מודל ארנב של מחלה מימית לקויה עין יבש הנגרמת על ידי Concanavalin זריקה לתוך בלוטות לקטמאל: יישום ללימודי יעילות הסמים

Summary

מאמר זה מתאר את ההתפתחות של שיטה לגרום למחלת עיניים חריפה או כרונית בארנבים על ידי הזרקת concanavalin A לכל החלקים של מערכת בלוטת מסלולית לקטמאל. שיטה זו, מעולה לאלה שכבר דיווחו, יוצר מודל מותאם, יציב של עין יבשה מתאים לחקר של סוכני תרופתי.

Abstract

מחלות עיניים יבשות (DED), מחלה דלקתית רב עצרת של המשטח העינית, משפיע על 1 ב 6 בני אדם ברחבי העולם עם השלכות מדהימות על איכות החיים והבריאות עלויות. העדר מודלים אינפורמטיביים בעלי חיים כי לכידה התכונות העיקריות שלה מעכבת את החיפוש אחר סוכנים טיפוליים חדשים עבור DED. הדגמים הזמינים בעלי חיים בעלי מוגבלות ויעילות מוגבלת. מודל מוצג כאן שבו DED הוא המושרה על ידי הזרקת concanavalin מיכל A (קון A) לתוך הבלוטות מסלולית של ארנבים. היבטים חדשניים של מודל זה הם השימוש אולטרסאונד (ארה ב) הדרכה כדי להבטיח הזרקה אופטימלית ולהפוך של קון A לתוך בלוטת לקטמל הנחות; הזרקה של קון A לתוך כל בלוטות לקטמאל מסלולית המגביל את ייצור הפיצוי של דמעות; ושימוש בזריקות חוזרות תקופתיות של קון א ההאריך את מצב הפעולה של DED. מודגש והתגובה שלו לסוכני הבדיקה מנוטרים עם פאנל של פרמטרים העריכו את הייצור דמעה, את היציבות של הסרט דמעה, ואת מעמדם של הקרנית ואת רירית הלחמית. הם כוללים מאוסמלי דמעה, זמן הפסקה מדמיע, מבחן הדמעות של שיימר, מכתים בנגלי, ולקרוע רמות לקטופרין. האינדוקציה של DED וניטור הפרמטרים שלה מתוארים בפרוטרוט. מודל זה הוא פשוט, עמיד, להיות מ, ואינפורמטיבי. מודל זה בעלי חיים מתאים לחקר הפיזיולוגיה דמעה של הפתופסולוגיה של DED, כמו גם להערכת היעילות והבטיחות של סוכני המועמדים לטיפול ב-DED.

Introduction

מחלת עיניים יבשות (DED) היא מצב כרוני עם שכיחות גבוהה ותחלואה^1,2,3,4. דלקת ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה שלה^5,6. הפתופסולוגיה של DED הוא המשכן כנובע או תחת הייצור או מעל אידוי של דמעות; הראשון ידוע גם בשם מימית לקויה⁷. תסמונת sjגרייגרן, הגורם הנרחב לחקור באופן מקיף של DED, משפיע בעיקר על בלוטות lacrimal (LGs) והוא דוגמה מרשימה של החשיבות שלהם בפתוגנזה של DED. DED מטופלים לעתים קרובות עם דמעות מלאכותיות המספקות הקלה זמנית, או עם ציקלוספורן או lifitegrast, שניהם מדכאים את הדלקת העינית. אף אחד הטיפולים הזמינים עבור DED הם אופטימליים, המחייב פיתוח של סוכנים חדשים^8,9.

החיפוש אחר הסוכנים הטיפוליים החדשים ב-DED מושפע משלושה אתגרים עיקריים: חוסר היעד הdruggable מוכר, אשר עשוי להיות חמקמק בהינתן המורכבות הפתופסולוגית של DED; הצלעות של סוכנים מבטיחים; והעדר מודלים של בעלי חיים, אשר לכידה של תכונות מפתח של DED.

כמו ברוב המאמצים לפיתוח סמים, מודלים בעלי חיים אינפורמטיביים של DED הם כלי חקירה מכריע, על אף ההצהרה אקסיומתי כי לא מודל בעלי חיים לחלוטין לכידה של מחלה אנושית. עכבר, עכברוש, ומודלים ארנבת של DED הם הנפוצים ביותר בעוד כלבים ופרימטים משמשים לעתים רחוקות^10,11. רוב מודלים של יותר 12 הארנב המפורסם דיווחו על תאריך ניסיון להפחית את ייצור הדמעות על ידי הסרת lgs או על ידי הרחקת הפונקציה שלהם^{12,13,14,15,16}. גישות כאלה כוללות כריתה כירורגית של ILG; סגירת צינור הפרשות; והפגיעה בפונקציה LG על ידי הקרנה או הזרקה של אחד הבאים: לימפוציטים הופעל, mitogens, בוטולינום טוקסין, אטרופין, או benzalklonium. המגבלות המרכזיות של שיטות אלה הן חוסר העקביות שלהם ואת הדיכוי החלקי התדיר של ייצור הדמעה.

קונקאנאבאלין A (קון A), מקור הצמח, מהווה מערכות המשנה החזקות של תא T-cell, ושימש במודלים ניסיוניים של צהבת מדגם¹⁷ ו^-18מודגש. המודל המקורי של ה-Con הראשון נמסר להציע יתרונות משמעותיים, כולל הפשטות היחסית שלה; תא דלקתי זרם ב-LGs, מחקה מחלות כגון של סג'וגרן; גירוי של ציטוקינים proinflammatory IL-1β, IL-8, ו TGF-β1; מופחתת בתפקוד הדמעה על ידי מדידת הסיווג מדמיע fluorescein ולשבור את הזמן (TBUT); ותגובתיות התרופה המוצגת לסטרואידים אנטי דלקתיות.

