 또는 유전자 카피 수 분석). ABS 는 절대 정량화를 의미 합니다.
   3. QX200 ddPCR Evagreen 수퍼 믹스 를 선택 하 여 판독기가 올바른 검색 방법을 사용 하도록 합니다. 우물 편집기 화면의 오른쪽 아래에 있는 적용 을 클릭 하 여 강조 표시 된 모든 우물에 사용자 정의 설정을 저장 합니다.
      참고: 수퍼 믹스 는 독자가 읽을 수 있는 PCR 혼합 및 검출 화학의 유형을 정의 합니다.
   4. 샘플을 정의 하기 위해 소프트웨어의 우물 편집기 화면에서 대상을 클릭 합니다.
   5. 대상 드롭다운 메뉴를 클릭 하 고 알 수없음, 참조또는 NTC (템플릿 없음 컨트롤) 중 하나를 선택 하 여 샘플 유형을 정의 합니다.
      참고: 알 수 없는 실험 샘플을 참조 하 는 것은 알려진 텔로 활성의 제어 샘플이 될 수 있으며, NTC 는 오염 측면에서 분석 유효성의 결정을 위한 중요 한 제어 및 배경 신호.
   6. 샘플 이름 섹션의 모든 샘플에 레이블을 지정 하 고 적용 을 클릭 하 여 강조 표시 된 우물이 적절 하 게 편집 되도록 합니다.
2. 판을 실행/읽기 위해 실행 을 클릭 합니다. 플레이트를 읽어야 하는 방향에 대해 컴퓨터에 알리는 메시지가 표시 되 면 실행 옵션 화면에서 열 또는 행 을 선택 합니다.

6. 데이터 분석

1. 개별 우물을 클릭 하 여 각 시료에 허용 되는 물방울 수를 결정 합니다. 개별 우물 또는 열/행 헤더를 두 번 클릭 하 여 샘플 데이터를 보고 분석 합니다.
   참고: 특정 샘플의 분석을 진행할지 여부에 대 한 가장 중요 한 기준은 "허용 된 물방울"의 수입니다. DdTRAP의 경우, 1만 이상의 허용 액 적이 있는 샘플은 추가 분석에 유효 합니다. .Csv 테이블, .jpg 이미지, 히스토그램 등을 비롯 한 다양 한 형식으로 사용자에 게 데이터를 제공할 수 있습니다. Ddpcr^11,13을 포함 하는 ddpcr 데이터의 심층 분석을 위한 많은 자원이 이용 가능 하다. 이러한 리소스는 임계값^11,13 을 선택 하는 것부터 거짓 긍정 및 네거티브¹³을 식별 하는 샘플을 선택 하는 ddtrap 데이터 분석 가이드를 제공 하며 일반 문제 해결¹³.
2. 샘플 복제 및 NTC 샘플을 나타내는 우물을 강조 표시 합니다. (2.1.2 단계에서 위에 나열 된 대로) BJ 세포와 같은 NTC 또는 네거티브 제어 라인과 비교 하 여 샘플을 분석 합니다.
   1. 화면 왼쪽 아래에 있는 임계값 설정 아이콘을 클릭 하 여 샘플에 대 한 임계값을 수동으로 설정 합니다. 각 개별 웰 또는 한 번에 여러 웰에 대 한 임계값을 설정 합니다 (권장).
      참고: NTC에서 배경이 감지 되 면 다른 모든 샘플에서이를 빼서 신호를 ' 정규화 ' 하 고 참 긍정 신호만 분석 하도록 할 수 있습니다. NTC 값은 일반적으로 NP-40 용 해 완충 시스템을 위한 0.2-1 분자/µ L 범위에 있습니다. 다른 버퍼 시스템 및 구성 요소 (예: CHAPS 버퍼)를 테스트 해야 합니다.

결과

DdTRAP을 사용 하 여, 텔로 활성은 다음 세포 주 들로 구성 된 세포 패널에서 측정 되었다 (그림 1). 비 소 세포 폐암 (H2882, H1299, Calu6, H920 및 A549), 소 세포 폐암 (H2887 및 H82) 및 SHP77-네거티브 섬유 아 세포 (BJ). 100만 세포 펠 렛은 NP-40 완충 액에서 분해 되었고, 텔로 확장 반응은 생물학적 3 중에서 수행 되었다. 일반적이 고 매우 권장 되는 네거티브 컨트롤?...

토론

텔로 활동의 측정은 암, telomere 생물학, 노화, 재생 의학 및 구조 기반 약물 설계를 포함 하 되이에 국한 되지 않는 과다 한 연구 주제에 매우 중요 합니다. 텔로 RNPs는 낮은 풍부, 조차 암 세포에서,이 효소의 탐지 그리고 연구 만들기 도전. 이 논문에서는 새로 개발 된 ddTRAP 분석에 대 한 단계별 절차를 설명 하 여 세포에서 텔로 활성을 견고 하 게 정량화 했습니다. 기존의 텔로 확장 반응과 ddPCR을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl pH 8.0	Ambion	AM9855G	RNAse/DNAse free
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G	RnAse/DNAse free
0.5 M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9261	RNAse/DNAse free
Surfact- Amps NP-40	Thermo Scientific	28324
100% Ultrapure Glycerol	Invitrogen	15514011	RNAse/DNAse free
phenylmethylsulfonyl fluoride	Thermo Scientific	36978	Powder
2-Mercaptoethanol	SIGMA-ALDRICH	516732
Nuclease Free H20	Ambion	AM9932	RNAse/DNAse free
2.5 mM dNTP mix	Thermo Scientific	R72501	2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP
2 M KCl	Ambion	AM9640G	RNAse/DNAse free
100% Tween-20	Fisher	9005-64-5
0.5 M EGTA pH 8.0	Fisher	50-255-956	RNAse/DNAse free
Telomerase Substrate (TS) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
ACX (Revers) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'
Thin walled (250 ul) PCR grade tubes	USA Scientific	1402-2900	strips, plates, tubes etc.
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio Rad	1864034
Twin-Tec 96 Well Plate	Fisher	Eppendorf 951020362
Piercable foil heat seal	Bio Rad	1814040
Droplet generator cartidges (DG8)	Bio Rad	1863008
Droplet generator oil	Bio Rad	1863005
Droplet generator gasket	Bio Rad	1863009
96-well Thermocycler T100	Bio Rad	1861096
PX1 PCR Plate Sealer	Bio Rad	1814000
QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software	Bio Rad	1864001 and 1864003
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004
Nuclease Free Filtered Pipette Tips	Thermo Scientific		10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul