Капли цифровая ловушка (ddTRAP): адаптация протокола усиления теломер повторить к капли цифровая полимеразной цепной реакции

Резюме

Мы успешно преобразовали стандартный протокол усиления теломер повторения (ловушки) анализ, чтобы быть использованы в капли цифровой полимеразной цепной реакции. Этот новый анализ, называемый ddTRAP, является более чувствительным и количественным, что позволяет более эффективного выявления и статистического анализа деятельности теломеразы в различных человеческих клетках.

Аннотация

Протокол усиления теломер повторяется (ловушка) является наиболее широко используемым анализа для обнаружения активности теломеразы в данном образце. Метод полимеразной цепной реакции (ЦР) позволяет для надежных измерений активности фермента от большинств литов клетки. Гель-ловушки на основе с флуоресцентно помечены праймерс границы выборки пропускной способностью, и способность обнаруживать различия в образцах ограничивается два раза или больше изменений в активности фермента. Капли цифровой ловушки, ddTRAP, является весьма чувствительным подходом, который был изменен из традиционного анализа ловушки, что позволяет пользователю выполнять надежный анализ на 96 образцов в перспективе и получить абсолютную количественную оценку ДНК (расширение продуктов теломеразы ) ввода в каждой СР. Таким образом, недавно разработанный анализ ddTRAP преодолевает ограничения традиционного гелевого анализа ловушки и обеспечивает более эффективный, точный и количественный подход к измерению активности теломеразы в лабораторных и клинических условиях.

Введение

Теломеры являются динамическими комплексами ДНК-протеина на концах линейных хромосом. Человеческие теломеры состоят из массива 5 '-TTAGGG_n гексафических повторов, которые различаются по длине между 12-15 килотбаз (КБ) при рождении¹. Человека теломеразы, рибонуклеопролиоподобный фермент, который поддерживает теломеры, был впервые выявлен в Лобе клеток литов (рак клеточной линии)². Теломеры и теломеразы играют важную роль в спектре биологических процессов, таких как защита генома, генная регуляция и бессмертие раковых клеток^3,4,5,6.

Теломераза человека состоит в основном из двух ключевых компонентов, а именно: теломеразы обратной транскриптазы и РНК теломеразы (hTERT и hTERT, соответственно). Протеиновый Субблок, hTERT, является катализатором активной обратной транскриптазы фермента теломеразы. Шаблон РНК, hTERC, обеспечивает теломеразу с шаблоном для расширения и/или поддержания теломер. Большинство человеческих соматических тканей не имеют обнаруживаемой активности теломеразы. Неспособность ДНК-полимеразы продлить конец отстающих нитей ДНК наряду с отсутствием теломеразы приводит к постепенному укорочению теломер после каждого раунда клеточного деления. Эти явления приводят к укорочению теломер в большинстве соматических клеток до тех пор, пока они не достигнут критической укороченной длины, при которой клетки попадают в состояние репликативного старения. Максимальное количество раз клетка может разделить диктуется его Длина теломер и этот блок для продолжения клеточного деления, как полагают, чтобы предотвратить прогрессирование онкогенеза⁷. Раковые клетки способны преодолевать индуцированный теломер-репликативное старение и продолжают размножаться, используя теломеразу для поддержания своих теломер. Примерно 90% раковых опухолей активизируют теломеразу, что делает деятельность теломеразы критически важной как в обнаружении, так и в лечении рака.

Разработка анализа ловушки в 1990-х сыграла важную роль в идентификации необходимых компонентов фермента теломеразы, а также для измерения теломеразы в широком диапазоне клеток и тканей, как нормальных, так и раковых. Оригинальный гель для анализа методом ЦР использовал радиоактивно обозначенные ДНК-субстраты для обнаружения активности теломеразы. В 2006 году анализ был адаптирован в нерадиоактивную форму с использованием флуоресцентно маркированных субстратов^8,9. С помощью флуоресцентно помечены субстраты, пользователи смогли визуализировать продукты расширения теломеразы как полосы на гель, подвергая его правильной длине волны возбуждения. Чувствительность анализа ловушки и его способность обнаруживать активность теломеразы в сырых литом клеток сделала этот анализ наиболее широко используемым методом для обнаружения активности теломеразы. Однако анализ ловушки имеет свои ограничения. Анализ геля основе, что затрудняет для выполнения необходимых реплицирует в умеренной до высокой пропускной способности исследований, и, таким образом, надлежащего статистического анализа редко достигается. Кроме того, гель на основе анализа трудно количественно достоверно из-за неспособности обнаруживать менее чем два различия в активности теломеразы между образцами. Преодоление этих двух ограничений имеет решающее значение для ферментативной деятельности анализов, таких как ловушка, чтобы перейти к клиническим или промышленных параметров для обнаружения активности теломеразы в образцах пациента или исследования разработки лекарственных препаратов.