כאשר מיושם שיטה מבטיחה זו, בנוסף ליתרונותיה, זוהו מגבלות המחייב את התיקון הכולל והשיפורים הדרסטיים שלה. שלושה חסרונות קריטיים של השיטה מתועדים. ראשית, המודל היה חד; ה-DED המושרה נרגע לאחר כשבוע אחד. שנית, תגובת החיות. לא הייתה עקבית כפי שמתואר, ב "עיוור" זריקות הטרנסעורית LG הנחות (ILG), קון A נמסר רק באופן אקראי בלוטת ממוקדות. מחקר מפורט של האנטומיה של ILG גילה כי הגודל שלה יכול להשתנות ככל האפשר 4-קיפול¹⁹ ביצוע זריקות כאלה "פגע או להחמיץ" מאמצים. לבסוף, גם כאשר ILG הוזרק, LG מעולה (SLG) מפוצה לעתים קרובות עבור זרימת דמעה מופחתת, מה שהופך את המודל בעייתי.

מגבלות מפתח אלה התגברו על ידי החדרת שלושה שינויים לשיטה, יצירת דגם בעל חיים מעולה של DED. ראשית, ההזרקה של קון A לתוך ILG בוצעה תחת אולטרסאונד (ארה ב) הדרכה, להבטיח כי קון A נכנס בלוטת. הצלחת הזריקה אושרה על ידי קבלת תמונה שלאחר הזרקה של ארה ב, כפי שמוצג באיור 1. שנית, כדי להסיר את תרומת הפיצוי לקרוע של SLG, הן palpebral ומסלולית חלקים של בלוטה זו הוזרקו עם קון A. לבסוף, זה מודל אקוטי של DED הוסב לאחד כרוני על ידי זריקות חוזרות של קון A כל 7-10 ימים. המשך של 2 חודשים מושגת בקלות בארנבים אלה. הצלחת גישה זו הייתה מתועדת באופן מאוד מוצלח ב^-19.

כפי שהוזכר כבר, יישום חשוב של מודלים בעלי חיים של DED הוא לקבוע את היעילות והבטיחות של סוכנים טיפוליים מועמד. השירות של מודל זה הוכח על ידי המחקר של פוספהוזולינדאק (oxt-328), מולקולה הרומן אנטי דלקתי קטן^{20, 21 מנוהל} כמו טיפות עיניים. יעילותה הוכח מבוסס על פאנל של פרמטרים DED¹⁹. הפשטות היחסית והאופי האינפורמטיבי של מודל זה מותרים גם זה לצד זה השוואה של פוספוסלינדאק לשני תרופות ה-FDA אישר עבור DED, cyclosporine ו lifitegrast, הדגמת עליונות חזקה קדם קלינית שלה.

Protocol

כל מחקרי בעלי חיים אושרו על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת אבן ברוק והופיעה בהתאם להצהרת ARVO לשימוש בעלי חיים במחקר אופטלמולוגי וחזון.

1. בעלי חיים ודיור

1. לרכוש ניו זילנד לבן (NZW) ארנבות שוקלת 2-3 ק ג.
2. בית הארנבים ביחידים בכלובים עם טמפרטורה קפדנית (65 ± 5 ° פ') ולחות (45 ± 5%) פקד. התאורה צריכה להיות. מחזור של 12 שעות
3. מספקים גישה בלתי מוגבלת למים ולאוכל הארנבים הסטנדרטיים. לחסל enrichments תזונתיים כפי שהם עשויים להכיל ויטמין A זה משפיע על העין.
4. Acclimate החיות לפחות 2 שבועות לפני אמצעי הבסיס או אינדוקציה של עין יבשה.

2. שיטות הרדמה והמתת חסד

הערה: כל ההליכים דורשים הרגעה קלה למעט הזרקת Con המחייב הרגעה מתונה.

1. עבור הרגעה קלה, הכנס איזופרומאזין (1 מ"ג/ק"ג) תת-עורי על הכתפיים באמצעות מחט 26-מד. נקודת קצה עבור הרגעה קלה: בעלי חיים לשמור על מעמד ראש נינוח עם אונות האוזן כבר לא לגמרי זקוף.
   הערה: אם לא מגיעים לנקודת הקצה המתאימה, ניתן להעניק הזרקה נוספת של איזופרומאזין. בעלי חיים צריכים תמיד להישאר ערים, מגיבים למגע של השפם שלהם, ולעולם לא מראים נשימה מאיטה.
2. להרדמה מתונה, הראשון לתת את החיות אספפרואזין כאמור. לאחר שנקודת הקצה מגיעה (ראה את ההערה לעיל), תן isofלאנה באמצעות מסיכת גז עם O₂ זרימה להגדיר ב 1 L/min ו isofלוריאן משלוח להגדיר 5% (איור 2).
3. עד שטונוס הגוף של הארנב רגוע לחלוטין והאוזניים הן לגמרי רפוי.
   הערה: אין לגרום לתנועות שרירים מפיצוי כאשר החיה מופעלת על צידו; נשימה תמיד. נשארת ספונטנית
4. התאוששות ספונטנית מתרחשת בתוך 2-5 דקות: הסימנים כוללים תנועות ראש ספונטנית ושרירי מוגברת או נורמלי טון. לאחר השלמת ההליך הנסיוני עם הרדמה מתונה, שימו לב לארנבים במשך כ -30 דקות או עד שההתנהגות שלהם תחזור לשגרה.
   הערה: משחה אופטלמולוגית אינה נדרשת במהלך אחת הצורות של הרגעה. 1) בהרדמה קלה, בעלי החיים עדיין ערניים ושומרים על רפלקס הבהוב. בהרדמה מתונה, עיכוב רפלקס המצמוץ קצר כל כך כי משטח העינית אינו בסיכון. 2) הצבת משחה אופטלמולוגית על פני העיניים מונע הדמיה של מבנים המוערך במהלך הבדיקה.
5. המתת חסד: השתמש במנת יתר של פנטוברביטל ורידי (100 מ"ג/ק"ג).

3. הסרת קרום ניקגטינג

1. בצע את ההסרה במהלך תקופת הסתגלות (בדרך כלל השבוע הראשון) כדי לאפשר הערכה מלאה ומדויקת של הקרנית.
2. הזרקה לממברנה הניגסת הימנית
   הערה: אם הממברנה הניגפת של שתי העיניים מוסרת, הדבר הפשוט ביותר הוא לעשות זאת בפגישה אחת. התחל בעין אחת והמשך כמתואר. לבהירות התיאור, שיטה זו מתחילה בעין הימנית.
   1. מניחים את הארנב בשקית מרסנת בגודל כראוי.
   2. לגרום להרדמה קלה כפי שמתואר בשלב 2.1.
   3. החל 25 μL של לידוקאין ללא שימור לעין ימין באמצעות מיקרופיפטה.
   4. מניחים מכסה תיל גמיש ספקולום בין העפעפיים.
   5. שימוש 0.3 מלקחיים (או שווה ערך), לתפוס את הקרום nictitating על הקודקוד שלה ולהאריך אותו על הקרנית.
   6. הכנס את הלידוקאין 1% עם 1:100,000 אפינפרין בתוך הבסיס של הממברנה הניגלית באמצעות מחט חדה בקוטר 26 (איור 3א). Bleb מתון צריך ליצור על הקרום הניגסת.
   7. הסר את הספקולום.
3. בצעו זריקה זהה לקרום הניקגסת השמאלי.
4. חיתוך הקרום הניקגכי
   1. לאחר כ 5 דקות, המקום ספקולום מכסה בעין ימין. לתפוס ולמשוך את קרום nictitating על הפיסגה שלה באמצעות 0.3 מלקחיים (או דומה).
   2. חותכים את הקרום הניקגסת בבסיסו באמצעות מספריים ווסטקוט או שווה ערך (איור 3B).
      הערה: דימום הוא מינימלי ואינו דורש בדרך כלל קאטרי. אף על פי כן, הסוללה בטמפרטורות גבוהות הוא תמיד נשמר בקרבת מקום במקרה הקפאה נוספת נדרשת.
   3. הסר את הספקולום.
   4. המקום משחה אנטיביוטית אקטואלי על העין (למשל, neomycin, polymyxin, bacitracin, ו הידרוקורטיזון).
5. . השאר את בלוטת הרדאן ללא פגע בלוטת הרדאנית נראית לפעמים כאשר הקרום הניקפת משתכן.
   הערה: אם המסה הלבנה גדול או העלאת רקמות הוא נראה באזור האף או העליון מעולה לאחר להסיר את הקרום הניקפת, הקרום היה מחדש קרוב מדי לבסיס שלה המאפשר את בלוטת הרדאנית לצניחה ספונטנית. כדי למנוע את זה בהליכים הבאים, להשאיר יותר של קרום ניקגטינג בבסיס.
6. לאפשר את המשטח העינית לרפא למשך שבוע לפחות 1 לפני מניפולציות נוספות נעשים או העינית משטח מראה מבוצעים.

4. מדידת פרמטרים של עיניים יבשות ואיסוף דגימות דמעה

הערה: למדוד פרמטרים מודגשים בהתבסס על צורכי פרוטוקול הלמידה (לדוגמה, בנקודות בסיסית ובזמן שצוין לאחר מכן). יש לבצע מדידות עבור DED בסדר הבא, עם מאמץ קפדני כדי לשכפל אותם בנאמנות בכל פעם. לבחון את כל החיות בערך באותו הזמן של היום (± 1 h) כדי למזער וריאציות מעגליות. מדידות אלה דורשות בדרך כלל צוות של שני חוקרים.

1. . שים את הארנב בשקית הרחקה לגרום להרדמה קלה.
2. לקרוע את האוסמולזה²²
   1. באופן ידני למצמץ העפעפיים 5-10 פעמים כדי להפיץ בצורה שווה את שכבת הדמעה על פני השטח העינית.
   2. . משכי בעדינות את המכסה התחתון
   3. דמעות לדוגמה עם Osmometer המעבדה בצומת של הpalpebral ובולבר לחמית לאורך הנמוך ביותר, רק אחורי בסיס של קרום ניקטיטינג נחתך.
   4. מדידת האוסמדות בעזרת מבחן העבסמלדוק בעקבות הוראות היצרן.
3. פרק זמן הפסקת הקריעה (tbut)
   1. הכהיה את החדר לצורך שיטת הפעולה.
   2. מניחים מכסה תיל המכסה בין העפעפיים.
   3. החלת טיפה 50 μL של 0.2% x fluorescein מעל פני הקרנית באמצעות מיקרופיפטה. אם אפילו התפלגות של fluorescein מעל הקרנית לא מתקבל עם הטיפה הראשונה, המקום טיפה שנייה.
   4. מייד להתחיל טיימר.
   5. צפו בסרט הדמעות שלפני הקרנית. מתחת לאור כחול TBUT מוגדר כזמן שנלקח לפתח נקודות שחורות, קווים או הפרעה ברורה של הסרט fluorescein (איור 4). במידת הצורך, השתמש בלופסי כירורגי המספקים + 1.50 הגדלה כדי להמחיש טוב יותר סימנים מוקדמים של ברייק-up. צג עד 1 דקות; אם הפסקה כהגדרתה כאן מתרחשת לאחר 1 דקות, הקלט TBUT עבור 60 s בלבד.
4. מבחן הדמעה של שיימר (stt)
   1. החלת טיפה של 25 μL של לידוקאין ללא משמר למשטח העינית.
   2. מניחים תא וו כירורגי לתוך הנחותים. כדי לקלוט לידוקאין שיורית וכל נוזל דמעה במקרה הצורך, השתמשו בעפעף התחתון כדי לכסות את הקצה הקטן ביותר של הספוג כדי לסייע לשמור אותו במקומו (איור 5א).
   3. לאחר כ -30 ס מ, הסר את הספוג של Weck.
   4. מיד הכנס את רצועת מבחן הדמעה של שיימר לחלל שבין הקרנית לבין הpalpebral מית בנקודה האמצעית של המכסה התחתון.
   5. להתחיל מיד טיימר (איור 5ב).
   6. לאחר 5 דקות, למדוד את אורך החלק ההרטיב של הרצועה; זהו ערך ה-STT.
   7. בצע מדדים בטרילקאט ודווח על הממוצע של 3 הקריאות כערך STT.
5. אוסף דגימות דמעה
   1. כדי לאסוף דגימות דמעה עבור הרמות של מנתחי שונים של אנליטים השונים כגון lactoferrin, לאחר הערך STT נרשם ב 5 דקות, לעזוב את הרצועה במקום עד הרטבה של לפחות 20 מ"מ מתקבל.
      הערה: אם הרטבה הולמת לא מתרחשת לאחר DED כבר המושרה, לקדם את רצועת עמוק יותר לתוך החוצה כדי לעזור להגיע לנקודת הקצה הזה בזמן סביר.
   2. חותכים את רצועת הלחלח ומניחים מיד לתוך 490 μL של מאגר אוסף מקורר (4% BSA, 1M הנאל, 0.1% יצירת רצף-20 ב-PBS עם קוקטייל מעכבי פרוטטינואז).
   3. שמרו את הדגימות על הקרח עד שניתן יהיה לאחסנו ב-80 ° c, שם הם צריכים להישאר עד הבוקר.
6. ורדים בנגלי מכתים (RBS)
   1. החל 50 μL של 1% לידוקאין ללא משמר לקרנית באמצעות מיקרו פיפטה.
   2. לאחר 30 s, מקום 25 μL של 1% רוז בנגל על פני השטח העינית ולמצמץ ידנית את העפעף כדי להפיץ אותו באופן שווה.
   3. מייד להתחיל טיימר.
   4. בשעה 3.5 דקות, מניחים מכסה תיל במכסה בין העפעפיים.
   5. בשעה 4.0 דקות, לצלם את משטח הקרנית העליון והמצמוץ (איור 6).
      הערה: התאם לסוג המצלמה שבשימוש. הגדרות אופייניות: מצלמת רפלקס דיגיטלית בודדת עדשה, מצב עדיפות צמצם (צמצם 13 או יותר), ISO 6000, 100 mm עדשת המאקרו מצורף שני 12.5 הארכה מספר צינורות, מצב מיקוד ידני, עדשה בהגדלה מקסימלית, תאורה מאקרו/טבעת פלאש להגדיר אוטומטית עם דרך-the-עדשה מצב. מנורת המיקוד של הטבעת מופעלת כדי לסייע להתמקד בקרנית.
   6. השלם את כל התמונות עבור שתי העיניים בתוך 1 דקות.
7. ציון משטח בעינית להכתים באמצעות שיטת ניי²³ שונה כדלקמן. דון לא ציון 6 אזורי לחאלה נפרדים. ציון לחמית מעולה של כל עין. זהו החלק של משטח לחאך בקלות צולם מבלי לתמרן את הגלובוס. מניפולציה יכולה לשנות במעשה את ההכתמים של המשטח העינית.
8. לקרוע רמות לקטופרין הם אמצעי מחליף של הפקת דמעה מן הבלוטות לקונות. שיטת הקרע הליטופרין בדמעות שנאסף לעיל על ידי שימוש במערכת החיסונית מקושרת אנזים²⁴ kit לאחר הוראות היצרן.

5. אינדוקציה וטיפול בעין יבשה

הערה: שלושה חלקים של מערכת הבלוטה מסלולית לקטמאל מוזרק.

1. הרגעה לארנבים עם אספפרואזין 0.2 מ"ג/ק"ג תת-עורי.
2. להטות את הפרווה באזור הפריביטל והקרקפת ולהסיר לחלוטין פרווה שיורית באמצעות נייר השמש. השאר את העור לגמרי חלק להדמיה טובה יותר של הסימנים האנטומיים והזרקה מודרכת מארה ב (איור 7).
3. לגרום להרדמה מתונה כפי שמתואר לעיל.
4. הזרקה של החלק הpalpebral של בלוטת מעולה לקטמל (PSLG)
   הערה: בצע הזרקה של PSLG תחילה.
   1. החל על העין המתאימה 25 μL של לידוקאין ללא משמר 1% עם מיקרופיפטה.
   2. אוורט העפעף העליון ולהחיל לחץ המדיאלי עדין על הרים מסלולית האחורי עד לציון החלק הpalpebral של בלוטת נראה. PSLG מופיע כגובה בולבוסי קטן בחלק האחורי (הזמני) של המכסה העליון.
      הערה: כדי להציג את רקמת בלוטת במהלך תהליך הלמידה, להחיל 5% fluorescein לאזור (איור 8א). דמעות ניתן לראות הזרמת PSLG בולבוסי. יישום של fluorescein אינו נדרש עבור המינהל של קון A; זה נעשה רק למטרות המחשה להראות את רקמת בלוטת.
   3. בעזרת מלקחיים בעלי שיניים משובחות ומחט של 27 מנות על מזרק טוברקולין, החודר ישירות לבלוטה באמצעות גישה ללחפון. מראש את המחט 2 מ"מ לתוך הרקמה ולהזריק 500 μg של קון A בכרך של 0.1 mL (איור 8ב).
      הערה: הזרקה זו יכולה לפעמים להיות כואבת. במקרה הצורך, שמרו על בעלי החיים מתחת לגיל ה, עד שהזריקה תושלם.
5. הזרקה של בלוטת המסלול העליון (oslg)
   הערה: OSLG בעקבות רצף מהיר.
   1. להחיל את הלחץ המדיאלי על הגלובוס גורם OSLG לבלוט מincisure האחורי (ראה ref²⁵ עבור אנטומיה, במידת הצורך). להחיל את הלחץ המדיאלי על הגלובוס (איור 9, החץ האדום) עם איזשהו של oslg מן incisure האחורי. הפרוטוברנס משמשת לוקליזציה ברוטו למציאת הincisure האחוריים.
   2. השתמש מלקחיים מעוקל עם טיפים סגורים כדי להסיט את האזור עד הפתח הגרמי בגולגולת הוא הרגיש. זה יהיה כמו לחתוך עם כיוון קדמי/אחורי תחת הרוויה.
   3. החל לחץ צנוע עם מלקחיים כדי להשאיר כניסת העור, אשר תשמש כנקודת הציון עבור מיקום המחט (איור 10א).
   4. הכנס מחט (מזרק טוברקולין עם המחט 27, 5/8 אינץ ') בניצב על העור מעל סימן הכניסה (איור 10B) ~ 1/4 אינץ לתוך incisure, ולאחר מכן לנתב את המחט באופן חיצוני לכיוון canthus לרוחב מכוון נקודת האמצע בין הזרקת האתר הגרמי מסלולית.
      הערה: אם הincisure לא ממוקדת בדיוק עם המחט, הגולגולת חוסמת את התקדמותו.
   5. לאחר hub של המחט הוא הגיע, לאט להזריק 1000 μg של קון A בנפח של 0.2 mL (איור 10ג).
6. להשלים את ההזרקה של שני PSLG ו OSLG בתוך 2-3 דקות.
7. הסר את בעל החיים מהרדמה מרבית (אם לא נעשה עדיין). הזרקה של בלוטת לקטמאל הנחות (ILG) בדרך כלל ניתן להשלים ללא הרגעה נוספת.
8. הזרקת הבלוטה הנחותה
   1. . הראה את בעל החיים מהצד הגדולה של ILG ניתן לראות לאורך החלק הקדמי התחתון של המסלול (איור 11א).
   2. צייר קו אנכי באמצעות עט סימון כירורגי או סמן קבוע מתאים על העור שבו החלק השטייתי של בלוטת ilg מעברים מ שטחי שלה (חיצוני יותר) מנוחה מקום על העצם לחי למיקום המדילי שלה במסלול. זה בדרך כלל נחות על לימבוס הקדמי (איור 11א).
   3. לזהות את הסוף של עצם הזיגומה על ידי ניקוי הבדיקה האנכית של ארה ב על קו זה על העור. מעבר ilg מתרחש כאשר התמונה של הבלוטה משתנה באופן ברור מובהק (קו hyperecho ic של עצם הזיגומית נתפסת לאורך הקצה התחתון של הבלוטה בתמונה) לאחד ללא גבול המדיאלי מוכר (הד עצם לחי כבר לא נוכח, איור 1).
   4. שימו לב למיקום היחסי של החלק הידני לשורה שצוירה על העור כאשר המסך האמריקאי מראה את השינוי. זהו "אתר ההזרקה" שבו יש להעניק קון A.
   5. לשלוט על עומק ההזרקה כדי למקם Con A לתוך בלוטת בנקודה רק האמצעי לעצם הקשת הזיגובטית.
   6. לקבוע את עומק ההזרקה כדלקמן: להגדיר את העומק הרצוי של הזרקה כעומק של עצם הזיגומית (אות היפראקו) ועוד 1 מ"מ. הפחת ערך זה מהאורך הידוע של המחט (15 מ"מ בדוגמה זו).
   7. הכנס את המחט לתוך הבלוטה באתר "הזרקה" ~ 12 מ"מ, ואז לאט לסגת אותו עד לאורך של המחט החשופה מחוץ לגוף (נמדד עם מחוגות כירורגי) שווה להבדל מחושב 5.8.6 (איור 12). הכנס 1000 μg של קון A ב 0.2 mL.
      הערה: כדי להבטיח כי הקפסולה של בלוטת הוא נדקר ולא רק דחף על ידי המחט, המחט יש להוסיף ~ 12 מ"מ או כמעט לרכזת לפני הנסיגה שלה מתחיל.
   8. חזור על ארה ב כדי לאשר את הצלחת הזריקה. ILG צריך להראות חלל היפואקו אופייני (איור 1).
      הערה: הזרקת ILG הוא אחד הנסבל הטוב ביותר על ידי בעלי חיים²⁶ והוא, לכן, נעשה אחרון.
9. להשלים את ההליך כולו כדי להזריק את כל הבלוטות של שתי העיניים בתוך 10 דקות. הדבר ידרוש השגת יכולות בהליך.
   הערה: ערכה אחת של זריקות לתוך 2 בלוטות האורביטל מסלולית יגרום מתמשך לאורך 1-2 שבועות.
10. עבור DED של משך זמן ארוך יותר, הכנס קון A בדיוק כמו מעל כל 7 ימים. עד 6 זריקות כאלה בוצעו בהצלחה.

6. טיפול שלאחר ההליך

1. בעקבות הזרקה של קון A, לפקח על בעלי החיים בשקיות הרסן שלהם לפחות 10-20 דקות, או עד שאפקט ההרדמה בלוי.
2. אין להשאיר את החיות ללא השגחה עד שיהיו מודעות מספיקות כדי לשמור על שכיבה משנית. אל תחזיר אותם הכלובים הבודדים שלהם עד שהם התאושש לחלוטין.
3. לאחר נוהל כאב הוא בדרך כלל מתון ונמשך פחות מ 48 h. להעריך את הכאב בקנה מידה של ארנב מימן. אם יש צורך, לתת מנה אחת של הקטורולאק תת עורית (5 מ"ג/ק"ג). לקבלת כאבים חמורים יותר, לתת בופריפין תת עורית 0.1 מ"ג/ק"ג כל 8 h.

תוצאות

Con הזריקות המושרה תגובה דלקתית חזקה בלוטות הלקמל המאופיינת לימפוציטית צפופה חדירה (איור 13), מלווה בייצור דמעה ירד. כל פרמטרי הדמעה שונו במידה ניכרת (טבלה 1 ושולחן 2). בנוסף, רמות לקטופרין שדוכאו (שליטה = 3.1 ± 0.45 vs. Con A מוזרק = 2.7 ± 0.02 ng/mg חלבון (כלומר ± SEM); p < 0.03). התוצאה הסופית היתה הקרנית בסיכון האפיתל ואת הלחמית, המעידים על ידי מוגברת רוז בנגלי מכתים (איור 6).

הזרקה של שלושת הרקמות המסלולית LG הפיק מדינה עקבית ואחידה בניגוד למדינות שהושגו על ידי שיטות קודמות^18,27. התורמים המרכזיים לתוצאה זו היו הזרקה של ה-ILG וההזרקה של OSLG. טבלה 1 מסכמת את התוצאות הבולטות של שיטה זו. כל השינויים תואמים ל-DED בצורה חמורה.

קבוצה אחת של הזרקות Con A מייצרת DED מתמשך כשבוע 1; כל הפרמטרים הקליניים לנרמל לפי יום 10 (טבלה 2). שבוע סדרתי הזרקת כשבוע בנפרד הרחבת המשך של DED בהתאם. לדוגמה, הסט השני של הזריקות Con A ביום 7 מתחזק במשך שבועיים וכדומה. לאחר כ 5 סטים של זריקות, המדינה DED לעתים קרובות הופך קבוע ללא צורך בזריקות נוספות.

כאשר הארנבים עם Con A-המושרה DED טופלו עם הסוכן הרומן פוספוסוינדאק, זה דיכא במידה ניכרת את המחלה. לדוגמה, לאחר טיפול של שבוע עם זה הסוכן TBUT גדל באופן מוגדל לעומת בעלי חיים שטופלו ברכב (43.6 ± 4.0 vs. 12.2 ± 2.8 s; p < 0.001; מתכוון ± SEM בהתאמה, עבור ערכים אלה והבאים) בעוד האוסמלריות דמעה היה מנורמל (294 ± 4.6 vs. 311 ± 2.0 mOsm Sm מכונאי, פוספופולילינדאק ירד רמות של שני interleukins קריטי, IL-1β (8.4 ± 1.2 vs 21.2 ± 6.6 pg/mg חלבון; p < 0.03) ו-IL-8 (4.9 ± 1.7 vs. 13.5 ± 5.0 pg/mg חלבון; p < 0.05)¹⁹.

איור 1: תמונת אולטרסאונד של בלוטת התחתית לקטמאל. הלוח העליון: ILG כפי שהוא נע עמוק יותר במסלול לשכב מתחת לקשת הזיגובטית. הקו המקווקו מייצג את השורה על העור שעליה מטאטאת הבדיקה הארה ב. לוחות הביניים: בזמן שעבודת היד נסחפת על הקו הזה, הבודק מחפש אובדן של הד עצם הזיגותני שנמצא בתמונה השמאלית (חץ) ונעלם מימין. לוחות תחתונים: תמונות של ILG שצולמו לפני (משמאל) ואחרי (ימין) הזרקה של קון a. פיתוח של מרחב סיסטיק גדול בתוך הבלוטה מאשרת מסירה נכונה. הודפסה מודפס בהרשאה¹⁹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הרגעה למסיכת גז. התמונה הזאת מראה את מסיכת הגז. שמספקת הרדמה מתונה עם איזוofלאנה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הסרת הממברנה הניגמית. (א) הזרקת לידוקאין/אפינפרין. (ב) חיתוך של קרום הניקגטינג בבסיסו עם מספריים של ווסטקוט. (ג) המשטח העינית דמיינו בקלות רבה יותר לאחר הסרת הקרום ניקוטיטינג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מדידת זמן הפרידה מדמעה. (א) מראה ממדים ירוק הסרט דמעה של משטח הקרנית תחת אור כחול מיד לאחר היישום של טיפות fluorescein. (ב) משטח הקרנית שכבר עבר מסומן לשבור את העדות על ידי עיגולים כהים מרובים פסים ליניארי בתוך fluorescein. זמן ההפסקה נרשם ברגע שהנקודה או הקו האפל הראשון מתפתח. שני עיגולים כחולים בהירים הם השתקפויות של מקור האור מתוך הקרנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: מבחן הדמעות של שמימר. (A) את המיקום הנכון של הספוג weck-Cel ב הנמוך ביותר כדי להסיר את כל פתרון לידוקאין אקטואלי ודמעות הבסיסית. על ידי הצבת הקצה האחורי של ספוג משולש מתחת לשולי המכסה התחתון, ניתן לשמור על טכניקה אחידה מאוד כדי לייבש את המשטח העינית לפני הצבת רצועות הדמעות. (ב) רצועת דמעה הממוקמת כראוי באמצע המיקום של המכסה התחתון בין הגלובוס והמכסה התחתון (palpebral לחמית). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: רוז כתמים בנגלי. עליונים: . תמונות של משטח הקרניות שמאל: אין כתמים בנגלי ורדים נוכח לפני הטיפול עם קון A. מימין: לפזר כתמים הקרנית ולחאך הוא נראה ברביע האף העליון שלאחר ההזרקה (הימנית העליונה). נמוך יותר: התרשמות מהלחמית מהבר העליון לחמית. שמאל: בתאי גביע רבים נמצאים לפני הטיפול. מימין: תאים אפיתל הם נוכחים אבל בתאי גביע נעדרים לאחר הטיפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: הכנת הארנב לקונקנאלין. זריקות (A) מזמרה קטנה משמשים כדי להסיר פרווה, המאפשר הדמיה קלה יותר של ציוני דרך לזהות את הבלוטה העליונה מסלולית לקטמאל. (ב) משמש להסרת שיער שנשאר לאחר ההטיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: הזרקת של בלוטת palpebral lacrimal. (א) בלוטת palpebral lacrimal, המופיעה כגובה בולבוסי בחלק הזמני האחורי של המכסה העליון. דמעות נראים הזרמת מהמשטח של בלוטה זו לאחר החלת טיפה של 2% fluorescein. (ב) בלוטת palpebral lacrimal מוזרק בזמן הארנב הוא מקבל הרגעה מתונה. חוקר אחד מופרע הזה בו את העפעף, מייעל את החשיפה של בלוטת, ומאבטח את המסיכה בעוד החוקר השני מזריק את הבלוטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: לוקליזציה של בלוטת המלך העליונה מסלולית. שינויים בקווי המתאר של העור מציינים את המיקום של OSLG כפי שהוא בולט דרך incisure האחורי. לחץ המדיאלי מתחלפים על הגלובוס (חץ גדול) גורם בלוטת מסלולית מעולה כדי לשגות, אשר נראה כגובה קטן בעור. גובה זה יגדל בגודל בכל פעם שהלחץ מוחל (חיצים קטנים). המיקום של בלוטה זו הוא בדרך כלל בקנה אחד עם השפה הסלולית האחורי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: הזרקת הבלוטה העליונה מסלולית. (א) יישום של לחץ עדין על הגולגולת עם מלקחיים בעלי שיניים משובחות באזור אשר הפרו כמו באיור 9. פתיחה דקה בגולגולת. יכולה לpalpated השארת סימן קטן עם מלקחיים מאוד עוזר מיקום המחט במהלך ההזרקה. (ב) המחט מוכנס ניצב דרך incisure. אם מניחים שגוי, המעבר שלו נעצר על-ידי הגולגולת הגרמית. (ג) המחט היא בעמדה הסופי בזווית לכיוון canthus לרוחב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11: לוקליזציה של בלוטת התחתית לקטמאל. (א) הגדולה של החלק השטייתי של ilg לראות דרך המכסה התחתון. סימן העט הקטן מציין את המיקום התחתון של הבלוטה. הקו האנכי, מתחת לימבוס האף, מציין את המיקום המשוער שבו מעברי ה-ILG למצב עמוק יותר בתוך המסלול ומשמש כהפניה חזותית לארה ב. (ב) לנו יד-פיסת מטאטא על פני השטח של הקו האנכי; צג ארה ב יראה איפה העצם הזיגובטית מסתיימת, שם מעברים ILG והיכן הזרקת Con A יש להינתן ("אתר הזרקה"). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 12: הזרקת הבלוטה הנחותה. הזרקת ה-ILG מתבצעת במיקום שזוהה על ידי ארה ב. עומק ההזרקה מחושב כמתואר בטקסט (שלב 5.8.6). קליפרס (ראה מאחורי המחט) להבטיח כי המחט ממוקם בעומק הנכון לפני ההזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 13: היסטולוגיה של בלוטות הלקמל. הרקמה חלקים של בלוטת הנחותים לקטמאל רגיל עם מבנה tubulo אופייני מכתשי (א) ולאחר ההזרקה של קון a (ב), מראה לימפוציטית ל, מסומן לחדור מבנה של המבנה. מחלחל דלקתי דומה נראים בלוטות לקטמאל מעולה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שיטת הזרקה	TBUT שניה		אוסמליות קריעה, Osm/L		STT, ממ
	בסיסית	לאחר הזרקה	בסיסית	לאחר הזרקה	בסיסית	לאחר הזרקה
	פירושו ± SEM,% שינוי
ILG ללא הדרכה בארה ב	58.5 ± 1.5	44.5 ± 7.7	297 ± 4.9	300 ± 3.8	15.2 ± 0.9	12.9 ± 2.2
% שינוי		23		1		15
		p = 0.05		p = 0.36		p = 0.21
US-מונחה הדרכה + PSLG	59.4 ± 0.6	11.4 ± 4.2	296 ± 4.7	326 ± 3.7	15.1 ± 1.3	10.7 ± 1.8
% שינוי		-81%		10		29
		p < 0.0001		p < 0.0001		p < 0.03
US-ILG מונחה + PSLG + OSLG	60 ± 0.0	6.2 ± 1.3	299 ± 2.9	309 ± 2.8	14.6 ± 0.9	9.9 ± 1.3
% שינוי		-90%		3		-32%
		p < 0.0001		p < 0.008		p < 0.002
כל הערכים נמדדו ביום 6 בעקבות זריקה אחת של קון A לתוך הבלוטות המפורטות. . כל ההשוואות נעשו לבסיס * ILG, הנחותה בלוטת הנפילה; PSLG, palpebral חלק של בלוטת מעולה לקטמאל; OSLG, חלק מסלולית של בלוטת מעולה לקטמאל; . אנחנו, אולטרה סאונד

טבלה 1: אפקט של טכניקת הזרקה ומספר אתרי הזרקה על חומרת העין יבש.

	בסיסית	. היום השישי	. היום ה -13	. היום ה -21
		1 הזרקה	2 זריקות המשך	3 הזריקות
TBUT שניה	58.5 ± 1.5	44.5 ± 7.7	29.2 ± 7.8	12.8 ± 3.9
% שינוי		24	-50%	-78%
		p = 0.17	p = 0.001	p < 0.0001
TOsm, Osm/L	297 ± 4.9	300 ± 3.9	308 ± 4.9	313 ± 2.7
% שינוי		1	4	5%
		p = 0.36	p = 0.04	p = 0.003
STT, ממ	15.2 ± 0.9	9.3 ± 1.6	12.9 ± 1.6	7.4 ± 1.1
% שינוי		-39%	15	-51%
		p = 0.17	p = 0.13	p = 0.008
. השוואות נעשו לבסיס

טבלה 2: ההשפעה של הזרקת קון A חוזרות לתוך ILG במשך של DED.

Discussion

ארנבים הם מאוד אטרקטיביים למחקר של DED. הקרנית שלהם לחמית יש אזור פני השטח קרוב יותר לזה של בני אדם לעומת עכברים וחולדות; שלהם המשלים של התרופה מטבריזציה של אנזימים כגון מוחק, ו היסטולוגיה של בלוטות הlacrimal שלהם דומים לאלה של בני אדם, ועיניהם הם גדולים מספיק למחקרים הפרמקוקינטיים אינפורמטיבי. לעומת חזירים וקופים, שאיתם הם חולקים תכונות דומות, הם עולים פחות והמניפולציה הניסיונית שלהם קלה יותר. אם מחקרים מכניסטיים הם שקל, חיסרון יחסי של הארנב, לעומת עכברים, הוא כי פחות ריאגנטים (למשל, נוגדנים חד שבטיים) זמינים. מצד שני, הארנב הוא הרבה יותר מעולה על עכברים עבור מחקרים פרמקוקינטיים והפצה משום שרקמות בודדות הן בקלות לגזור ובמידה מספקת עבור עבודה אנליטית, הימנעות "מדגם הצירוף."

פרמטר כללי קריטי הוא תקופת הסתגלות של הארנבים. בעלי החיים נשלחים מהספק בתנאים שלעיתים קרובות אינם מבטיחים סביבת תחבורה של הטמפרטורה או הלחות המתאימים. ייתכן שחיות מסוימות כבר פיתחו עין יבשה עם הגעתם. מומלץ להתרגל לתקופה של שבועיים. חשוב באותה מידה הוא תשומת לב קפדנית הלחות והטמפרטורה של החלל שבו ארנבות המחקר שוכנו vivarium. סטיות בכל מצב יכול לגרום וריאציות ענק במצב העין שלהם. יש לגבות מכשירי האדים ולנקות את האדים בהישג יד. אם המערכת המרכזית נכשלת, פעל במהירות כדי לשחזר את לחות הסביבה באמצעות ציוד הגיבוי. זכרו שהתפתחויות כה מצערות נפוצות יותר בחודשי הקיץ. שלושת השלבים הקריטיים ביותר, עם זאת, עבור בהצלחה לגרימת DED בארנבים הם: 1) השימוש מיומנת של הדמיה בארה ב כדי לזהות את ILG ולהפנות ולאשר הזרקה של קון A; 2) הבטחת הזרקה של ה-ILG והן את שני החלקים של SLG; ו-3) אמין ומתוכע באופן שאומר את הפרמטרים של DED.

פיתוח המיומנות הניסיונית הנדרשת אינה טריוויאלית, אך לא צריך להרתיע כל חוקר רציני. צפה שעקומת הלמידה תושלם בתוך חמש איטראציות. מערכת הדמיה של ארה ב באיכות סבירה היא חיונית. הכרה של סימנים אנטומיים על ידי ארה ב חשוב, לכן, החוקר צריך לבדוק את אנטומיה הארנב. תיאור מצוין של אנטומיה של הארנב על ידי דיוויס²⁵, קלאסי, יכול להיות מועיל מאוד. גם לזכור את הווריאציה בגודל של ILG. הסקנה לכך היא כי ההצלחה של קון A חייב תמיד להיות מאושר עם המשך הדמיה. וריאציות בתגובה קון A בקבוצה של ארנבים הוא בדרך כלל בשל טכניקת ההזרקה (הזרקה מוצלחת או באופן חלקי מוצלח) או כדי להתעלם מהיכולת של רקמות בלוטת לקטמאל שיורית כדי לפצות על ייצור יתר של דמעות. לאלו המעוניינים לשלוט בטכניקת ההזרקה, הזרקת מתילן כחול ואחריו בקשה לניתוח אנאטומי יכול להועיל; הדמיה מושגת אם הוא מגיע לבלוטת הלקמל או נשפך על הרקמות השכנות. עד כה, שיטת הזרקה זו בוצעה על 270 פעמים על-ידי המחברים ללא סיבוך אחד.

לומר את חמשת הפרמטרים של DED הציג לעיל יכול להיות מסובך כמו הנחישות שלהם בפרקטיקה הקלינית. אף על פי שווריאציות מעגליות עדיין לא תועדו רשמית באף אחת מהן, יש מספיק ראיות ברקע לתופעות כאלה בעין²⁸ שהן צריכות להיות מועדות באותו זמן ביום (± 1 h), במיוחד כאשר החזרה על הספר מבוצעת ומושוות זה לזה. העקביות בביצוע מאמר זה חיונית. . צוות של שניים נדרש ארבעה חוקרים או יותר באותו חדר השתתפות בחני יכול להיות מפריעה, בהתחשב בכך כמה צעדים דורשים תזמון קפדני. תיעוד מתאים לצילום באיכות גבוהה, שצוין במקום, חשוב.

מודל זה מתאים באופן אידיאלי ללימודי פיתוח סמים. שליטה של מודל בעלי חיים וטכניקות שיטת הביטחון מובטחת מצוינות מעולה¹⁹ של יעילות ומחקרי בטיחות.

זוהי גישה ניסיונית רבת עוצמה משום שהיא מבטלת את השינויים המייסדים של דגמים קודמים, יש לחזק את המודל של בעלי חיים ומתוקננת למעשה מתוך לומר את חמשת הפרמטרים של DED. היישום המוצלח של מודל זה למחקר של סוכן מועמד טיפולית אישר את השירות המעשי שלה כמודל חיה אינפורמטיבי למחלה בצורך נואש של סוכנים חדשניים והבנה עמוקה יותר של הפתוגנזה שלה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm macro lens	Canon EF 100mm f/2.8L IS USM	3554B002
26 gauge needles (5/8)	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ	305115	Needles for injecting ConA into the lacrimal glands
27 gauge needles (5/8)	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ	305921	Needles for injecting ConA into the lacrimal glands
Aceproinj (acepromazine)	Henry Schein Animal Health, Dublin, OH	NDC11695-0079-8	0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation
Anesthesia vaporizer	VetEquip, Pleasanton, CA	Item #911103
Bishop Harmon Forceps	Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ	E1500-C	Tissue forceps
Caliper	Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ	E-2404	Caliper used to measure length of needle during ConA injection
Concanavalin A	Sigma, St. Louis, MO	C2010	Make 5mg/ml in PBS for injection into rabbit lacrimal glands
DSLR camera	Canon EOS 7D DSLR	3814B004	Digital single lens reflex camera
fluorescein	AKRON, Lake Forest, IL	NDC17478-253	Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT
Isoflurane	Henry Schein, Melville, NY	29405
Lactoferrin ELISA kit	MyBiosource, San Diego, CA	MBS032049	Measure tear lactoferrin level
lidocaine	Sigma, St. Louis, MO	L5647	1% in PBS for anesthesia agent
macro/ring flash	Canon Macro Ring Lite MR-14EXII	9389B002AA
Osmolarity tips	TearLab Corp., San Diego, CA	#100003 REV R	Measure tear osmolarity
PBS (phosphate buffered saline)	Mediatech, Inc. Manassas, VA	21-031-CV
Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (as described in text)	Charles River Labs, Waltham, MA	2-3 kg	Research animals
Rose Bengal	Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO	NDC51801-004-40	1% in PBS, stain the ocular surface
Schirmer strips	Eaglevision, Katena products. Denville, NJ	AX13613	Measure tear production
Surgical Loupes +1.50	Designs for Vision, Bohemia, NY	Specialty item	Provide magnificantion of ocular surface while observing tear break up and performing Concanavalin A injections.
TearLab Osmometer	TearLab Corp., San Diego, CA	Model #200000W REV A	Measure tear osmolarity
Ultrasound probe	VisualSonics Toronto, Ont	MX 550 S	Untrasonography-guide Con A injection for inferior lacrimal gland