Tröpfchendigital TRAP (ddTRAP): Anpassung des Telomere Repeat Amplification Protocol an die Reaktion auf die digitale Polymerase Chain Reaction

Zusammenfassung

Wir haben erfolgreich den Standard-Telomere-Wiederholungsverstärkungsprotokoll (TRAP) umgebaut, der in Tröpfchenspolonen-Kettenreaktionen eingesetzt werden soll. Dieser neue Test, genannt ddTRAP, ist sensibler und quantitativer, was eine bessere Erkennung und statistische Analyse der Telomeraseaktivität in verschiedenen menschlichen Zellen ermöglicht.

Zusammenfassung

Das Telomere-Wiederholungsverstärkungsprotokoll (TRAP) ist der am weitesten verbreitete Test, um Telomeraseaktivität innerhalb einer bestimmten Probe zu erkennen. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Methode ermöglicht robuste Messungen der Enzymaktivität von den meisten Zelllysaten. Der gelbasierte TRAP mit fluoreszierend gekennzeichneten Primern begrenzt den Probendurchsatz, und die Fähigkeit, Unterschiede in Proben zu erkennen, ist auf zwei oder größere Veränderungen in der Enzymaktivität beschränkt. Der Tröpfchendigital TRAP, ddTRAP, ist ein hochsensibler Ansatz, der vom traditionellen TRAP-Test modifiziert wurde und es dem Anwender ermöglicht, eine robuste Analyse von 96 Proben pro Lauf durchzuführen und eine absolute Quantifizierung der DNA zu erhalten (Telomerase Extension Produkte). ) Eingaben in jeder PCR. Der neu entwickelte ddTRAP-Test überwindet daher die Grenzen des traditionellen gelbasierten TRAP-Tests und bietet einen effizienteren, präziseren und quantitativen Ansatz zur Messung der Telomerasaktivität im Labor und in klinischen Umgebungen.

Einleitung

Telomere sind dynamische DNA-Proteinkomplexe an den Enden linearer Chromosomen. Menschliche Telomere bestehen aus einem Array von 5 '-TTAGGG_n hexamerischen Wiederholungen, die bei der Geburt¹in der Länge zwischen 12 – 15 Kilobasen (kb) variieren. Das menschliche Telomerase, das Ribonucleoprotein-Enzym, das die Telomere unterhält, wurde erstmals in HeLa-Zell-Lysaten (Krebszelllinie) 2 identifiziert. Telomere und Telomerase spielen zusammen eine große Rolle in einem Spektrum biologischer Prozesse wie Genomschutz, Genregulation und Krebszellunsterblichkeit³,^{4, 5,6.}

Die menschliche Telomerase besteht in erster Linie aus zwei Schlüsselkomponenten, nämlich der Telomerase Reverse Transkriptase und der Telomerase RNA (hTERT bzw. hTERC). Die Proteinuntereinheit hTERT ist die katalytisch aktive Rückkehr-Transkriptase-Komponente des Telomerase-Enzyms. Die RNA-Vorlage, hTERC, stellt Telomerase mit der Vorlage zur Verfügung, um and/oder die Telomere zu erweitern oder zu pflegen. Die meisten menschlichen somatischen Gewebe haben keine nachweisbare Telomerase-Aktivität. Die Unfähigkeit der DNA-Polymerase, das Ende des hinterherhinkenden DNA-Strangs zu verlängern, zusammen mit dem Mangel an Telomerase führt zu einer fortschreitenden Verkürzung der Telomere nach jeder Runde der Zellteilung. Diese Phänomene führen in den meisten somatischen Zellen zu einer telomerierten Verkürzung, bis sie eine kritisch verkürzte Länge erreichen, wobei die Zellen in einen Zustand der replizierenden Seneszenz gelangen. Die maximale Anzahl der Teilung einer Zelle wird durch ihre Telomere-Länge diktiert, und dieser Block zur fortgesetzten Zellteilung wird angenommen, um die Progression zur Onkogenese zu verhindern 7. Krebszellen sind in der Lage, die durch Telom verursachte Replikationsseneszenz zu überwinden und sich weiter zu vermehren, indem sie Telomerase nutzen, um ihre Telomere zu erhalten. Etwa 90% der Krebserkrankungen aktivieren Telomerase, was die Telomerasaktivität sowohl bei der Krebsfrüherkennung als auch bei der Behandlung von entscheidender Bedeutung macht.

Die Entwicklung des TRAP-Test in den 1990er Jahren war maßgeblich an der Identifizierung der notwendigen Komponenten des Telomerase-Enzyms sowie an der Messung von Telomerase in einer Vielzahl von Zellen und Geweben, sowohl normal als auch krebserregend, beteiligt. Der originale gelbasierte PCR-Test verwendete radioaktiv beschriftete DNA-Substrate, um Telomeraseaktivität zu erkennen. Im Jahr 2006 wurde der Test in eine nicht radioaktive Form^mitfluoreszierenden Substraten 8,9^angepasst. Durch den Einsatz fluoreszierender Substrate konnten die Anwender die Telomerase-Erweiterungsprodukte als Bänder auf einem Gel visualisieren, indem sie es der richtigen Anregungswellenlänge aussetzten. Die Empfindlichkeit des TRAP-Tests und seine Fähigkeit, Telomerase-Aktivität in Rohzell-Lysaten zu erkennen, hat diesen Test zur am weitesten verbreiteten Methode zur Messung der Telomerasaktivität gemacht. Der TRAP-Test hat jedoch Grenzen. Der Test ist gelebasiert, so dass es schwierig ist, die notwendigen Replikate in moderaten bis hochdurchsatz-Studien durchzuführen, und so wird nur selten eine korrekte statistische Analyse durchgeführt. Darüber hinaus ist der gelenbasierte Test aufgrund der Unfähigkeit, weniger als zwei Unterschiede in der Telomerasetaktivität zwischen den Proben zu erkennen, nur schwer zuverlässig zu quantifizieren. Die Überwindung dieser beiden Einschränkungen ist für enzymatische Aktivitätsuntersuchungen wie den TRAP von entscheidender Bedeutung, um in klinische oder industrielle Umgebungen zur Erkennung von Telomeraseaktivität in Patientenproben oder Medikamentendesign-Studien zu gelangen.

Digital PCR wurde 1999 entwickelt, um die exponentielle und analoge Natur von PCR in einen linearen und digitalen Test¹⁰umzuwandeln. Tröpfchen Digital PCR (ddPCR) ist die neueste Innovation der ursprünglichen digitalen PCR-Methodik. Tröpfchendigital wurde mit dem Aufkommen von fortschrittlichen Mikrofluidik und Öl-in-Wasser-Emulsion-Chemie entwickelt, um stabile und gleich große Tröpfchen zuverlässig zu erzeugen. Im Gegensatz zu gelbasierter und sogar quantitativer PCR (qPCR) generiert ddPCR eine absolute Quantifizierung des Eingangsmaterials. Der Schlüssel zu ddPCR ist die Generierung von ~ 20.000 individuellen Reaktionen durch die Teilung von Proben in Tröpfchen. Nach dem Endpunkt PCR scannt der Tröpfchenleser jeden Tröpfchenstreuer auf eine Fließzytometer-ähnliche Art und Weise, indem er das Vorhandensein oder Fehlen von Fluoreszenz in jedem einzelnen Tröpfchen zählt, vergrößert und aufzeichnet (d.h. das Fehlen oder das Vorhandensein von PCR-Amplicons in jedem Tröpfchen). Mit Hilfe der Poisson-Verteilung werden die Eingangsmoleküle anhand des Verhältnisses der positiven Tröpfchen zur Gesamtzahl der Tröpfchen geschätzt. Diese Zahl stellt eine Schätzung der Anzahl der Eingangsmoleküle in jeder PCR dar. Darüber hinaus wird ddPCR auf einer 96-well-Platte durchgeführt und analysiert, die es dem Anwender ermöglicht, viele Proben zu führen, sowie biologische und technische Replikate für eine korrekte statistische Analyse durchzuführen. Als Ergebnis haben wir die leistungsstarke Quantifizierung und Moderate-Durchsatz-Natur von ddPCR mit dem TRAP-Test kombiniert, um den ddTRAP-Test 11 zu entwickeln. Dieser Test ist für Anwender gedacht, um die absolute Telomerasaktivität aus biologischen Proben 11^,12zu untersuchen und robust zu quantifizieren. Die Empfindlichkeit des ddTRAP ermöglicht die Quantifizierung der Telomerase-Aktivität aus begrenzten und wertvollen Proben, einschließlich Einzeller-Messungen. Darüber hinaus können die Konsumenten auch die Auswirkungen von Telomerase-Manipulationen und/oder Medikamenten mit absoluter Quantifizierung von weniger als zweifachen Änderungen (~ 50% Unterschiede) untersuchen. Der ddTRAP ist die natürliche Entwicklung des TRAP-Sassay in die digitale und überstrahlerische Natur moderner Laborversuche und klinischer Umgebungen.

Protokoll

1. Puffervorbereitung und-lagerung

1. Bereiten Sie 50 mL von 1x vorrätig RNase-/DNase-freien NP-40-Lysepuffer (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM MgCl 2, 1 mM Ethylenediaminetetraacetikinsäure (EDTA), 1% [vol/vol] NP-40,10% Glycerol, 150 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, und 0,1 mM 4- Benzesulfonyl Fluorid Hydrochlorid (AEBSF)). Dieser Puffer kann für die zukünftige Nutzung bei-20 ° C alitiert und gespeichert werden. Vermeiden Sie Gefrierpunkte, um eine optimale Lyse der Zellen zu erhalten.
2. Bereiten Sie 50 mL von 10x vorrätiger RNase-/DNase-freier TRAP-Erweiterungspuffer (200 mM Tris-HCl [pH 8.0] vor,15 mM MgCl 2,630 mM KCl, 0,5% [vol/vol] Tween 20, and 10 mM ethylene glycol-bis (β-aminoethyyl Äther)-N, N, N ', N '-tetraäzialsäure (EGTA)). Dieser Puffer kann in 1 mL aliquots alizitiert und bei-20 ° C für die zukünftige Verwendung gespeichert werden.

2. Zelllyse

1. Zubereitung der Zellen
   1. Tauen Sie einen gefrorenen Aliquot von NP-40-Lysepuffer. Nach dem Auftauen den Lysepuffer auf Eis legen. Phenylmethylsulfonyl-Fluorid (PMSF-Protease-Inhibitor) in den NP-40-Lysepuffer geben, um eine Endkonzentration von 0,2 mM zu erreichen.
      Achtung: Das sollte unmittelbar vor dem Lysen der Zellen geschehen.
   2. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus den gesammelten Zellpellets, um ein Trockenzellpellets zu gewährleisten. Beachten Sie, dass Zellpellets, ob frisch gesammelt oder zuvor eingefroren (-80 ° C oder Blitze, die in Flüssigkeit N₂eingefroren wurden), keine Restlösungen aus früheren Zentrifugationen enthalten dürfen, da diese Lösungen nachgelagerte Verfahren stören können.
   3. Wachsen, sammeln und frieren sowohl telomerase-positive als auch telomerase-negative Zelllinien (BJ-Fistenblätter, IMR-90 oder U2OS), um sie als positive und negative Steuerung zu nutzen. Verwenden Sie neue Steuerlysaten jedes Mal, wenn der Test durchgeführt wird, um die Reproduzierbarkeit des Tests zu gewährleisten.
      Hinweis: Es wird empfohlen, dass eine große Kultur von telomerase-negativen Zellen angebaut und vor dem Einfrieren alitiert wird, um alle Gewebekulturen zu entfernen, die während der langfristigen Kultur der Zelllinien eingeführt werden können, um reproduzierbare Ergebnisse der Die negative Kontrollprobe.
   4. Die Zellpellets auf Eis legen. Wenn die Zellen eingefroren waren, lassen Sie sie kurz auf Eis tauen.
      NOTE: Typische Zellpelletsgrößen für den ddTRAP liegen zwischen 500.000 und 1.000.000 Zellen. Kleinere Zellpellets können bei Bedarf auch verwendet werden, aber die Zellnummer must/sollte idealerweise bekannt sein. Der ddTRAP kann auch auf der Basis von Proteineintrag mit einem BCA-Protein-Test durchgeführt werden (Eingabe ist in der Regel 1 μg).
2. Lysing der Zellen
   1. Lyse die Zellen im NP-40-Lysepuffer. Halten Sie eine Zelläquivalenz von 25.000 Cells/μL Puffer. Zum Beispiel ein Pellet (mit 1.000.000 Zellen) in 40 μL NP-40-Lysepuffer. Das Lysat vorsichtig nach oben und unten pitieren, um die Zellen aufzubrechen. Versuchen Sie, Blasen zu vermeiden.
   2. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten auf Eis lysieren. Achten Sie darauf, das Lysat sanft zu vereisten, um zu verhindern, dass sich Zellschutt bildet. Dies kann alle 10 Minuten erfolgen und soll das Lysat eine homogenisierte Mischung erhalten.
   3. Das Zell-Lysat (25.000 Cells/μL) 1:20 im NP-40-Lysepuffer verdünnen, wodurch die neue Zelläquivalenz 1.250 Cells/μL entsteht. Zum Beispiel 5 μL Zelllysat in 95 μL Lysepuffer verdünnen.

3. Telomerase-Verlängerungsreaktion

1. Bereiten Sie einen Master-Mix (Tabelle1) für die Telomerase-Verlängerungsreaktion (pro Reaktion) vor.
   Hinweis: Es ist am besten, die Verlängerungsreaktion Master-Mix während der Zelllyse vorzubereiten und auf Eis zu speichern.
   1. Pipet 48 μL Verlängerungsmaster-Mix in jedes PCR-Rohr.
   2. Fügen Sie 2 μL des verdünnten (1.250 Cells/μL)-Lysaten zur Verlängerungsreaktion hinzu. Das Gesamtvolumen sollte nun 50 μL mit einer Endzelläquivalenz von 50 Cells/μL betragen.
2. Führen Sie die Telomerase-Verlängerungsreaktion aus (Tabelle 2).
3. Die Telomerase-Verlängerungsprodukte bei 4 ° C für bis zu 3 – 5 Tage lagern; Allerdings ist es optimal, die Verlängerungsprodukte innerhalb der ersten 24 Stunden zu verwenden.

4. Droplet-Digitale PCR-Setup

1. Bereiten Sie einen Master-Mix(Tabelle 3) für den ddTRAP (pro Reaktion) vor.
   Achtung: Sobald die Reagenzien bei Raumtemperatur sind, legen Sie sie nicht oder die Master-Mischung auf Eis. Das Anlegen der Mischung auf Eis kann die Viskosität erhöhen und zu einer schlechten Tröpfchenbildung führen. Die DNA-Polymerase im ddPCR-Supermix ist ein heißer Start und sollte bei Raumtemperatur stabil sein. Der DddPCR-Supermix kann nach einem anfänglichen Tauwetter von-20 ° C bei 4 ° C gelagert werden.
   1. Pipet 19,8 μL von ddPCR-Master-Mix in jedes PCR-Rohr.
   2. Fügen Sie 2,2 μL der Verlängerungsreaktion zu jedem Rohr hinzu. Beachten Sie, dass das Gesamtvolumen jetzt 22 μL betragen sollte.
      Hinweis: Die Gesamtmenge der Probe, die für einen ddTRAP benötigt wird, beträgt 20 μL (Zelläquivalenz von 100 Zellen). Die zusätzliche Lautstärke ist eine Vorsichtsmaßnahme für Pipett-Fehler oder Probenverlust.
2. Die Tropfengenerationen-Patrone aufstellen.
   Hinweis: Die Patrone enthält drei verschiedene Spalten von Brunnen, die beschriftet sind.
   1. Laden Sie 20 μL der Reaktion nach Schritt 4.1.2 in den Probenbrunnen (Mittelbrunnen) in der Patrone vorbereitet. Vermeiden Sie Blasen beim Pipettieren der Probe.
      Achtung: Wenn es Blasen gibt, tippen Sie sanft an die Seite der Patrone, so dass diese Blasen an die Spitze der Lösung kommen.
   2. 70 μL Tröpfchengenerationenöl in den Ölbrunnen laden (gut links).
      Hinweis: Um eine Kontamination zu vermeiden, verwenden Sie unbedingt einen separaten Satz Pipetten und Tipps für die DddPCR-Tröpfchengenerationsschritte. Wichtig ist die Reihenfolge der Beladung der Patrone. Die Probe muss vor der Ölverladung geladen werden, da das Öl schwerer ist und die mikrofluidischen Kammern füllt und zu einer schlechten Tröpfchenbildung führt. Die Mindestanzahl der Proben, die ausgeführt werden können, beträgt acht. Alle Brunnen der Patrone müssen mit der Probe beladen werden, da jeder leere Brunnen zu einem Stopp der Tröpfchenerzeugung aus dem Tröpfchengenerator führt. Wenn keine ausreichenden Proben zur Verfügung stehen, um alle acht Brunnen innerhalb einer Patrone zu laden, können 20 μL des ddTRAP-Mastermixes (Schritt 4.1) in die restlichen Patronen geladen werden.
   3. Sichern Sie die Dichtung an Ort und Stelle, indem Sie sie an die Enden der Patrone binden.
      Achtung: Durch die fehlende oder unsachgemäße Platzierung der Dichtung wird verhindert, dass der Generator Tröpfchen erzeugt.
   4. Die geladene und montierte Patrone in den Tröpfchengenerator legen.
      Hinweis: Die Patrone wird von einem Magneten im Generator erkannt, der den Benutzer informiert, wenn die Patrone richtig platziert ist.
3. Entfernen Sie die Patrone, sobald die Tröpfchen erzeugt sind und der Zyklus abgeschlossen ist (~ 60 – 90 s).
   1. Die Dichtung vorsichtig aus der Patrone nehmen. Die neu erzeugten Tröpfchen (rechts gut) mit einer Multichannel-Pipette in eine 96-well-PCR-Platte piptieren.
      Hinweis: Das ungefähre Volumen für die neu generierte Tröpfchenemulsion sollte 40 – 43 μL betragen.
   2. Die Wärmeschiegel mit Alufolie-PCR-Dichtungen, sobald alle Proben in der 96-well-Platte verladen sind, um eine Verdunstung während der PCR-Schritte zu verhindern.
4. Die 96-Brunnenplatte in den Thermocycler laden und die folgende PCR-Reaktion durchführen (Tabelle 4).
   Hinweis: Alle Rampenraten zwischen den Temperaturschritten müssen auf 2,5 ° C/eingestellt werden, um die Reaktionen richtig zu erwärmen.

5. Erkennung von Telomerase-Verlängerungsprodukten

1. Die 96-Brunnenplatte in den Tröpfchenleser laden.
   Hinweis: Achten Sie darauf, die Platte richtig zu orientieren, damit die A1-Probe mit der des Halters übereinstimmt.
   1. Öffnen Sie die Software, die mit dem Tröpfchenleser verbunden ist. Mit einem Doppelklick auf den ersten Brunnen A1 öffnet sich der Sample/well-Editor-Bildschirm.
   2. Klicken Sie auf Experiment und wählen Sie ABS aus dem Drop-Down-Menü.
      Hinweis: Experiment definiert die Art des zu verwendenden Tests (z.B. absolute Quantifizierung oder Gen-Copy-Nummerne-Test). ABS steht für absolute Quantifizierung.
   3. Wählen Sie QX200 ddPCR Evagreen Supermix aus , um sicherzustellen, dass die korrekte Erkennungsmethode vom Leser verwendet wird. Klicken Sie auf "Anlegen" in der unteren rechten Seite des Brunnenditeurs, um die benutzerdefinierten Einstellungen für alle hervorgehobenen Brunnen zu speichern.
      Hinweis: SUPERMIX definiert die Art der PCR-Mix-und Detektionschemie, die vom Leser gelesen wird.
   4. Klicken Sie auf TARGET im Brunnenzeiteoldschirm der Software, um die Probe zu definieren.
   5. Definieren Sie die TYPE des Musters , indem Sie auf das TARGET-Drop-Down-Menü klicken und entweder Unbekanntes, Referenzoder NTC (No-Take-Kontrolle) auswählen.
      NOTE: Unbekannte würden sich auf eine experimentelle Probe beziehen, Referenz könnte eine Kontrollprobe der bekannten Telomerase-Aktivität sein, und ein NTC ist eine kritische Kontrolle für die Bestimmung der Gültigkeit von Assay in Bezug auf die Kontamination und Hintergrundsignal.
   6. Beschriftet alle Samples im Abschnitt "Beispiel Name" und klicken Sie auf "Bewerben", um sicherzustellen, dass die hervorgehobenen Brunnen entsprechend bearbeitet werden.
2. Klicken Sie auf Run, um die Platte zu lesen. Wählen Sie entweder Spalten oder Rows im RUN OPTIONS-Bildschirm aus, wenn Sie aufgefordert werden, die Maschine über die Ausrichtung zu informieren, in der die Platte eingelesen werden soll.

6. Datenanalyse

1. Bestimmen Sie die Anzahl der akzeptierten Tröpfchen für jede Probe, indem Sie auf einzelne Brunnen klicken. Doppelklicken Sie auf die einzelnen Brunnen oder column/Zeilenheader, um die Beispieldaten anzuzeigen und zu analysieren.
   Hinweis: Die wichtigsten Kriterien für die Analyse einer bestimmten Probe ist die Anzahl der "akzeptierten Tröpfchen". Für den ddTRAP gelten Proben mit 10.000 oder mehr akzeptierten Tröpfchen für die weitere Analyse. Die Daten können dem Benutzer in vielen Formaten zur Verfügung gestellt werden, einschließlich einer .csv-Tabelle, .jpg Bilder, Histogramme, etc. Für die eingehende Analyse von ddPCR-Daten stehen viele Ressourcen zur Verfügung, darunter auch die ddTRAP^11,13. Diese Ressourcen bieten einen Leitfaden für die Analyse von ddTRAP-Daten, von derAuswahl der Schwellenwerte 11^,13 bis zurAuswahl von Proben für die weitere Analyse 11^{,13, Identifizierung}von falschen Positiven und Negativen¹³, und Allgemeine Fehlersuche¹³.
2. Markieren Sie die Brunnen, die Probenreplikate und NTC-Proben darstellen. Analysieren Sie die Proben im Vergleich zu NTC oder negativen Kontrollleitungen, wie BJ-Zellen (wie oben in Schritt 2.1.2 aufgeführt).
   1. Setzen Sie manuell die Schwelle für die Proben, indem Sie auf das Symbol klicken, um Schwellen unten links auf dem Bildschirm zu setzen. Sollwerte für jeden einzelnen Brunnen oder für mehrere Brunnen gleichzeitig (empfohlen).
      Hinweis: Wenn der Hintergrund im NTC erkannt wird, kann er von allen anderen Proben abgezogen werden, um das Signal zu "normalisieren" und sicherzustellen, dass nur das wirklich positive Signal analysiert wird. Die NTC-Werte befinden sich in der Regel im Bereich von 0,2 – 1 Molekül/μL für das NP-40-Lysepuffersystem. Andere Puffersysteme und Komponenten müssten getestet werden (zum Beispiel CHAPS-Puffer).

Ergebnisse

Mit dem ddTRAP, Die Telomerase-Aktivität wurde in einer Zelltafel gemessen, die aus folgenden Zelllinien besteht (Abbildung1): Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 und H2887), Klassenturfaltenkrebs (H82 und SHP77) und Telomerase-negativ Fibroblasten (BJ). Eine Million Zellpellets wurden im NP-40-Puffer lysisiert, und Telomerase-Verlängerungsreaktionen wurden in biologischen Triplikaten durchgeführt. Eine gängige und sehr empfoh...

Diskussion

Die Messung der Telomeraseaktivität ist für eine Vielzahl von Forschungsthemen von entscheidender Bedeutung, darunter Krebs, Telomerbiologie, Alterung, regenerative Medizin und strukturbasiertes Arzneimitteldesign. Telomerase RNPs sind sehr reichlich vorhanden, auch in Krebszellen, was die Erkennung und Untersuchung dieses Enzyms herausfordernd macht. In diesem Beitrag beschrieben wir die schrittweisen Verfahren für den neu entwickelten ddTRAP-Test, um die Telomerase-Aktivität in Zellen robust zu quantifizieren. Durc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl pH 8.0	Ambion	AM9855G	RNAse/DNAse free
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G	RnAse/DNAse free
0.5 M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9261	RNAse/DNAse free
Surfact- Amps NP-40	Thermo Scientific	28324
100% Ultrapure Glycerol	Invitrogen	15514011	RNAse/DNAse free
phenylmethylsulfonyl fluoride	Thermo Scientific	36978	Powder
2-Mercaptoethanol	SIGMA-ALDRICH	516732
Nuclease Free H20	Ambion	AM9932	RNAse/DNAse free
2.5 mM dNTP mix	Thermo Scientific	R72501	2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP
2 M KCl	Ambion	AM9640G	RNAse/DNAse free
100% Tween-20	Fisher	9005-64-5
0.5 M EGTA pH 8.0	Fisher	50-255-956	RNAse/DNAse free
Telomerase Substrate (TS) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
ACX (Revers) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'
Thin walled (250 ul) PCR grade tubes	USA Scientific	1402-2900	strips, plates, tubes etc.
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio Rad	1864034
Twin-Tec 96 Well Plate	Fisher	Eppendorf 951020362
Piercable foil heat seal	Bio Rad	1814040
Droplet generator cartidges (DG8)	Bio Rad	1863008
Droplet generator oil	Bio Rad	1863005
Droplet generator gasket	Bio Rad	1863009
96-well Thermocycler T100	Bio Rad	1861096
PX1 PCR Plate Sealer	Bio Rad	1814000
QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software	Bio Rad	1864001 and 1864003
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004
Nuclease Free Filtered Pipette Tips	Thermo Scientific		10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul