Kıprimal Bezlere Concanavalin A Enjeksiyonu ile Indüklenen Sulu-Eksik Kuru Göz Hastalığının Tavşan Modeli: İlaç Etkinliği Çalışmalarına Uygulama

Özet

Bu makalede, orbital gözyaşı bezi sisteminin tüm bölümlerine konkain A enjekte ederek tavşanakut veya kronik kuru göz hastalığı neden bir yöntemin geliştirilmesi açıklanmaktadır. Bu yöntem, daha önce bildirilenlerden daha üstün, farmakolojik ajanların çalışması için uygun kuru göz tekrarlanabilir, istikrarlı bir model oluşturur.

Özet

Kuru göz hastalığı (DED), oküler yüzeyin çok faktörlü inflamatuar bir hastalık, yaşam kalitesi ve sağlık maliyetleri için şaşırtıcı etkileri ile dünya çapında 6 insan 1 etkiler. Onun temel özellikleri özetlemek bilgilendirici hayvan modellerinin eksikliği DED için yeni terapötik ajanlar için arama engeller. Mevcut DED hayvan modelleri sınırlı tekrarlanabilirlik ve etkinliği vardır. DED'nin tavşanların orbital gözyaşı bezlerine mitojen konkain A (Con A) enjekte edilerek indüklendiği bir model burada sunulmaktadır. Bu modelin yenilikçi yönleri ultrason kullanımı (ABD) inferior gözyaşı bezi içine Con A optimal ve tekrarlanabilir enjeksiyon sağlamak için rehberlik; gözyaşı kompansatuar üretimini sınırlayan tüm orbital gözyaşı bezleri içine Con A enjeksiyonu; ve Con A'nın ded durumunu gerektiği gibi uzatan periyodik tekrar enjeksiyonlarının kullanımı. DED ve test ajanlarına yanıtı gözyaşı üretimini, gözyaşı filminin stabilitesini ve kornea ve konjonktiva mukozasının durumunu değerlendiren bir parametre paneli ile izlenir. Bunlar arasında gözyaşı ozmolalitesi, gözyaşı kırılma süresi, Schirmer'in gözyaşı testi, gül benenbisi boyama ve gözyaşı laktoferrin düzeyleri sayılabilir. DED indüksiyonu ve parametrelerinin izlenmesi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu model basit, sağlam, tekrarlanabilir ve bilgilendirici. Bu hayvan modeli gözyaşı fizyolojisi ve DED patofizyolojisi çalışmaları yanı sıra DED tedavisi için aday ajanların etkinliğini ve güvenliğinin değerlendirilmesi için uygundur.

Giriş

Kuru göz hastalığı (DED) yüksek yaygınlık ve morbidite^1,2,3,4ile kronik bir durumdur. Inflamasyon patogenezinde önemli bir rol oynar^5,6. DED'nin patofizyolojisi, yırtılma nın az üretimi veya aşırı buharlaşmasından türeyen olarak kavramsallaştırılır; eski de sulu-eksik DED⁷olarak bilinir. Sjögren sendromu, DED yaygın olarak çalışılan bir prototip nedeni, öncelikle gözyaşı bezleri etkiler (LGs) ve DED patogenezinde öneminin çarpıcı bir örneğidir. DED genellikle geçici rahatlama sağlamak yapay gözyaşları ile tedavi edilir, ya da siklosporin veya lifitegrast ile, her ikisi de göz iltihabı bastırmak. DED için mevcut tedavilerin hiçbiri optimal, yeni ajanların geliştirilmesi gerektiren^8,9.

DED için yeni terapötik ajanlar için arama üç büyük zorluklar tarafından engellenir: ded patofizyolojik karmaşıklığı göz önüne alındığında zor olabilir tanınan bir ilaçmoleküler hedef, eksikliği; gelecek vaat eden ajanların seyrekliği; ve DED'nin temel özelliklerini özetleyen hayvan modellerinin eksikliği.

Çoğu ilaç geliştirme çabasında olduğu gibi, DED'nin bilgilendirici hayvan modelleri, hiçbir hayvan modelinin bir insan hastalığını tamamen özetlemediğinin aksiyomatik ifadesine rağmen, önemli bir araştırma aracıdır. Köpek ve primatlar seyrek^{olarak 10,11}kullanılırken DED fare, sıçan ve tavşan modelleri en sık kullanılır. 12'den fazla tavşan DED modellerinin çoğu ya LGs kaldırarak ya da işlevini engelleyerek gözyaşı üretimini azaltmak için bugüne kadar girişimi rapor^{12,13,14,15,16}. Bu tür yaklaşımlar ILG'nin cerrahi rezeksiyonu; boşaltım kanalının kapatılması; ve aşağıdakilerden birinin ışınlama veya enjeksiyon ile LG işlevini bozan: aktif lenfositler, mitojenler, botulinum toksin, atropin, veya benzalklonium. Bu yöntemlerin en önemli sınırlamaları tutarsızlıkları ve gözyaşı üretiminin sık sık kısmi olarak bastırılmasıdır.

Concanavalin A (Con A), bitki kökenli bir lektin, güçlü bir uyarıcı T-hücre alt setleri ve hepatit deneysel modellerde kullanılmıştır¹⁷ ve DED¹⁸. Orijinal Con A tabanlı model, göreceli basitlik de dahil olmak üzere önemli avantajlar sunmak için bildirilmiştir; LGs inflamatuar hücre akını, Sjögren gibi hastalıkları taklit; proinflamatuar sitokinlerin stimülasyonu IL-1β, IL-8 ve TGF-β1; gözyaşı floresan açıklık ve gözyaşı kırma süresi (TBUT) ölçülerek izlenen azaltılmış gözyaşı fonksiyonu; ve bir anti-inflamatuar kortikosteroid için gösterilen ilaç yanıt.

Bu umut verici yöntem uygulandığında, avantajlarına ek olarak, genel revizyon ve köklü iyileştirmeler gerektiren sınırlamalar tespit edilmiştir. Yöntemin üç kritik eksiklikleri belgelenmiştir. İlk olarak, model akut bir oldu; indüklenen DED yaklaşık 1 hafta sonra yatıştı. İkincisi, hayvanların tepkisi tutarsız oldu. Gösterildiği gibi, Inferior LG için "kör" transkutanöz enjeksiyonlar (ILG), Con A hedeflenen bezi sadece rasgele teslim edildi. ILG anatomisinin detaylı çalışması, boyutunun 4 kat^19'a kadar değişebileceğini ve bu tür enjeksiyonların "vur-kaç" çabalarını ortaya koymuştur. Son olarak, ILG enjekte edildiğinde bile, üstün LG (SLG) sık sık azaltılmış gözyaşı akışını telafi ederek modeli sorunlu hale getiriyordu.

Bu anahtar sınırlamalar yönteme üç değişiklik getirerek aşıldı, DED üstün bir hayvan modeli üreten. İlk olarak, Con A'nın ILG'ye enjeksiyonu ultrason (ABD) rehberliğinde yapıldı ve Con A'nın bezin içine girmesini sağladı. Enjeksiyonun başarısı Şekil 1'degösterildiği gibi enjeksiyon sonrası ABD görüntüsü alınarak doğrulandı. İkinci olarak, SLG'nin kompansatör gözyaşı katkısını gidermek için, bu bezin hem palpebral hem de orbital kısımları Con A ile enjekte edildi. Son olarak, DED bu akut modeli Con A her 7-10 günde tekrarlanan enjeksiyonları ile kronik bir dönüştürüldü. Bu tavşanlarda 2 aylık ded kolayca elde edilir. Bu yaklaşımın başarısı fazlasıyla^{belgelenmiştir 19}.

Daha önce de belirtildiği gibi, DED hayvan modellerinin önemli bir uygulama etkinliğini ve aday terapötik ajanların güvenliğini belirlemektir. Bu modelin yararı fosfosulindac çalışma ile gösterilmiştir (OXT-328), yeni bir anti-inflamatuar küçük molekül^20,21 göz damlası olarak tatbik. Etkinliğini DED¹⁹parametrelerinbir panel dayalı gösterilmiştir. Bu modelin göreceli sadeliği ve bilgilendirici doğası da ded için iki FDA onaylı ilaçlar fosfosulindac yan yana karşılaştırma izin, siklosporin ve lifitegrast, güçlü preklinik üstünlüğünü gösteren.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları Stony Brook Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmış ve Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanımı için ARVO Bildirimi uyarınca yapılmıştır.

1. Hayvanlar ve konut

1. 2-3 kg ağırlığında Yeni Zelanda Beyaz (NZW) tavşan edinin.
2. Tavşanları katı sıcaklık (65 ± 5 °F) ve nem (%45 ± 5) ile kafeslerde tek tek Denetim. Aydınlatma 12 saat açık/kapalı çevrim olmalıdır.
3. Su ve standart tavşan yemek sınırsız erişim sağlar. Onlar göz etkileyen A vitamini içerebilir gibi diyet zenginleştirmeler ortadan kaldırın.
4. Temel önlemler veya kuru göz indüksiyonundan önce hayvanları en az 2 hafta boyunca alıştırın.

2. Anestezi ve ötenazi yöntemleri

NOT: Tüm işlemler, Orta derecede sedasyon gerektiren Con A enjeksiyonu dışında hafif sedasyon gerektirir.

1. Hafif sedasyon için, 26-gauge iğne kullanarak omuzlar üzerinde subkutan acepromazin (1 mg/kg) enjekte. Hafif sedasyon için uç nokta: hayvanlar artık tamamen dik kulak lobları ile rahat bir baş pozisyonu korumak.
   NOT: Uygun uç noktaya ulaşılamazsa ek acepromazin eki iğne yapılabilir. Hayvanlar her zaman uyanık kalmalı, bıyıklarına dokunmaya karşı duyarlı olmalı ve asla yavaş nefes alma göstermemelidir.
2. Orta sedasyon için, ilk yukarıdaki gibi hayvanlar acepromazine verin. Bitiş noktasına ulaşıldıktan sonra (yukarıdaki nota bakın), 1 L/dk'da O₂ akış setine sahip bir gaz maskesi kullanarak isofluran ve %5'e ayarlanmış isofluran teslimi(Şekil 2).
3. Tavşan ın vücut tonu tamamen rahat ve kulaklar tamamen sarkık olana kadar isoflurane uygulayın.
   NOT: Hayvan yan tarafına döndüğünde telafi edici kas hareketleri olmamalıdır; nefes her zaman spontan kalır.
4. Spontan iyileşme 2-5 dakika içinde oluşur: belirtileri spontan baş hareketleri ve artmış veya normal kas tonusu içerir. Deneysel işlem orta sedasyon ile tamamlandıktan sonra, yaklaşık 30 dakika boyunca tavşan gözlemlemek veya davranışları normale dönene kadar.
   NOT: Her iki sedasyon formunda oftalmik merhem gerekmez. 1) Hafif sedasyon, hayvanlar hala uyanık ve göz kırpma reflekskorumak. Orta derecede sedasyonda, göz kırpma refleksinin inhibisyonu o kadar kısadır ki göz yüzeyi risk altında değildir. 2) Göz merheminin oküler yüzeye yerleştirilmesi, test sırasında değerlendirilen yapıların görselleştirilmesini engellemez.
5. Ötenazi: Aşırı dozda intravenöz pentobarbital (100 mg/kg) kullanın.

3. Nititating membranın çıkarılması

1. Korneanın tam ve doğru değerlendirilmesi için alışma döneminde (genellikle ilk hafta) kaldırma işlemini gerçekleştirin.
2. Sağ nititating membrana enjeksiyon
   NOT: Her iki gözün nititating membranı çıkarılacaksa, bunu tek seansta yapmak en basitidir. Tek gözle başla ve açıklandığı gibi devam et. Açıklamanetliği için bu yöntem sağ göz ile başlar.
   1. Uygun büyüklükte bir yasaklama torbasına tavşan yerleştirin.
   2. Adım 2.1'de açıklandığı gibi hafif sedasyon alıbın.
   3. 25 μL'lik koruyucuiçermeyen lidokaini mikropipet kullanarak sağ göze uygulayın.
   4. Göz kapakları arasına esnek bir tel kapak spekulumu yerleştirin.
   5. 0.3 forseps (veya eşdeğeri) kullanarak, onun apeks nictitating membran kavramak ve kornea üzerinde uzatmak.
   6. 26-gauge keskin iğne kullanarak nicitating membran tabanına 1:100.000 epinefrin subkonjonktival ile lidokain% 1 enjekte(Şekil 3A). Ilımlı bir bleb nititating membran üzerinde oluşmalıdır.
   7. Spekulumu çıkarın.
3. Sol nititating membranına aynı enjeksiyonu yapın.
4. Nititating membranının kesilmesi
   1. Yaklaşık 5 dakika sonra, sağ göz geri kapak spekulum yerleştirin. 0.3 forceps (veya benzeri) kullanarak apex nictitating membran kavramak ve geri çekmek.
   2. Westcott makas veya eşdeğeri kullanarak tabanında nictitating membran kes (Şekil 3B).
      NOT: Kanama minimaldir ve genellikle katutery gerektirmez. Bununla birlikte, ek hemostaz gerekirse yüksek sıcaklıkta pil mağarası her zaman yakın tutulur.
   3. Spekulumu çıkarın.
   4. Göz (örneğin, neomisin, polimisin, bacitracin ve hidrokortizon) topikal antibiyotik merhem yerleştirin.
5. Harderian bezini sağlam bırak. Harderian bezi bazen nicitating membran geri çekilir görülür.
   NOT: Nikotitasyon membranı çıkarıldıktan sonra nazal veya superior subkonjonktival bölgede büyük beyaz bir kitle veya doku yükselmesi görülürse, membran tabanına çok yakın bir şekilde rezeke edilerek Harderian bezinin kendiliğinden prolapsusa izin verilir. Sonraki işlemlerde bunu önlemek için, tabanında nictitating membran daha bırakın.
6. Daha fazla manipülasyon lar yapılmadan veya oküler yüzey tahlilleri yapılmadan önce oküler yüzeyin en az 1 hafta iyileşmesini bekleyin.

4. Kuru göz parametrelerinin ölçülmesi ve gözyaşı örneklerinin toplanması

NOT: DED parametrelerini çalışma protokolü ihtiyaçlarına göre ölçün (örn. taban çizgisi ve bundan sonra belirtilen zaman noktaları). DED ölçümleri, her seferinde sadakatle çoğaltmak için sıkı bir çaba yla aşağıdaki sırada yapılmalıdır. Sirkadiyen varyasyonları en aza indirmek için tüm hayvanları yaklaşık olarak günün aynı saatinde (± 1 saat) test edin. Bu ölçümler genellikle iki araştırmacıdan oluşan bir ekip gerektirir.

1. Tavşanı bir yasaklama torbasına koyun. Hafif sedasyona neden olur.
2. Gözyaşı Osmolarity²²
   1. Göz kapaklarının göz kapaklarının göz kırpması 5-10 kez göz kırpın ve gözyaşı tabakasını göz yüzeyinde eşit olarak dağıtın.
   2. Alt kapağı yavaşça geri çekin.
   3. Alt ninix boyunca palpebral ve bulbar konjonktiva kavşağında TearLab Osmometre ile örnek gözyaşları, kesilen nictitating membran tabanına sadece posterior.
   4. Üreticinin talimatlarına uygun TearLab Osmolarity Test'i kullanarak ozolariteyi ölçün.
3. Gözyaşı ayırma süresi (TBUT)
   1. Bu tisma için odayı karart.
   2. Göz kapakları arasına bir tel kapak spekulum yerleştirin.
   3. Bir mikropipet kullanarak kornea yüzeyine %0,2 floresan içeren 50°L damla uygulayın. Kornea üzerinde floresan bile dağılımı ilk damla ile elde edilmezse, ikinci bir damla yerleştirin.
   4. Hemen bir zamanlayıcı başlatın.
   5. Mavi ışık altında ön kornea gözyaşı filmi izleyin. TBUT siyah nokta, çizgiler veya fluorescein filmin belirgin bozulma geliştirmek için alınan zaman olarak tanımlanır (Şekil 4). Gerekirse, erken ayrılık belirtilerini daha iyi görselleştirmek için +1.50 büyütme sağlayan cerrahi loupes kullanın. 1 dakikaya kadar monitör; burada tanımlandığı gibi break-up 1 dakika sonra oluşursa, sadece 60 s için TBUT kaydedin.
4. Schirmer Gözyaşı Testi (STT)
   1. Oküler yüzeye 25 μL'lik koruyucuiçermeyen lidokain damlası uygulayın.
   2. Artık lidokain ve herhangi bir gözyaşı sıvısı emmek için inferior fornix içine bir Weck hücreli cerrahi mızrak yerleştirin. Gerekirse, süngerin proksimal ucunu örtmek için alt göz kapağını kullanın (Şekil 5A).
   3. Yaklaşık 30 s sonra, Weck sünger çıkarın.
   4. Hemen alt kapağın orta noktasında kornea ve palpebral konjonktiva arasındaki boşluğa bir Schirmer gözyaşı testi şerit takın.
   5. Hemen bir zamanlayıcı başlatın (Şekil 5B).
   6. 5 dakika sonra, şerit nemlendirilmiş kısmının uzunluğunu ölçmek; bu STT değeridir.
   7. Ölçüleri triplicate olarak gerçekleştirin ve 3 okumanın ortalamasını STT değeri olarak bildirin.
5. Gözyaşı örneklerinin toplanması
   1. Laktoferrin gibi çeşitli analit lerin seviyelerini tespit etmek için gözyaşı örnekleri toplamak için, STT değeri 5 dk olarak kaydedildikten sonra, en az 20 mm ıslatılıncaya kadar şeridi yerinde bırakın.
      NOT: DED indüklendikten sonra yeterli ıslatma meydana gelmezse, makul bir süre içinde bu uç noktaya ulaşmamıza yardımcı olmak için şeridi alt fornix'in daha derinlerine doğru ilerletin.
   2. Nemlendirilmiş şeridi kesin ve proteinaz inhibitörü kokteyli ile PBS'de %4'ü BSA, 1M NaCl, %0.1 Ara-20)'ye hemen 490 μL soğuk Gözyaşı Toplama Tamponu yerleştirin.
   3. Numuneleri -80 °C'de saklananın ve tizite edilene kadar bekletin.
6. Gül Bengal Boyama (RBS)
   1. Bir mikro pipet kullanarak korneaya %1 koruyucu içermeyen lidokain 50 μL uygulayın.
   2. 30 s sonra, 25 μL yerleştirin 1% oküler yüzeye gül bengal ve el ile eşit dağıtmak için göz kapağı nı kırpın.
   3. Hemen bir zamanlayıcı başlatın.
   4. 3,5 dk, kapakları arasında bir tel kapak spekulum yerleştirin.
   5. 4.0 dk, üstün konjonktiva ve kornea yüzeyinin fotoğrafını çekin (Şekil 6).
      NOT: Kullanılan kamera nın türüne göre ayarlayın. Tipik ayarlar: dijital tek lensrefleks kamera, diyafram öncelik modu (diyafram 13 veya daha büyük), ISO 6000, 100 mm makro lens iki 12,5 mm uzatma tüpleri ile bağlı, manuel odaklama modu, maksimum büyütme lens, ve makro / halka flaş seti otomatik için aydınlatma-through-lens modu ile. Halka flaş odak lambası kornea odaklanmak yardımcı olmak için açık.
   6. 1 dakika içinde her iki göz için tüm fotoğrafları tamamlayın.
7. NEI yöntemi ile puan oküler yüzey boyama²³ aşağıdaki gibideğiştirilmiştir. 6 ayrı konjonktiva bölgeleri not etmeyin. Puan her gözün üstün konjonktiva. Bu konjonktiva yüzeyinin kolayca dünya manipüle olmadan fotoğraflanan kısmıdır. Manipülasyon aslında oküler yüzey boyama değiştirebilirsiniz.
8. Gözyaşı laktoferrin düzeyleri gözyaşı bezlerinden gözyaşı üretiminin bir vekil ölçüsüdür. Üreticinin talimatları doğrultusunda bir enzim ekive immünosorbent tsay²⁴ kiti kullanarak yukarıda olduğu gibi toplanan gözyaşları gözyaşı laktoferrin saymak.

5. Kuru gözün indüksiyonu ve tedavisi

NOT: Orbital gözyaşı bezi sisteminin üç bölümü enjekte edilir.

1. Tavşanları 0.2 mg/kg subkutan olarak asetpromazin ile sakinleştirin.
2. Periorbital ve kafa derisi alanında kürk kapalı yamak ve tamamen Nair kullanarak herhangi bir artık kürk kaldırın. Anatomik özelliklerin daha iyi görüntülenmesi ve ABD güdümlü konkanavalin enjeksiyonu için cildi tamamen pürüzsüz bırakın (Şekil 7).
3. Yukarıda açıklandığı gibi Orta sedasyon neden.
4. Superior gözyaşı bezinin palpebral kısmının enjeksiyonu (PSLG)
   NOT: Önce PSLG enjeksiyonunu gerçekleştirin.
   1. Mikropipetile %1 koruyucu içermeyen lidokain 25 μL'lik uygun göze uygulayın.
   2. Evert üst göz kapağı ve bezin palpebral kısmını işaretleme protuberance göre posterior orbital jant için hafif medial basınç uygulayın. PSLG üst kapağın posterior (temporal) kısmında küçük bir soğanlı yükseklik olarak görünür.
      NOT: Öğrenme sürecinde bez dokusunu görüntülemek için bölgeye %5 floresan uygulayın(Şekil 8A). Gözyaşları soğanlı PSLG'den akarken görülebilir. Con A'nın yönetimi için floresan uygulamasına gerek yoktur; sadece bez dokusunu göstermek için illüstrasyon amaçlı yapılır.
   3. Bir tüberkülin şırınga üzerinde ince dişli forceps ve 27-gauge iğne kullanarak, doğrudan bir transkonjonktival yaklaşım kullanarak bezi nüfuz. İğneyi dokuiçine 2 mm ilerletin ve 0,1 mL hacimde 500 μg Con A enjekte edin (Şekil 8B).
      NOT: Bu enjeksiyon bazen ağrılı olabilir. Gerekirse, bu enjeksiyon tamamlanana kadar isoflurane altında hayvanları tutun.
5. Orbital superior gözyaşı bezinin enjeksiyonu (OSLG)
   NOT: OSLG hızlı bir şekilde takip eder.
   1. OSLG'nin posterior incisure'den çıkıntı yada dünyaya medial basınç uygulayın (gerekirse anatomi için ref^25'e bakın). Arka incisure OSLG protuberance ile dünya(Şekil 9, kırmızı ok)medial basınç uygulayın. Protuberance posterior incisure bulmak için brüt lokalizasyon olarak hizmet vermektedir.
   2. Kafatasındaki kemikli açıklık hissedene kadar bölgeyi girintisi kapalı uçlu kavisli çerkepler kullanın. Bu protuberance altında bir ön / posterior yönü ile yarık gibi olacaktır.
   3. İğne yerleştirme için dönüm noktası olarak hizmet edecek deride bir girintisi bırakmak için forseps ile mütevazı basınç uygulayın (Şekil 10A).
   4. Girinti işareti üzerinde cilde dik bir iğne (27-gauge, 5/8-inç iğne ile tüberkülin şırınga) yerleştirin (Şekil 10B) ~ 1/4 inci içine inç, sonra enjeksiyon sitesi ve kemikli orbital jant arasındaki orta noktayı hedefleyen lateral kanthus doğru arka ve harici olarak iğne yönlendirmek.
      NOT: İncinme iğne ile tam olarak hedeflenmemişse, kafatası ilerlemesini engeller.
   5. İğnenin göbeğine ulaşıldıktan sonra, 0,2 mL hacimde 1000 μg Con A enjekte edin(Şekil 10C).
6. HEM PSLG hem de OSLG enjeksiyonunu 2-3 dakika içinde tamamlayın.
7. Hayvanı isoflurane sedasyondan çıkarın (henüz yapılmamışsa). Inferior gözyaşı bezi enjeksiyonu (ILG) genellikle daha fazla sedasyon olmadan tamamlanabilir.
8. Inferior gözyaşı bezi enjeksiyonu
   1. Hayvanı yandan göre. ILG'nin önemi yörüngenin alt ön kısmı boyunca görülebilir (Şekil 11A).
   2. ILG bezinin yüzeysel kısmının zigoma kemiğindeki yüzeysel (daha harici) istirahat yerinden yörüngedeki daha medial konumuna geçtiği deride cerrahi işaretleme kalemi veya uygun kalıcı belirteç kullanarak dikey bir çizgi çizin. Bu genellikle ön limbus inferior(Şekil 11A).
   3. Zigomatik kemiğin ucunu, dikey olarak tutulan ABD sondasını derideki bu çizgi boyunca süpürerek tanımlayın. ILG geçişi, bezin görüntüsünün açıkça sınırlanmış (zigomatik kemiğin hiperekoik çizgisi görüntüdeki bezin alt kenarı boyunca görülür) tanınabilir bir medial sınır olmadan bir eb'e değiştiği durumlarda gerçekleşir (zigomatik kemik yankısı artık mevcut değildir, Şekil 1).
   4. ABD ekranı bu değişikliği gösterdiğinde, el parçasının deriye çizilen çizgiye göreli konumunu gözlemleyin. Burası Con A'nın verilmesi gereken "enjeksiyon bölgesi"dir.
   5. Con A'yı salgı bezine, zigomatik kemer kemiğine sadece medial bir noktada yerleştirmek için enjeksiyon derinliğini kontrol edin.
   6. Enjeksiyon derinliğini aşağıdaki gibi belirleyin: İstenilen enjeksiyon derinliğini zigomatik kemiğin derinliği (hiperekoik sinyal) artı 1 mm olarak ayarlayın. Bu değeri iğnenin bilinen uzunluğundan (bu örnekte 15 mm) çıkarın.
   7. İğneyi "enjeksiyon yerinde" ~12 mm'deki bezin içine yerleştirin, sonra maruz kalan iğnenin vücut dışındaki uzunluğu (cerrahi kaliperlerle ölçülen) 5,8,6'da hesaplanan farka eşit olana kadar yavaşça geri çekin(Şekil 12). 0,2 mL'ye 1000 μg Con A enjekte edin.
      NOT: Bezin kapsülünün delindiğinden ve sadece iğne tarafından itilmediğinden emin olmak için, iğne çekilmesi başlamadan önce ~12 mm veya neredeyse hub'a yerleştirilmelidir.
   8. Enjeksiyonun başarısını doğrulamak için ABD'yi tekrarlayın. ILG karakteristik bir hipoekoik boşluk göstermelidir (Şekil 1).
      NOT: ILG enjeksiyonu hayvanlar tarafından en iyi²⁶ tolere edilir ve bu nedenle, son yapılır.
9. 10 dakika içinde her iki gözün tüm bezleri enjekte etmek için tüm prosedürü tamamlayın. Bu, yordamda yetkinlik başarı gerektirir.
   NOT: 2 orbital gözyaşı bezleri içine enjeksiyonlar tek bir dizi akut DED 1-2 hafta süren neden olacaktır.
10. Daha uzun süreli DED için, Con A'ya her 7 günde bir tam olarak yukarıdaki gibi enjekte edin. Bu tür enjeksiyonlar 6'ya kadar başarıyla gerçekleştirilmiştir.

6. Prosedür sonrası bakım

1. Con A enjeksiyonunu takiben, en az 10-20 dakika boyunca veya anestezik etkisi aşınmış kadar onların kısıtlama torbalarında hayvanları izlemek.
2. Onlar sternal recumbency korumak için yeterli bilinç kazanmış kadar hayvanlar gözetimsiz bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar onları kafeslerine geri döndürmeyin.
3. Ameliyat sonrası ağrı genellikle hafiftir ve 48 saatten az sürer. Gerekirse, deri altı ketorolac tek bir doz vermek (5 mg /kg). Daha şiddetli ağrı lar için, deri altı büprenorfin 0.1 mg/kg her 8 saatte bir verin.

Sonuçlar

Con A enjeksiyonları yoğun lenfositik infiltrasyon ile karakterize gözyaşı bezlerinde güçlü bir inflamatuar yanıt indüklenen(Şekil 13),azalmış gözyaşı üretimi ile birlikte. Tüm yırtılma parametreleri belirgin bir şekilde değiştirildi (Tablo 1 ve Tablo 2). Buna ek olarak, gözyaşı laktoferrin düzeyleri bastırıldı (kontrol = 3.1±0.45 vs Con A enjekte = 2.7±0.02 ng/mg protein (ortalama ± SEM); p<0.03). Sonuç olarak, artmış gül bengal boyama ile kanıtlanmış, bozulmuş kornea ve konjonktiva epiteli(Şekil 6)idi.

Enjeksiyon üç orbital LG dokuları önceki yöntemlerle elde edilen devletlerin aksine tutarlı ve düzgün DED devlet üretti^18,27. Bu sonuca önemli katkılar ILG'nin ABD güdümlü enjeksiyonu ve OSLG enjeksiyonu oldu. Tablo 1, bu yöntemin belirgin sonuçlarını özetleyin. Tüm değişiklikler şiddetli DED ile tutarlıdır.

Con A enjeksiyonları tek bir dizi yaklaşık 1 hafta süren DED üretir; tüm klinik parametreler 10. güne kadar normalleşir(Tablo 2). Ardışık Con A enjeksiyonları yaklaşık 1 hafta arayla buna göre DED süresini uzatür. Örneğin, 7. Enjeksiyonlar yaklaşık 5 setleri sonra, DED devlet genellikle daha fazla enjeksiyon için gerek kalmadan kalıcı hale gelir.

Con A-indüklenen DED ile tavşan yeni ajan fosfosulindac ile tedavi edildiğinde, belirgin hastalığı bastırdı. Örneğin, bu ajan tBUT ile bir haftalık tedaviden sonra araçla tedavi edilen hayvanlara göre belirgin bir artış (43.6±4.0 vs. 12.2±2.8 s; p<0.001; ortalama ± SEM sırasıyla, bunlar ve aşağıdaki değerler için) gözyaşı osmolaritesi normale döndü (294±4.6 vs. 311±2.0 mOsm/L, p<.00). Mekanistik olarak, fosfosulindak iki önemli interlökin, IL-1β (8.4±1.2 vs 21.2±6.6 pg/mg protein; p<0.03) ve IL-8 (4.9±1.7 vs. 13.5±5.0 pg/mg protein; p<0.05)¹⁹.

Şekil 1: Inferior gözyaşı bezinin ultrason görüntüsü. Üst Panel: ILG, yörüngenin daha derinlerine doğru hareket ettikçe zigomatik kemerin altında yatsın. Kesik li çizgi, ABD sondasının süpürüldüğü deri üzerindeki çizgiyi temsil eder. Orta Paneller: El parçası bu çizgi boyunca süpürülürken, sınav görevlisi sol görüntüde(ok)bulunan zigomatik kemik yankısının kaybını arar ve sağda kaybolur. Alt Paneller: Con A.'nın con A. enjeksiyonundan önce (solda)ve sonrası çekilen ILG görüntüleri, bez içinde büyük bir kistik alan geliştirilmesi doğru doğumu doğrular. İzin¹⁹ile yeniden basılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Gaz maskesi sedasyonu. Bu fotoğraf isoflurane ile kısa orta sedasyon sağlayan gaz maskesi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Nitüritasyon zarının çıkarılması. (A) Lidokain/epinefrin enjeksiyonu. (B) Tabanındaki nititating membranın Westcott makasile truncation. (C) Oküler yüzey nititating membran çıkarıldıktan sonra daha kolay görselleştirilmiş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Gözyaşı ayırma süresi ölçümü. (A) Flüoresen damlalarının uygulanmasından hemen sonra kornea yüzeyinin mavi ışık altında düzgün yeşil gözyaşı filmi görünümü. (B) Kornea yüzeyi zaten birden fazla koyu halkalar ve floresan doğrusal çizgiler tarafından kanıtlanan belirgin parçalanma uğramıştır. Kırılma süresi ilk karanlık nokta veya çizgi gelişir gelişmez kaydedilir. İki açık mavi daire korneadan gelen ışık kaynağının yansımalarıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Schirmer'in gözyaşı testi. (A) Weck-Cel süngerin indime zinasında uygun şekilde yerleştirilmesi, herhangi bir topikal lidokain çözeltisi ve temel gözyaşını giderme. Alt kapak marjı altında üçgen sünger in arka kenarı yerleştirerek, bir gözyaşı şeritler yerleştirmeden önce oküler yüzeyi kurutmak için çok düzgün bir teknik koruyabilirsiniz. (B) Bir gözyaşı şerit uygun dünya ve alt kapak (palpebral konjonktiva) arasında alt kapağın orta konumuna yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Gül bengal boyama. Üst: Kornea yüzeyinin fotoğrafları. Sol: Con A ile tedavi öncesi gül bengal boyama mevcut değildir. Sağ: Diffüz kornea ve konjonktiva boyama enjeksiyon sonrası üst nazal kadranda görülür (sağ üst). Alt: Superior bulbar konjonktivadan konjonktival gösterim sitolojisi. Sol: Tedaviden önce çok sayıda kadeh hücresi bulunur. Sağ: Epitel hücreleri mevcut ama goblet hücreleri tedavi sonrası yok. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Concanavalin A enjeksiyonları için tavşan hazırlanması. (A) Küçük makaslar kürk kaldırmak için kullanılır, orbital üstün gözyaşı bezi tanımlamak için yerlerin daha kolay görselleştirme sağlayan. (B) Nair kırpma sonra kalan saç kaldırmak için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Palpebral gözyaşı bezienjeksiyonu. (A) palpebral gözyaşı bezi, üst kapağın posterior temporal kısmında bir soğanlı yükseklik olarak görünen. %2 floresan damlası uygulandıktan sonra bu bezin yüzeyinden gözyaşı nın aktığını görülür. (B) Tavşan orta derecede sedasyon alırken palpebral gözyaşı bezi enjekte ediliyor. Bir araştırmacı göz kapağını geri çeker, bezin maruz kalmasını optimize eder ve ikinci araştırmacı bezi enjekte ederken maskeyi sabitler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Orbital superior gözyaşı bezinin lokalizasyonu. Deri konturlarında yapılan değişiklikler OSLG'nin posterior incisure ile çıkıntı yaslar halindeki yerini gösterir. Dünya üzerinde alternatif medial basınç(büyük ok)deride küçük bir yükseklik olarak görülen prolapsus üstün orbital bezi neden olur. Bu yükseklik basınç uygulandığında boyutu artacaktır(küçük oklar). Bu bezin yeri genellikle arka orbital jant ile uyumludur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Orbital superior gözyaşı bezienjeksiyonu. (A) Şekil 9'daolduğu gibi prolapsed alanda ince dişli çaksiler ile kafatasına nazik basınç uygulaması . Kafatasında ince yarık benzeri bir açıklık palpe edilebilir. Forceps ile küçük bir girinti işareti bırakarak büyük ölçüde enjeksiyon sırasında iğne yerleştirme yardımcı olur. (B) İğne incisure ile dik olarak yerleştirilir. Yanlış yerleştirilirse, geçişi kemikli kafatası tarafından durdurulur. (C) İğne lateral kanthus doğru açılı son konumdadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11: Inferior gözyaşı bezinin lokalizasyonu. (A) ILG'nin alt kapaktan görülen yüzeysel kısmının ön plana görülmesi. Eğriliki kalem işareti bezin alt konumunu gösterir. Burun ekstremitesinin altındaki dikey çizgi, ILG'nin yörünge içinde daha derin bir konuma geçiş yaptığı ve ABD için görsel bir referans olarak hizmet ettiği yaklaşık konumu gösterir. (B) ABD el parçası dikey çizgi alanı boyunca süpürme; ABD monitörü zigomatik kemiğin nerede bittiğini, ILG geçişlerinin nerede olduğunu ve Con A enjeksiyonunun nerede yapılması gerektiğini ("enjeksiyon bölgesi") gösterecektir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 12: Inferior gözyaşı bezi enjeksiyonu. ILG enjeksiyonu ABD tarafından belirlenen yerde yapılır. Enjeksiyon derinliği metinde açıklandığı gibi hesaplanır (adım 5.8.6). Kaliperler (iğnenin arkasında görülen) iğnenin enjeksiyondan önce uygun derinlikte yerleştirildiğinden emin olun. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 13: Gözyaşı bezlerinin histolojisi. Tipik tübülo-alveoler yapı (A) ile normal inferior gözyaşı bezidoku bölümleri ve Con A enjeksiyonu aşağıdaki (B), yapıeffacement ile belirgin lenfositik infiltrasyon gösteren. Benzer inflamatuar infiltrasyonlar superior gözyaşı bezlerinde görülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Enjeksiyon Yöntemi	TBUT, sn		Gözyaşı Osmolalitesi, Osm/L		STT, mm
	Temel	Enjeksiyon sonrası	Temel	Enjeksiyon sonrası	Temel	Enjeksiyon sonrası
	ortalama ± SEM, % değişim
ABD rehberliği olmadan ILG	58,5 ± 1,5	44.5 ± 7.7	297 ± 4,9	300 ± 3.8	15.2 ± 0.9	12.9 ± 2.2
%değişim		-23%		1%		-15%
		p=0.05		p=0,36		p=0.21
ABD güdümlü ILG + PSLG	59.4 ± 0.6	11.4 ± 4.2	296 ± 4,7	326 ± 3.7	15.1 ± 1.3	10.7 ± 1.8
% değişim		-81%		10%		-29%
		p<0.0001		p<0.0001		p<0.03
ABD güdümlü ILG + PSLG + OSLG	60 ± 0.0	6.2 ± 1.3	299 ± 2,9	309 ± 2,8	14.6 ± 0.9	9.9 ± 1.3
% değişim		-90%		3%		-32%
		p<0.0001		p<0.008		p<0.002
Tüm değerler listelenen bezlere Con A tek bir enjeksiyon u takiben gün 6 ölçüldü. Tüm karşılaştırmalar taban çizgisine yapıldı. * ILG, inferior gözyaşı bezi; PSLG, üstün gözyaşı bezipalpebral kısmı; OSLG, superior gözyaşı bezinin orbital kısmı; Abd, ultrason.

Tablo 1: Enjeksiyon tekniğinin ve enjeksiyon bölgelerinin kuru göz şiddetine etkisi.

	Temel	6. Gün	13. Gün	21. Gün
		1 enjeksiyon	2 enjeksiyon	3 enjeksiyon
TBUT, sn	58,5 ± 1,5	44.5 ± 7.7	29.2 ± 7.8	12.8 ± 3.9
% değişim		-24%	-50%	-78%
		p=0.17	p=0.001	p<0.0001
TOsm, Osm/L	297 ± 4,9	300 ± 3.9	308 ± 4.9	313 ± 2,7
% değişim		1%	4%	5%
		p=0,36	p=0.04	p=0.003
STT, mm	15.2 ± 0.9	9.3 ± 1.6	12.9 ± 1.6	7.4 ± 1.1
% değişim		-39%	-15%	-51%
		p=0.17	p=0.13	p=0.008
Karşılaştırmalar taban çizgisi için yapılmıştır.

Tablo 2: Tekrarlanan Con A enjeksiyonlarının ILG'ye DED süresine etkisi.

Tartışmalar

Tavşanlar DED çalışması için son derece çekici. Korneaları ve konjonktivaları, fare ve sıçanlara göre insanlarınkine daha yakın bir yüzey alanına sahiptir; esteraz gibi ilaç metabolize enzimleri onların tamamlayıcı, ve onların gözyaşı bezlerinin histolojisi insanların benzer, ve gözleri bilgilendirici farmakokinetik çalışmalar için yeterince büyük. Domuzlar ve maymunlar ile karşılaştırıldığında, hangi ile benzer özellikleri paylaşmak, onlar daha az maliyet ve deneysel manipülasyon daha kolaydır. Eğer mekanistik çalışmalar düşünülse, tavşanın farelere göre göreceli bir dezavantajı, daha az reaktifin (örneğin, monoklonal antikorlar) mevcut olmasıdır. Öte yandan, tavşan farmakokinetik ve biyodağıtım çalışmaları için farelerden çok daha üstündür çünkü tek tek dokular kolayca incelenir ve analitik çalışmalar için yeterli boyuttadır, "örnek havuzlama"dan kaçınır.

Kritik bir genel parametre tavşanların alışma dönemidir. Hayvanlar genellikle uygun sıcaklık veya nem bir ulaşım ortamı sağlamak değil koşullar altında satıcıdan sevk edilir. Bazı hayvanlar varışta zaten kuru göz gelişmiş olabilir. İki haftalık bir alışma süresi önerilir. Aynı derecede önemli çalışma tavşan canlılık içinde barındırığı alanın nem ve sıcaklık titiz dikkat. Her iki durumda da sapmalar göz durumlarında büyük farklılıklara neden olabilir. Yedek nemlendiriciler ve nem gidermeciler elinizin altında. Merkezi sistem başarısız olursa, yedekleme ekipmanını kullanarak ortam nemini geri yüklemek için hızlı hareket edin. Bu tür talihsiz gelişmelerin yaz aylarında daha sık olduğunu unutmayın. Ancak, tavşanlarda DED'yi başarılı bir şekilde indüklemek için en kritik üç adım şunlardır: 1) ILG'yi tanımlamak ve Con A enjeksiyonunu yönlendirmek ve onaylamak için ABD görüntülemesinin ustaca kullanılması; 2) Hem ILG'nin hem de SLG'nin iki bölümünün enjeksiyonunun sağlanması; ve 3) güvenilir ve tekrarlanabilir DED parametrelerini tahmin.

Gerekli deneysel beceri geliştirmek önemsiz değildir ama herhangi bir ciddi araştırmacı caydırmak olmamalıdır. Öğrenme eğrisinin beş yineleme içinde tamamlanmasını bekleyin. Makul kalitede bir ABD görüntüleme sistemi esastır. ABD tarafından anatomik özellikleri tanınması önemlidir, bu nedenle, araştırmacı tavşan anatomisi gözden geçirmelidir. Davis tarafından tavşan anatomisi mükemmel açıklaması²⁵, bir klasik, son derece yararlı olabilir. Ayrıca ILG boyutundaki varyasyonu da aklınızda bulundurun. Bunun sonucu, Con A'nın başarısının her zaman takip görüntüleme ile teyit edilmesi gerektiğidir. Tavşan bir grup Con A yanıtı varyasyonları en sık enjeksiyon tekniği (başarısız veya kısmen başarılı enjeksiyon) nedeniyle ya da gözyaşı aşırı üretimi ile telafi etmek için artık lakrimal bezi dokularının kapasitesini göz ardı etmektir. Enjeksiyon tekniğinde ustalaşmak isteyenler için metilen mavisi enjekte etmek ve ardından anatomik diseksiyon yararlı olabilir; gözyaşı bezine ulaşırsa veya komşu dokulara dökülürse görüntüleme sağlanır. Bugüne kadar, bu enjeksiyon yöntemi tek bir komplikasyon olmadan yazarlar tarafından 270 kez üzerinde yapılmıştır.

Yukarıda sunulan DED'nin beş parametresini belirlemesi klinik pratikte ki kararlılıkları kadar zor olabilir. Sirkadiyen varyasyonlar henüz bunların hiçbirinde resmi olarak belgelenmemiş olsa da, göz^28'de bu tür olayların günün aynı saatinde (± 1 saat) tahlil edilmesi gerektiğine dair yeterli arka plan kanıtı vardır (± 1 saat), özellikle tekrar tahliller yapılacak ve birbiriyle karşılaştırılmalı. Bu tahlilleri gerçekleştirirken tutarlılık esastır. İki kişilik bir ekip gereklidir. Bazı adımların katı zamanlama gerektirdiği göz önüne alındığında, aynı odada tahlillere katılan dört veya daha fazla araştırmacı rahatsız edici olabilir. Uygun ve yüksek kaliteli fotoğraf dokümantasyonu, belirtilen yerlerde, önemlidir.

Bu model, ilaç geliştirme çalışmaları için idealdir. Hayvan modeli ve sayme tekniklerinin ustalığı, etkinlik ve güvenlik çalışmalarının mükemmel tekrarlanabilirliğini^19'a sağlamıştır.

Bu güçlü bir deneysel yaklaşımdır, çünkü önceki modellerin şaşırtıcı değişkenliğini ortadan kaldırır, hayvan modelini düzene sokmuştur ve esasen DED'nin beş parametresini standartlaştırmıştır. Bir aday terapötik ajan çalışma için bu modelin başarılı bir uygulama yeni ajanlar umutsuz ihtiyacı olan bir hastalık için bilgilendirici bir hayvan modeli olarak pratik yarar teyit etti ve patogenezinin daha derin bir anlayış.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm macro lens	Canon EF 100mm f/2.8L IS USM	3554B002
26 gauge needles (5/8)	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ	305115	Needles for injecting ConA into the lacrimal glands
27 gauge needles (5/8)	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ	305921	Needles for injecting ConA into the lacrimal glands
Aceproinj (acepromazine)	Henry Schein Animal Health, Dublin, OH	NDC11695-0079-8	0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation
Anesthesia vaporizer	VetEquip, Pleasanton, CA	Item #911103
Bishop Harmon Forceps	Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ	E1500-C	Tissue forceps
Caliper	Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ	E-2404	Caliper used to measure length of needle during ConA injection
Concanavalin A	Sigma, St. Louis, MO	C2010	Make 5mg/ml in PBS for injection into rabbit lacrimal glands
DSLR camera	Canon EOS 7D DSLR	3814B004	Digital single lens reflex camera
fluorescein	AKRON, Lake Forest, IL	NDC17478-253	Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT
Isoflurane	Henry Schein, Melville, NY	29405
Lactoferrin ELISA kit	MyBiosource, San Diego, CA	MBS032049	Measure tear lactoferrin level
lidocaine	Sigma, St. Louis, MO	L5647	1% in PBS for anesthesia agent
macro/ring flash	Canon Macro Ring Lite MR-14EXII	9389B002AA
Osmolarity tips	TearLab Corp., San Diego, CA	#100003 REV R	Measure tear osmolarity
PBS (phosphate buffered saline)	Mediatech, Inc. Manassas, VA	21-031-CV
Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (as described in text)	Charles River Labs, Waltham, MA	2-3 kg	Research animals
Rose Bengal	Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO	NDC51801-004-40	1% in PBS, stain the ocular surface
Schirmer strips	Eaglevision, Katena products. Denville, NJ	AX13613	Measure tear production
Surgical Loupes +1.50	Designs for Vision, Bohemia, NY	Specialty item	Provide magnificantion of ocular surface while observing tear break up and performing Concanavalin A injections.
TearLab Osmometer	TearLab Corp., San Diego, CA	Model #200000W REV A	Measure tear osmolarity
Ultrasound probe	VisualSonics Toronto, Ont	MX 550 S	Untrasonography-guide Con A injection for inferior lacrimal gland