Цифровая ЦР была первоначально разработана в 1999 в качестве средства для преобразования экспоненциальной и аналоговой природы ЦР в линейный и цифровой анализ¹⁰. Капли цифровой ЦР (ДСР) является самым последним нововведением оригинальной цифровой методологии ЦР. Капли цифровой ЦР произошло с появлением передовых микрофлюидиков и масло-в-воде, химии эмульсии надежно генерировать стабильные и одинаково размера капель. В отличие от геля на основе и даже количественные (КЦР), Дцр генерирует абсолютную количественную оценку материала ввода. Ключом к ddPCR является генерация ~ 20 000 индивидуальных реакций путем разбиения образцов на капли. После окончания точечср, капли читатель сканирует каждую каплю в потоке-cytometer-как мода, подсчет, калибровка, и запись наличия или отсутствия флуоресценции в каждой отдельной капли (например, отсутствие или наличие в каждой капли ЦР-амплитэты). Затем, используя распределение Пуассона, входные молекулы оцениваются на основе соотношения положительных капель к общему количеству капель. Это число представляет собой оценку количества входных молекул в каждой СР. Кроме того, ddPCR выполняется и анализируется на 96-хорошо пластины, которая позволяет пользователю запускать много образцов, а также выполнять биологические и технические реплицирует для надлежащего статистического анализа. В результате мы объединили мощную количественную и умеренно-пропускную природу Дцр с методом анализа ловушки для разработки анализа¹¹ddpcr. Этот анализ предназначен для пользователей, чтобы изучить и надежно количественно абсолютной активности теломеразы из биологических образцов^11,12. Чувствительность ddTRAP позволяет количественно определять активность теломеразы из ограниченных и драгоценных образцов, включая измерения одноклеточных измерений. Кроме того, пользователи могут также изучить влияние манипуляций теломеразы и/или лекарств с абсолютной количественной оценкой менее чем двукратности изменений (~ 50% различий). DdTRAP является естественной эволюции ловушки анализа в цифровой и более высокой пропускной характер современных лабораторных экспериментов и клинических условиях.

протокол

1. Подготовка и хранение буфера

1. Подготовка 50 мл 1x складе RNase-/Dnase-Free НП-40 лизиса буфер (10 mM рис-совместимого [pH 8,0], 1 мм MgCl₂, 1 мм этилендиаминетическая кислота (ЭДТА), 1% [том/том] нп-40, 10% [том/том] гвенол, 150 мм Н2, 5 мм б-меркаптоэтанол, и 0,1 мм 4- бензенесульфонил фторид гидрохлорид (AEBSF)). Этот буфер может быть цитируемый и хранится при-20 ° c для использования в будущем. Избегайте циклов замораживания/оттаивания для получения оптимального лизиза клеток.
2. Подготовьте 50 mL 10x запас RNase-/Dnase-Free буфер расширения ловушки (200 mM рис-совместимого [pH 8,0], 15 мм MgCl₂, 630 mm KCl, 0,5% (том/том] между 20 и 10 мм этиленгликоль-бис (b-аминоэтиловый эфир)-N, N, n, N'-тетраацететическая кислота (egta)). Этот буфер можно использовать в 1 мл и хранить при температуре-20 ° с для использования в будущем.

2. лизиса клеток

1. Подготовка клеток
   1. Оттепель замороженных Алиготе НП-40 лизиса буфера. После оттаивания поместите буфер лизиса на лед. Добавьте фторид фенилметилсульфонил (ингибитор протеазы) к буферу НП-40 лизиса для достижения окончательной концентрации 0,2 мм.
      Примечание: это должно быть сделано непосредственно перед lysing клетки.
   2. Удалите лишнюю жидкость из собранной клеточной гранулы для обеспечения сухой ячейки гранул. Обратите внимание, что клеточные гранулы, будь то свежеиспеченные или ранее замороженные (-80 ° c или вспышка замороженных в жидком N₂), не должны содержать каких-либо оставшихся решений от предыдущих центрифуг, как эти решения могут вмешиваться в нисходящих процедур.
   3. Расти, собирать, и заморозить как теломеразы-позитивные и Теломераза-отрицательных клеточных линий (БЖ фибробласты, ИСР-90 или U2OS) для того, чтобы использовать их в качестве положительных и отрицательных элементов управления. Каждый раз, когда проводится анализ, используйте новые ливы контроля для обеспечения воспроизводимости анализа.
      Примечание: он сообщил, что большая культура теломеразы-отрицательные клетки выращивают и алицитируются до замораживания, чтобы удалить любые ткани культуры, связанные с артефактами, которые могут быть введены в течение длительного культуры клеточных линий, чтобы помочь обеспечить воспроизводимые результаты отрицательный образец управления.
   4. Поместите клеточные гранулы на лед. Если клетки были заморожены, позволяют им оттепель кратко на льду.
      Примечание: типичные размеры гранул ячейки для ddTRAP находятся между 500 000 и 1 000 000 клеток. Меньшие гранулы ячейки также могут быть использованы при необходимости, но номер ячейки должен/идеально должен быть известен. DdTRAP также может быть выполнена на основе ввода белка с помощью анализа белка ДСС (ввод обычно составляет 1 мкг).
2. Лисинг клеток
   1. Lyse клетки в буфере НП-40 лизиса. Поддержание эквивалентности ячейки 25 000 ячеек/мкл буфера. Например, Lyse гранулы (содержащие 1 000 000 клеток) в 40 мкл НП-40 лизиса буфера. Аккуратно пипетки lyнасыщать вверх и вниз, чтобы сломать открыть клетки. Старайтесь избегать делать пузыри.
   2. Разрешить клеткам Лизе на льду в течение 30 мин. Убедитесь в том, чтобы мягко вихря lyнасыт, чтобы предотвратить кластеров клеточного мусора от формирования. Это может быть сделано каждые 10 минут и предназначен для держать lyнасытить однородности смеси.
   3. Разбавить клетку lyнасыт (25 000 клеток/мкл) 1:20 в НП-40 лизиса буфер, что делает новую ячейку эквивалентности 1 250 клетки/мкл. Например, разбавить 5 мкл ячейки lyнасыт в 95 мкл лизиса буфера.

3. реакция расширения теломеразы

1. Подготовьте Мастер-микс (Таблица 1) для реакции расширения теломеразы (за реакцию).
   Примечание: лучше всего подготовить сочетание мастер реакции расширения во время лизиса ячейки и хранить его на льду.
   1. Pipet 48 мкл расширения мастер смеси в каждой трубки ЦР.
   2. Добавить 2 мкл разбавленного (1 250 клеток/мкл) lyнасытить на реакцию расширения. Общий объем должен теперь быть 50 мкл с окончательной эквивалентностью ячейки 50 клеток/мкл.
2. Выполните реакцию расширения теломеразы (Таблица 2).
3. Храните продукты расширения теломеразы при температуре 4 ° с до 3 – 5 дней; Тем не менее, оптимально использовать продукты расширения в течение первых 24 ч.

4. капли цифровой установки ЦР

1. Подготовьте Мастер-микс (Таблица 3) для ddtrap (за реакцию).
   Примечание: после того, как реагенты находятся при комнатной температуре, не размещаем их или мастер смеси на льду. Размещение смеси на льду может увеличить вязкость и привести к формированию плохой капли. Полимераза ДНК в супермиксе Дцр является горячим стартом и должна быть стабильной при комнатной температуре. Супермикс Дцр может храниться при температуре 4 °C после начальной оттепели от-20 °C.
   1. Pipet 19,8 мкл от Дцр мастер смеси в каждой трубки ЦР.
   2. Добавьте 2,2 мкл реакции расширения на каждую трубку. Обратите внимание, что общий объем должен теперь быть 22 мкл.
      Примечание: общее количество образца, необходимого для ddTRAP, составляет 20 мкл (эквивалентность клеток 100 клеток). Дополнительный объем является предосторожностью для ошибки пипетки или потери образца.
2. Настройка картриджа для генерации капель.
   Примечание: картридж содержит три различных столбцов скважин, которые помечены.
   1. Нагрузка 20 мкл реакции подготовлена согласно шагу 4.1.2 в образец хорошо (средний колодец) в картридж. Избегайте пузырьков, когда пипетки образца.
      Примечание: если есть пузыри, аккуратно нажмите на стороне картриджа так, что эти пузырьки прийти к верхней части раствора.
   2. Нагрузка 70 мкл капли масла в нефтяной колодец (левый колодец).
      Примечание: для того, чтобы избежать заражения, строго используйте отдельный набор пипетки и подсказки для шагов поколения капель Дцр. Важен порядок погрузки картриджа. Образец должен быть загружен до погрузки нефти, как масло тяжелее и будет заполнить микрофлюидное камер и привести к плохой формации капли. Минимальное количество образцов, которые можно запускать, составляет восемь. Все скважины картриджа должны быть загружены с образцом, так как любой пустой колодец приведет к остановке генерации капли из генератора капель. Если отсутствуют достаточные выборки для загрузки всех восьми скважин в картриджах, 20 мкл мастер микса ddTRAP (шаг 4,1) может быть загружен в оставшиеся картриджи.
   3. Закрепите прокладку на месте, привязывая ее к концам картриджа.
      Примечание: отсутствие или неправильное размещение прокладки будет препятствовать генератору от генерации капель.
   4. Поместите загруженный и собранный картридж в генератор капель.
      Примечание: картридж признается магнитом в генераторе, который будет информировать пользователя, когда картридж помещается правильно.
3. Удалите картридж после того, как капли генерируются и цикл завершен (~ 60-90 с).
   1. Аккуратно снимите прокладку с картриджа. Pipet вновь порожденных капель (правильно хорошо), с помощью канальца, в 96-хорошо ЦР-пластины.
      Примечание: приблизительный объем для вновь сгенерированных капель эмульсии должен быть 40 – 43 мкл.
   2. Загерметизированная пластина с алюминиевой фольгой пластиной пластины ЦР после того, как все образцы загружаются в 96-хорошо пластины в целях предотвращения испарения во время действия ЦР.
4. Загрузите 96-ну пластины в Термоциклер и выполните следующую реакцию ЦР (Таблица 4).
   Примечание: все рампы ставки между температурой шаги должны быть установлены до 2,5 ° c/s для того, чтобы правильно нагревать реакций.

5. Обнаружение продуктов расширения теломеразы

1. Загрузите 96-ну пластины в капли читателя.
   Примечание: Убедитесь в том, чтобы ориентировать пластины надлежащим образом, чтобы А1 образец матчей с, что из держателя.
   1. Откройте програмное обеспечение связанное с читателем капли. Дважды щелкните первый хорошо a1 , чтобы открыть образец/хорошо редактор экрана.
   2. Нажмите эксперимент и выберите ABS из меню высадки.
      Примечание: эксперимент определяет тип анализа, который будет использоваться (то есть, абсолютная количественная оценка или генетический анализ числа). ABS стенды для абсолютной количественной оценки.
   3. Выберите QX200 SuperMix , чтобы убедиться, что правильный метод обнаружения используется читателем. Нажмите Применить в нижней правой части экрана хорошо редактор, чтобы сохранить пользователю определенные параметры для всех выделенных скважин.
      Примечание: SuperMix определяет тип химии и детектирования, которая будет считваться читателем.
   4. Нажмите на Цель в хорошо редактор экрана программного обеспечения для того, чтобы определить образец.
   5. Определите тип образца, щелкнув по целевому меню и выбрав либо неизвестный, либо референс, либо НПС (не-шаблон управления).
      Примечание: неизвестный будет ссылаться на экспериментальный образец, ссылка может быть контрольной выборки известной деятельности теломеразы, и НПС является критическим контролем для определения достоверности анализа с точки зрения загрязнения и фоновый сигнал.
   6. Этикетка все образцы в разделе Название образца и нажмите Применить для обеспечения подчеркнул скважин редактируются надлежащим образом.
2. Нажмите запустить для запуска/читать пластины. Выберите либо столбцы или строки в экране Параметры запуска , когда предложено сообщить машине о ориентации пластины должны быть прочитаны.

6. анализ данных

1. Определите количество принятых капель для каждого образца, нажав на отдельные скважины. Дважды щелкните отдельные скважины или заголовки столбцов/строки для просмотра и анализа данных выборки.
   Примечание: наиболее важными критериями того, следует ли продолжать анализ определенной выборки, является число "принятых капель". Для Ддлк-ловушки, образцы с 10 000 или более принятых капель действительны для дальнейшего анализа. Данные могут предоставляться пользователю во многих форматах, включая таблицу a. CV,. jpg изображения, гистограммы и т.д. Имеется много ресурсов для углубленного анализа данных ddpcr, включая ddpcr^11,13. Эти ресурсы предлагают руководство для анализа данных ddtrap, от выбора пороговых^{значений 11,13} для выбора образцов для дальнейшего^{анализа 11,13}, выявление ложных срабатываний и негативов¹³, и Общее устранение неполадок¹³.
2. Выделение скважин, представляющих образец реплицирует и образцы НПС. Проанализируйте образцы по сравнению с либо НПС или отрицательные контрольные линии, такие как ячейки БЖ (как указано выше в шаге 2.1.2).
   1. Вручную установите порог для образцов, нажав на иконку для установления пороговых значений в левом нижнем углу экрана. Установите пороги для каждого отдельного скважины или для нескольких скважин за раз (рекомендуется).
      Примечание: Если фон обнаружен в НПС, он может быть вычтена из всех других образцов, чтобы "нормализовать" сигнал и убедиться, что только истинный положительный сигнал анализируется. Значения НПС, как правило, находятся в диапазоне 0,2 – 1 мкл для буферной системы НП-40 лизиса. Необходимо будет протестировать другие буферные системы и компоненты (например, буферы гл).

Результаты

С помощью ddTRAP активность теломеразы измерялась в клеточной панели, состоящей из следующих клеточных линий (рис. 1): немелкоклеточный рак легкого (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 и H2887), мелкоклеточный рак легкого (H82 и SHP77), а Теломераза-отрицательный фибробласты (БЖ). 1 000...

Обсуждение

Измерение активности теломеразы имеет решающее значение для множества исследовательских тем, включая, но не ограничиваясь этим, рак, биологию теломер, старение, регенеративную медицину и структуру, основанную на разработке лекарственных препаратов. Теломеразы РНВ являются низким изо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl pH 8.0	Ambion	AM9855G	RNAse/DNAse free
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G	RnAse/DNAse free
0.5 M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9261	RNAse/DNAse free
Surfact- Amps NP-40	Thermo Scientific	28324
100% Ultrapure Glycerol	Invitrogen	15514011	RNAse/DNAse free
phenylmethylsulfonyl fluoride	Thermo Scientific	36978	Powder
2-Mercaptoethanol	SIGMA-ALDRICH	516732
Nuclease Free H20	Ambion	AM9932	RNAse/DNAse free
2.5 mM dNTP mix	Thermo Scientific	R72501	2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP
2 M KCl	Ambion	AM9640G	RNAse/DNAse free
100% Tween-20	Fisher	9005-64-5
0.5 M EGTA pH 8.0	Fisher	50-255-956	RNAse/DNAse free
Telomerase Substrate (TS) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
ACX (Revers) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'
Thin walled (250 ul) PCR grade tubes	USA Scientific	1402-2900	strips, plates, tubes etc.
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio Rad	1864034
Twin-Tec 96 Well Plate	Fisher	Eppendorf 951020362
Piercable foil heat seal	Bio Rad	1814040
Droplet generator cartidges (DG8)	Bio Rad	1863008
Droplet generator oil	Bio Rad	1863005
Droplet generator gasket	Bio Rad	1863009
96-well Thermocycler T100	Bio Rad	1861096
PX1 PCR Plate Sealer	Bio Rad	1814000
QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software	Bio Rad	1864001 and 1864003
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004
Nuclease Free Filtered Pipette Tips	Thermo Scientific		10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul