Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר שיטה יעילה עבור הדור היעיל של פלסמידים המבטאים הן את אנזים CRISPR והן את RNA מדריך יחיד (sgRNAs). שיתוף פעולה של תאים יונקים עם וקטור sgRNA / CRISPR זה וקטור כתב לוציפראז כפול הבוחן תיקון הפסקה דו-גדילי מאפשר הערכה של יעילות נוקאאוט.

Abstract

למרות יעיל מאוד, שינוי של אתר גנומי על ידי אנזים CRISPR דורש הדור של sgRNA ייחודי לאתרי היעד מראש. עבודה זו מתארת את הצעדים המרכזיים המובילים לבניית וקטורים SGRNA יעילים באמצעות אסטרטגיה המאפשרת זיהוי יעיל של המושבות החיוביות על ידי PCR לפני רצף DNA. מאחר שעריכת גנום יעילה באמצעות מערכת CRISPR דורשת SGRNA יעילה ביותר, יש צורך בבחירה מוקדמת של יעדי SGRNA של מועמדים כדי לחסוך זמן ומאמץ. מערכת כתב לוציפראז כפולה פותחה כדי להעריך יעילות נוקאאוט על ידי בדיקת תיקון לשבור גדיל כפול באמצעות חיתוק גדיל יחיד. כאן, אנו משתמשים במערכת הכתבים הזו כדי לאסוף את היעד המועדף של xCas9/sgRNA מקטורי SGRNA מועמדים לעריכת גנים ספציפיים. הפרוטוקול המתואר יספק וקטור אנזים sgRNA/CRISPR מועדף בתוך 10 ימים (החל מאוליגונוקלאוטידים מעוצבים כראוי).

Introduction

SGRNAs CRISPR מהווים רצף של 20 נוקלאוטידים (הפרוטו-ספייסר), המשלים את רצף היעד הגנומי1,2. למרות יעילות רבה, היכולת של מערכת CRISPR/Cas לשנות אתר גנומי נתון דורשת יצירת וקטור הנושא sgRNA יעיל ייחודי לאתרי היעד2. מאמר זה מתאר את השלבים המרכזיים בדור של וקטור sgRNA זה.

לעריכת גנום מוצלחת באמצעות מערכת CRISPR/Cas, השימוש sgRNAs יעיל מאוד הוא תנאימוקדםחיוני 3,4,5. מאז גרעין מהונדס המשמש בעריכת הגנום להפגין יעילות מגוונת ב lociממוקד שונים 1, בחירה מראש של מטרות sgRNA מועמד יש צורך כדי לחסוך זמןומאמץ 6,7,8,9. מערכת כתב לוציפראז כפולה פותחה כדי להעריך יעילות נוקאאוט על ידי בדיקת תיקון לשבור גדיל כפול באמצעות גדיל יחיד annealing3,10. כאן אנו משתמשים במערכת כתבים זו כדי לבחור יעד CRISPR sgRNA מועדף ממועמדים שונים sgRNA וקטורים המיועדים לעריכת גנים ספציפיים. הפרוטוקול שצוין כאן יושם במעבדות הקבוצה ושיתוף הפעולה שלנו בשנים האחרונות כדי ליצור ולהעריך את CRISPR sgRNAs.

הפרוטוקול הבא מסכם כיצד לעצב SgRNA מתאים באמצעות תוכנת רשת. לאחר הבחירה sgRNAs המתאימים, אנו מתארים את השלבים השונים כדי להשיג את האוליגונוקלאוטידים הנדרשים, כמו גם את הגישה להכנסת oligonucleotides לזווג לתוך וקטור הביטוי pX330-xCas9. כמו כן, אנו מציגים שיטה להרכבת וקטורים כתב sgRNA-הבעת וגם וקטורים כתב לוציפראז כפול בהתבסס על הקשירה של רצפים אלה לתוך וקטור ביטוי ים-10 (שלבים 2-10, איור 1A). לבסוף אנו מתארים כיצד לנתח את יעילות חיתוך ה-DNA עבור כל sgRNAs (שלבים 11-12).

Protocol

1. עיצוב sgRNA אוליגונוקלאוטיד

  1. עיצוב sgRNAs באמצעות כלים מקוונים כגון הכלי המקוון Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). רצף PAM חשוב בהתבסס על Cas9 בשימוש. עבור xCas9, רצפי PAM הרלוונטיים הם NG והתוחלת הכלי המקוון Cas-Designer לשעבר יכול ליצור xCas9 sgRNAs רלוונטי.
    1. השתמש בכלי עיצוב sgRNA המקיפים אלגוריתמים לחיזוי יעד (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. ציון של 0.2 או יותר הוא מועדף.
  2. בחר עד 3 מטרות לעריכת גנים עבור הקרנה אופטימלית (לדוגמה, T1, T2 ו- T3 תוכננו עבור כבשים DKK2 exon 1 פילוח גנים [טבלה 1]).

2. שינוי אוליגונוקלאוטיד

  1. כדי לשנות את sgRNA oligonucleotide, מחק את המוטיב הסמוך של הפרוטו-SPACER (PAM) של SgRNA, תוך שמירה על רצף הפרוטו-spacer (לדוגמה, רצף התחלתי עבור T1: TGCCTCTCTTCCTACTGGGGCCGC [20 nt]).
  2. הוסף את pentanucleotide CACCG ל 5'-סוף של האוליגו.
    הערה: עם קשירה לשלד pX330-xCas9, רצף זה יכיל את 3'-סוף של U6 מקדם מניע שעתוק sgRNA. המערך "CACC" מבטיח כי האולגו תואם עם overhangs של BbsI מעוכל pX330-xCas9 פלסמיד. הבסיס "G" הוא תנאי מוקדם של מקדמי RNA Polymerase III ומבטיח את האתחול היעיל של שעתוק sgRNA (למשל, צירוף מערך 5'-CACCG לפרוטו-spacer של T1, השגת T1-F: CACCGTGCCTCTCTCTCTGGGGCCGC [25 nt]). יעילות המחשוף של 21 nt gRNA שונה באופן משמעותי מזה של 20 nt gRNA1,12,13,14. מומלץ בדרך כלל להשתמש 20 nt עם 5'-G על ידי יצירת protospacer קצר יותר, אם זה לא אפשרי אז 21 nt עם נוסף 5'-G ניתן להשתמש.
  3. צור השלמה הפוכה (rc) של רצף הפרוטו-spacer.
    הערה: לדוגמה, rc של protospacer T1 הוא GCGGCCAGTAGGAGCAGGCAGGCA (20 nt).
  4. צרף AAAC ל-1.75 מ' של רצף הפרוטו-ספייסר של ה-RC. צרף C נוסף ל-3'-end של הפרוטו-spacer של ה-RC.
    הערה: רצף "AAAC" מבטיח כי oligonucleotide מתאים שיבוט לתוך pX330-xCas9 מעוכל BbsI. נוסף "C"על 3'-end חיוני עבור annealing עם "G" ייזום עבור שעתוק sgRNA המתואר לעיל (למשל, AAACGCGGCCAGTAGGAGAGAGCGCAC [25 nt] הוא רצף oligonucleotide הסופי עבור Protospacer T1 rc).
  5. תזמין את האויגונוקלאוטידים.

3. אוליגונוקלאוטיד

  1. דיללו אוליגונוקלאוטידים לריכוז סופי של 10 μM במים מזוקקים כפולים (ddH2O).
  2. מערבבים מוליגוניקלאוטידים קדמיים ואחורה בצינור PCR דק בקיר, המיצית יחס של 1:1 (לדוגמה, 20 μL כל אחד) מבלי להוסיף מאגר נוסף.
  3. מדגרים את התערובת ב-95°C למשך 5 דקות ולאחר מכן מגלגלים את הטמפרטורה ל-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בצע עם תקופת קירור בטמפרטורת החדר (RT) המורכבת פשוט להסיר את המדגם ממכונה PCR ולמקם אותו ב RT.
    הערה: אין צורך phosphorylate תערובות oligonucleotide כדי להקל על הקשירה.

4. עיכול וקטור SGRNA/CRISPR

  1. לעכל 1 μg של pX330-xCas9 וקטור שנבחר עם BbsI (10 יחידות של אנזים לכל 1 μg של פלסמיד) עבור 2 שעות ב 37 ° C(איור 2). לנהל את העיכול של וקטור ביטוי pX330-xCas9 sgRNA בנפח כולל של 50 μL, המכיל 5 μL של מאגר עיכול 10x ומים מזוקקים כדי להשיג את הכרך הסופי.
  2. לטהר את הווקטור מעוכל על ידי חילוץ הלהקה 2% ג'ל agarose תחת 10 V / ס"מ ולאחר מכן לטהר באמצעות עמודה סיליקה באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מסחרי.

5. קשירה של sgRNA oligonucleotides ההבעה וקטור

  1. מערבבים את ה-sgRNA oligonucleotides (5 μL של התערובת משלב 4) עם וקטור pX330-xCas9 מעוכל BbsI (מטוהר, 100 ng).
  2. להוסיף 1 μL של רצועה ו 1 μL של 10x מאגר רצועה.
  3. להוסיף מים מזוקקים עם נפח המתאים, עד 10 μL.
  4. דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.

6. טרנספורמציה תא מוסמך

  1. להוציא E. coli DH5α תאים מוסמכים מאחסון ב -80 ° C ולהפשיר אותו על קרח.
  2. להוסיף 5 μL של תערובת קשירה 50 μL של חיידקי E. coli DH5α מוסמכים ולשמור את התערובת על קרח במשך 30 דקות.
  3. מחממים את התערובת ב-42 מעלות צלזיוס ל-90 מעלות.
  4. הנח אותו על קרח במשך 2 דקות.
  5. לשחזר את התרבות על שייקר סיבובי ב 500 μL של LB מדיה עבור 1 שעה ב 37 ° C.
  6. צלחת 200 μL של התרבות על צלחת agarose התנגדות התנגדות אאמפיצילין LB דגירה אותו בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס.

7. זיהוי של פלסמידים רקומביננטיים הנכונים על ידי PCR

  1. בחר 5 עד 10 מושבות חיידקים מצלחת LB ולהשתמש בכל אחד מהם כדי לחסן צינור אחד 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של LB מדיה עם 60 מ"ג / מ"ל אמפוצילין.
  2. דגירה את הצינורות על שייקר סיבובי במשך 2-3 שעות.
  3. לבצע זיהוי של פלסמידים רקומביננטיים נכונים באמצעות זוגות פריימר ספציפיים עבור sgRNA oligonucleotides [למשל, פריימר קדימה עבור T1 sgRNA ביטוי וקטור בנייה (T1-F): CACCGTGCCTCTCTCTCTACTGGCCGC, פריימר הפוך (BbsI-R): AAAGTCCCTATTATTGGCGTTAC, הפקת 287 bp amplicon(איור 3).
    1. מכינים את תערובת ה-PCR( שולחן 2).
    2. השתמש בתנאי הרכיבה הבאים של PCR: 95°C למשך 5 דקות לקדם-דה-נטורציה; 30 מחזורים של 95 °C עבור 30 s עבור denaturation, 60 °C עבור 30 s עבור annealing, ו 72 ° C עבור 30 s להארכה. לאחר השלמת 30 מחזורים, לבצע שלב הארכה סופי על ידי חימום במשך 5 דקות ב 72 °C.
    3. הפעל את מוצר PCR על ג'ל agarose 2% תחת 10 V /cm. רצועה בגודל הנכון [למשל, 287 bp] נחשבת חיובית.

8. לאמת את הרצף של ביטוי sgRNA פלסמיד

  1. אמת את רצף המושבות החיוביות PCR על-ידי רצף סנגר15 באמצעות פריימר BbsI-R ההפוך (ראה שלב 7.3). פריימר זה anneals באתר במורד הזרם של sgRNA אוליגו להוסיף. pX330-xCas9-T1 המביע רצף sgRNA המכיל protospacer TGCCTCTCTCTCTACTGGCCCCGCGG ו xCas9 נבנה.
  2. השתמש פריימר קדימה T1-F כדי רצף המושבות החיוביות. קדימה אחד לא יכול לתת מידע רצף מלא עבור האתר המקיף את אתר הכניסה של sgRNA אוליגו, כי 30-50 bp שבר בעקבות פריימר רצף לא ניתן לקרוא בדיוק.

9. בניית וקטור עיתונאי לוציפראז כפול

  1. לסנתז 300-500 bp שברי DNA המכילים את מטרות sgRNA subclone אותו לתוך וקטור כתב לוציפראז כפול באמצעות עיכול כפול [למשל, subclone 440 bp כבשה DKK2 exon1 שבר לתוך pSSA-כפול plasmid16,17 באמצעות עיכול כפול עם AscI ו SalI, וכתוצאה מכך pSSA-כפול-DKK2].
  2. לסנתז 300-500 bp שברי DNA המכילים את מטרות SGRNA. שים לב כי הרצפים של שברי ה-DNA חייבים להיות חלקים של רצפים גנומיים, אשר ניתן להשיג מאתר NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) או הפניות קשורות.
  3. בחר וקטור מתאים לכתב לוציפראז כפול כגון pSSA-Dual16,17 (או שניוקטורים המבטאים גחלילית לוציפראז ורנילה לוציפראז בהתאמה) ולאחר מכן לעכל את הווקטור הזה ואת שברי ה-DNA כאמור לעיל עם שני אנדונוקליאות כגון AscI ו SalI.
  4. לבסוף לתלות את שני השברים האלה עם T4 DNA Ligase, וכתוצאה מכך pSSA-כפול יעד. פרטים על עיכול כפול ורצועה מוצגים בטבלה 3 ובטבלה 4, בהתאמה. ראוי לציין כי וקטור הכתב צריך להיות מוגבר בזני חיידקים יציבים (כגון Top10), אשר מומלץ להיות תרבותי עם מהירות סיבוב נמוכה יותר (בדרך כלל לא יותר מ 200 סל"ד), לצורך הימנעות שילוב מחדש של ה-DNA.

10. תעבירת תאים

  1. לחלץ פלסמידים אנדוטוקסין ללא עבור וקטורים כאמור לעיל. להעריך את הטוהר והריכוז של פלסמידים באמצעות מכשירים מתאימים. ריכוז סופי של לא פחות מ 500 ng/μL ויחס טוהר של 1.7-1.9 בקליטה 260/280 נמיום (A260/A280) מומלצים עבור פלסמידים אלה.
  2. שיתוף תחינה קו תא מתאים כגון PIEC18 עם plasmids בפרופורציה שווה (למשל, pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2 =1:1, 0.5 μg plasmid עבור כל שכפול בעת שימוש 24 צלחת גם). השתמש בוקטור ריק כגון pX330-xCas9 כפקד שלילי.
    1. יום אחד לפני הטרנס-ת'ית, תאי צלחת בצלחת תרבות 24 באר בצפיפות של 2 x 105 תאים / גם. תאים יהיו מוכנים להעברה כאשר הם משיגים התכנסות של 60-80%.
    2. לפני נקודת הזמן transfection, להסיר את supernatant ככל האפשר בעדינות להוסיף 0.5 מ"ל של מדיה רעננה עבור כל באר.
    3. דילל את הטרנס-תירה מחדש במדיה DMEM ביחס של 1:25 ומערבבים היטב.
    4. להכין תערובת מאסטר של DNA על ידי דילול 0.5 μg של ה-DNA ב 25 μL של מדיה DMEM, ולאחר מכן להוסיף 1 μL של ריגנט P3000.
    5. הוסף DNA מדולל לכל שפופרת של reagent טרנסאפציה מדוללת (יחס 1:1).
    6. דגירה במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. להוסיף 50 μL של תסביך ה-DNA-שומנים לתאים.
    8. תאי דגירה במשך 24 שעות ב 37 °C. לאחר מכן, נתח תאים טרנס-נגועים כמו בשלב 11.

11. זיהוי לוציפראז כפול

  1. הכינו כמות מספקת של מאגר הליזה הפסיבי (PLB) של 1x על ידי הוספת נפח אחד של 5x PLB ל-4 כרכים של מים מזוקקים ומערבבים היטב.
  2. מבחינה פסיבית של תאים המתובררים ב-24 צלחות תרבות.
    1. הסר את מדיום הצמיחה מהתאים התורבתים, והחיל בעדינות נפח מספיק של תמיסת מלח פוספט (PBS) כדי לשטוף את פני השטח של כלי התרבות. מערבבים את הכלי לזמן קצר כדי להסיר תאים מנותקים ויום שאריות צמיחה בינוני. הסר לחלוטין את פתרון שטיפה לפני החלת ריאגנט PLB.
    2. לחלק 100 μL של 1x PLB לתוך כל תרבות גם כדי לכסות לחלוטין את מונו-שכבת התא. תנו לוחיות התרבות לעמוד במשך 20 דקות.
    3. מעבירים את הליזייט לצינור או למבחנה להמשך טיפול או אחסון.
  3. להכין את הרסיוג סיסאי luciferase (LAR) על ידי תחליף מחדש את הצוללת לוציפראז שסופקה ב 10 מ"ל של מאגר לוציפראז שסופק.
  4. להכין נפח הולם כדי לבצע את המספר הרצוי של כתב לוציפראז כפול (100 ריאגנט μL לכל כך). הוסף 1 נפח של 50x להפסיק את הצוללת 50 כרכים של מאגר עצירה בצינור פוליפרופילן זכוכית או סיליקון.
  5. כתב לוציפראז כפול (DLR) תסה
    1. התוכנית luminometers כדי לספק עיכוב קריאה מראש של 2 שניות, ואחריו תקופת מדידה של 10 שניות.
    2. Predispense 100 μL של לוציפראז אסאי רייגנט לתוך המספר המתאים של צינורות luminometer כדי להשלים את המספר הרצוי של DLR Assays.
    3. להעביר בזהירות עד 20 μL של תא lysate לתוך צינור luminometer המכיל LAR; מערבבים על-ידי התפתלות 2 או 3 פעמים. מניחים את הצינור במד ההמום ויזמו קריאה.
    4. הסר את הצינור לדוגמה מן luminometer, להוסיף 100 μL של עצירת reagent ומערבולת בקצרה כדי לערבב. החלף את הדגימה בממד הלומינומטר, והחל בקריאה.
    5. להקליט את פעילות renilla luciferase מנורמל לפעילות לוציפראז גחלילית, כל כך הדדי של היחס המוצג על המסך.
    6. זרוק את צינור התגובה, והמשך למאסאה הבאה.

תוצאות

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה הן לבניית וקטורים ביטוי sgRNA ו xCas9 ולאחר מכן עבור הקרנת אופטימיזציה של sgRNA אוליגוס עם יעילות מיקוד גנים גבוהה יחסית. כאן אנו מציגים דוגמה מייצגת של 3 מטרות sgRNA לכבשים DKK2 exon 1. SgRNA ו xCas9 לבטא וקטורים ניתן לבנות על ידי נטיעת עמוד השדרה וקטור (איור 2)...

Discussion

הליכי השיבוט הווקטור sgRNA שתיארנו כאן מקל על ייצור יעיל של sgRNAs, עם רוב העלויות הנגזרות הזמנת oligonucleotide ושורק וקטור. בעוד השיטה המתוארת נועדה לאפשר למשתמשים ליצור sgRNAs לשימוש עם CRISPR/Cas9, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם Cas9 orthologues או אנדונוקלאות מונחה RNA אחרות כגון Cpf1, הצגת שינויים קלים ?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

פרויקט זה מומן על ידי המחלקה הראשונה גראסלאנד מדע משמעת תוכנית של מחוז שאנדונג (סין), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31301936, 31572383), הקרן המיוחדת למחקר אגרו-מדעי באינטרס הציבורי (201403071), הערכת סיכונים לאומית לפרויקט מיוחד של איכות ובטיחות של מוצרי חלב (GJFP201800804) ופרויקטים של מדע וטכנולוגיה של פרנסה של אנשי צ'ינגדאאו (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
A new generation of full touch screen gradient PCR instrumentLongGeneA200Target gene amplification
AscI restriction enzymesNew England BiolabsR0558VCutting target vectors
BbsI restriction enzymeNew England BiolabsR0539SCutting target vectors
Clean workbenchAIRTECHSW-CJ-2FD/VS-1300L-UA partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment
DH5α Competent CellsTaKaRaK613Plasmid vector transformation
Dual-Luciferas Reporter Assay SystemPromegaE1910Dual-luciferas reporter assay
Electric thermostatic water bathSanfa Scientific InstrumentsDK-S24Heating reagent by constant temperature in water bath
ElectrophoresisBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.DYY-6CControl voltage, current, etc.
Eppendorf Reference 2Eppendorf China Ltd.Reference 2Accurately draw and transfer traces of liquid
Gel imaging analyzerBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.WD-9413BFor the analysis of electrophoresis gel images
GloMax 20/20 LuminometerPromegaE5311Detect dual luciferase activity
High speed refrigerated centrifugeBMHsigma 3K15Nucleic acid extraction and purification
Intelligent biochemical incubatorSanfa Scientific InstrumentsSHP-160Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment
LB Broth AgarSangon BiotechA507003-0250For the cultivation of E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent KitThermo FisherL3000015DNA Transfection
SalI restriction enzymesNew England BiolabsR3138VCutting target vectors
SanPrep Column DNA Gel Extraction KitSangon BiotechB518131-0050Recycling DNA fragments
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps KitSangon BiotechB518191-0100Extraction of plasmid DNA
T4 DNA LigaseNew England BiolabsM0202VLink DNA fragment
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0TaKaRa9761DNA purification
Vertical pressure steam sterilizerJIBIMEDLS-50LDHigh temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment
Water bath thermostatChangzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.SHZ-82Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.

References

  1. Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042 (2018).
  2. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  3. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280 (2015).
  4. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  5. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
  6. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
  7. Yang, L., Yang, J. L., Byrne, S., Pan, J., Church, G. M. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. 107, 1-17 (2014).
  8. Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-mediated targeted genome editing in human cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
  9. Vidigal, J. A., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
  10. Mazon, G., Mimitou, E. P., Symington, L. S. SnapShot: Homologous recombination in DNA double-strand break repair. Cell. 142 (4), 646 (2010).
  11. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  12. Lee, J. K., et al. Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity. Nature Communications. 9 (1), 3048 (2018).
  13. Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
  14. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  15. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  16. Ruan, J., et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs. Scientific Reports. 5, 14253 (2015).
  17. Li, K., et al. An plasmid with double fluorescent groups and its application as standard substance. China patent. , (2012).
  18. Li, H., et al. Characterization of the porcine p65 subunit of NF-kappaB and its association with virus antibody levels. Molecular Immunology. 48 (6-7), 914-923 (2011).
  19. Li, H., et al. A pair of sgRNAs targeting porcine RELA gene. China patent. , (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

166CRISPRRNA sgRNAPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved