Costruzione di plasmidi CRISPR e rilevamento dell'efficienza knockout nelle cellule di mammifero attraverso un sistema Dual Luciferase Reporter

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo che descrive un metodo semplificato per la generazione efficiente di plasmidi che esprimono sia l'enzima CRISPR che l'RNA a guida singola associato (sgRNA). La co-trasfezione delle cellule di mammifero con questo vettore sgRNA/CRISPR e un vettore reporter a doppia luciferasi che esamina la riparazione della rottura a doppio filamento consente la valutazione dell'efficienza knockout.

Abstract

Sebbene altamente efficiente, la modifica di un sito genomico da parte dell'enzima CRISPR richiede in anticipo la generazione di uno sgRNA unico per il sito o i siti di destinazione. Questo lavoro descrive i passaggi chiave che portano alla costruzione di vettori sgRNA efficienti utilizzando una strategia che consente il rilevamento efficiente delle colonie positive da parte della PCR prima del sequenziamento del DNA. Poiché un editing efficiente del genoma utilizzando il sistema CRISPR richiede uno sgRNA altamente efficiente, è necessaria una preselezione degli obiettivi di sgRNA candidati per risparmiare tempo e fatica. È stato sviluppato un sistema di reporter a doppia luciferasi per valutare l'efficienza del knockout esaminando la riparazione della rottura a doppio filamento tramite ricottura a singolo filamento. Qui, usiamo questo sistema reporter per raccogliere il target xCas9 / sgRNA preferito dai vettori sgRNA candidati per l'editing genico specifico. Il protocollo delineato fornirà un vettore enzimatico sgRNA/CRISPR preferito in 10 giorni (a partire da oligonucleotidi opportunamente progettati).

Introduzione

Gli sgRNA CRISPR comprendono una sequenza di 20 nucleotidi (il protospazio), che è complementare alla sequenza bersaglio genomica^1,2. Sebbene altamente efficiente, la capacità del sistema CRISPR/Cas di modificare un determinato sito genomico richiede la generazione di un vettore che trasporta uno sgRNA efficiente unico per il sito o i siti di destinazione². Questo documento descrive i passaggi chiave nella generazione di quel vettore sgRNA.

Per un corretto editing del genoma utilizzando il sistema CRISPR/Cas, l'uso di sgRNA altamente efficienti è un^{prerequisito cruciale 3,4,5}. Poiché le nucleasi ingegnerizzate utilizzate nell'editing del genoma manifestano diverse efficienze a diversi loci^{mirati 1,}è necessaria una preselezione degli obiettivi di sgRNA candidati al fine di risparmiare tempo e^{fatica 6,7,8,9}. È stato sviluppato un sistema di reporter a doppia luciferasi per valutare l'efficienza del knockout esaminando la riparazione della rottura a doppio filamento tramite ricottura a^{singolo filamento 3,10}. Qui usiamo questo sistema reporter per scegliere un target di sgRNA CRISPR preferito da diversi vettori sgRNA candidati progettati per l'editing genico specifico. Il protocollo qui indicato è stato implementato nel nostro gruppo e laboratori di collaborazione negli ultimi anni per generare e valutare gli sgRNA CRISPR.

Il seguente protocollo riassume come progettare sgRNA adatti attraverso il software di rete. Una volta selezionati gli sgRNA adatti, descriviamo i diversi passaggi per ottenere gli oligonucleotidi richiesti e l'approccio per inserire gli oligonucleotidi accoppiati nel vettore di espressione pX330-xCas9. Presentiamo anche un metodo per assemblare vettori reporter di sgRNA-expressing e dual luciferase basati sulla legatura di queste sequenze in un vettore di espressione predigerito (passaggi 2-10, Figura 1A). Infine descriviamo come analizzare l'efficienza di taglio del DNA per ciascuno degli sgRNA (passaggi 11-12).

Protocollo

1. design oligonucleotide sgRNA

1. Progetta sgRNA utilizzando strumenti online come lo strumento online Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). La sequenza PAM è importante in base al Cas9 utilizzato. Per xCas9, le sequenze PAM pertinenti sono NG e il primo strumento online Cas-Designer di riferimento può generare sgRNA pertinenti xCas9.
   1. Utilizzare strumenti di progettazione sgRNA che comprendano algoritmi per la previsione on- e off-target (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)¹¹. Si preferisce un punteggio di 0,2 o superiore.
2. Seleziona fino a 3 obiettivi di editing genico per uno screening ottimale (ad esempio, T1, T2 e T3 sono stati progettati per il targeting genico di pecora DKK2 exon 1 [Tabella 1]).

2. Modifica oligonucleottide

1. Per modificare l'oligonucleotide sgRNA, eliminare il motivo adiacente del protospazio 3'-NG (PAM), mantenendo la sequenza protospaziale (ad esempio, sequenza iniziale per T1: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC [20 nt]).
2. Aggiungere il CACCG pentanucleotide al 5'-end dell'oligo.
   NOTA: Dopo la legatura allo scheletro pX330-xCas9, questa sequenza conterrà il 3'-end della trascrizione motivante dello sgRNA motivante U6. L'array "CACC" garantisce che l'oligo corrisponda alle sporgenze del plasmide pX330-xCas9 digerito da BbsI. La base "G" è un prerequisito dei promotori dell'RNA Polimerasi III e garantisce l'effettiva avvio della trascrizione dello sgRNA (ad esempio, aggiungendo l'array 5'-CACCG al protospazio di T1, raggiungendo T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC [25 nt]). L'efficienza di scissione di 21 nt gRNA è significativamente diversa da quella di 20 nt gRNA^1,12,13,14. Si consiglia generalmente di utilizzare 20 nt con 5'-G generando un protospazio più corto, se ciò non è possibile, è possibile utilizzare 21 nt con 5'-G extra.
3. Create un complemento inverso (rc) della sequenza protospaziale.
   NOTA: Ad esempio, l'rc del protospazio T1 è GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt).
4. Aggiungete AAAC all'estremità 5'della sequenza rc protospaziale. Aggiungere una C aggiuntiva all'estremità 3'del protospazio rc.
   NOTA: La sequenza "AAAC" assicura che l'oligonucleotide sia adatto per la clonazione nel plasmide pX330-xCas9 digerito da BbsI. La "C" aggiuntiva sul 3'-end è essenziale per la ricottura con l'avvio "G" per la trascrizione dello sgRNA sopra descritta (ad esempio, AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] è la sequenza oligonucleotide finale per T1 rc protospacer).
5. Ordina gli oligonucleotidi.

3. Ricottura oligonucleotosa

1. Diluire gli oligonucleotidi liofilizzati ad una concentrazione finale di 10 μM in acqua distillata doppia (ddH₂O).
2. Mescolare oligonucleotidi in avanti e indietro in un tubo PCR a parete sottile che combina un rapporto 1:1 (ad esempio, 20 μL ciascuno) senza aggiungere alcun buffer aggiuntivo.
3. Incubare la miscela a 95 °C per 5 minuti e quindi scendere la temperatura a 72 °C per 10 minuti. Seguire con un periodo di raffreddamento a temperatura ambiente (RT) consistente semplicemente nel rimuovere il campione dalla macchina PCR e posizionarlo a RT.
   NOTA: Non è necessario fosforilato le miscele oligonucleotidi per facilitare la legatura.

4. digestione vettoriale sgRNA/CRISPR

1. Digerire 1 μg del vettore pX330-xCas9 selezionato con BbsI (10 unità di enzima per 1 μg di plasmide) per 2 h a 37 °C(Figura 2). Condurre la digestione del vettore di espressione dello sgRNA pX330-xCas9 in un volume totale di 50 μL, contenente 5 μL di tampone di digestione 10x e acqua distillata per ottenere il volume finale.
2. Purificare il vettore digerito per estrazione di banda da un gel di agarosio al 2% sotto i 10 V/cm e successivamente purificare utilizzando una colonna di silice utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale.

5. Legatura degli oligonucleotidi di sgRNA ricotto al vettore di espressione

1. Mescolare gli oligonucleotidi di sgRNA ricotto (5 μL della miscela del passo 4) con il vettore pX330-xCas9 digerito da BbsI (purificato, 100 ng).
2. Aggiungere 1 μL di ligasi e 1 μL di tampone di ligasi 10x.
3. Aggiungere acqua distillata con volume appropriato, fino a 10 μL.
4. Incubare durante la notte a 4 °C.

6. Trasformazione cellulare competente

1. Esezione E. coli DH5α cellule competenti dallo stoccaggio a -80 °C e scongelarla sul ghiaccio.
2. Aggiungere 5 μL della miscela di legatura a 50 μL di E. coli DH5α competente e mantenere la miscela sul ghiaccio per 30 minuti.
3. Scaldare la miscela a 42 °C per 90 s.
4. Appoggialo sul ghiaccio per 2 minuti.
5. Recuperare la coltura su uno shaker rotante in 500 μL di supporti LB per 1 h a 37 °C.
6. Piastra 200 μL della coltura su una piastra di agarosio LB a resistenza all'ampicillina e incubarla durante la notte a 37 °C.

7. Identificazione dei plasmidi ricombinanti corretti da parte della PCR

1. Scegliere da 5 a 10 colonie batteriche dalla piastra LB e utilizzare ognuna di esse per inoculare un tubo da 1,5 ml contenente 1 ml di mezzi LB con 60 mg/mL di ampicillina.
2. Incubare i tubi su uno shaker rotante per 2-3 ore.
3. Effettuare il rilevamento di plasmidi ricombinanti corretti utilizzando coppie primer specifiche per gli oligonucleotidi sgRNA [ad esempio, primer in avanti per la costruzione vettoriale dell'espressione dello sgRNA T1 (T1-F): CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC, primer inverso (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, producendo un amplicon bp 287 (Figura 3)].
   1. Preparare la miscela PCR(tabella 2).
   2. Utilizzare le seguenti condizioni di ciclo PCR: 95 °C per 5 min per la pre-denaturazione; 30 cicli di 95 °C per 30 s per la denaturazione, 60 °C per 30 s per la ricottura e 72 °C per 30 s per l'estensione. Una volta completati i 30 cicli, eseguire una fase finale di estensione riscaldando per 5 minuti a 72 °C.
   3. Eseguire il prodotto PCR su un gel di agarosio al 2% sotto i 10 V/cm. Una banda della giusta dimensione [ad esempio, 287 bp] è considerata positiva.

8. Convalidare la sequenza di plasmide di espressione dello sgRNA

1. Verificare la sequenza di colonie positive PCR sequenziando Sanger^{15 utilizzando} il primer inverso BbsI-R (vedere il passaggio 7.3). Questo primer ricottura nel sito a valle dell'inserto oligo sgRNA. Fu costruito il pX330-xCas9-T1 che esprimeva la sequenza di sgRNA contenente il protospazio TGCCTGCTCCTACTGGCCGCGG e xCas9.
2. Usa il primer in avanti T1-F per sequenziare le colonie positive. Quello in avanti non poteva fornire informazioni complete sulla sequenza per il sito che circondava il sito di inserimento dell'oligo di sgRNA, perché il frammento di 30-50 bp dopo il primer di sequenziamento non poteva essere letto esattamente.

9. Costruzione di doppio vettore reporter luciferasi

1. Sintetizzare frammenti di DNA da 300-500 bp contenenti i bersagli di sgRNA e subclone in un doppio vettore reporter luciferasi attraverso la doppia digestione [ad esempio, subclone 440 bp pecora DKK2 exon1 frammento in pSSA-Dual plasmid^{16,17 utilizzando} doppia digestione con AscI e SalI, risultante pSSA-Dual-DKK2].
2. Sintetizzare frammenti di DNA da 300-500 bp contenenti i bersagli dello sgRNA. Si noti che le sequenze dei frammenti di DNA devono essere parti delle sequenze genomiche, che potrebbero essere ottenute dal sito web ncbi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) o riferimenti correlati.
3. Selezionare un vettore di reporter dual luciferasi adatto come pSSA-Dual^16,17 (o due vettori che esprimono rispettivamente luciferasi lucciola e renilla luciferasi) e quindi digerire questo vettore e i frammenti di DNA sopra indicati con due endonucleasi come AscI e SalI.
4. Infine ligate questi due frammenti con T4 DNA Ligasi, risultando in pSSA-Dual-Target. I dettagli relativi alla doppia digestione e alla legatura sono esposti rispettivamente nella tabella 3 e nella tabella 4. Vale la pena ricordare che il vettore reporter dovrebbe essere amplificato in ceppi batterici stabili (come Top10), che si raccomandano di essere coltivati con una velocità di rotazione inferiore (in genere non più di 200 giri/min), allo scopo di evitare la ricombinazione del DNA.

10. Trasfezione cellulare

1. Estrarre plasmidi senza endotossine per i vettori sopra indicati. Valutare la purezza e la concentrazione dei plasmidi utilizzando strumenti adeguati. Per questi plasmidi sono raccomandati una concentrazione finale non inferiore a 500 ng/μL e un rapporto di purezza di 1,7-1,9 ad assorbanza 260/280 nm (A260/A280).
2. Co-trasfetto una linea cellulare appropriata come PIEC¹⁸ con i plasmidi in proporzione uguale (ad esempio, pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1, 0,5 μg plasmide per ogni duplicazione quando si utilizza 24 piastra del pozzo). Utilizzare un vettore vuoto come pX330-xCas9 come controllo negativo.
   1. Un giorno prima della trasfezione, le cellule della piastra in una piastra di coltura di 24 po 'ad una densità di 2 x 10⁵ cellule / pozzo. Le cellule saranno pronte per la trasfezione quando raggiungono una confluenza del 60-80%.
   2. Prima del punto di tempo di trasfezione, rimuovere il più possibile il supernatante e aggiungere delicatamente 0,5 mL di supporti freschi per ogni pozzo.
   3. Diluire il reagente di trasfezione nei supporti DMEM al rapporto di 1:25 e mescolare bene.
   4. Preparare il master mix di DNA diluire 0,5 μg di DNA in 25 μL di media DMEM, quindi aggiungere 1 μL di reagente P3000.
   5. Aggiungere dna diluito a ogni tubo di reagente di trasfezione diluito (rapporto 1:1).
   6. Incubare per 10-15 minuti a temperatura ambiente.
   7. Aggiungere 50 μL di complesso DNA-lipidico alle cellule.
   8. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C. Quindi, analizzare le cellule trasfette come nel passaggio 11.

11. Rilevamento della doppia luciferasi

1. Preparare una quantità sufficiente del tampone di lisi passiva 1x (PLB) aggiungendo 1 volume di 5x PLB a 4 volumi di acqua distillata e mescolare bene.
2. Lisi passiva delle cellule coltivate in piastre di coltura a 24 pozzi.
   1. Rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule coltivate e applicare delicatamente un volume sufficiente di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per lavare la superficie del contenitore di coltura. Ruotare brevemente il vaso per rimuovere le cellule staccate e il mezzo di crescita residuo. Rimuovere completamente la soluzione di risciacquo prima di applicare il reagente PLB.
   2. Distribuire 100 μL di 1x PLB in ogni bene di coltura per coprire completamente il monostrato cellulare. Lascia riposare i piatti della coltura per 20 minuti.
   3. Trasferire il lysate su un tubo o una fiala per un'ulteriore manipolazione o conservazione.
3. Preparare il reagente del saggio luciferasi (LAR) rimescolando il substrato di dosaggio della luciferasi lyophilizzato fornito in 10 mL del tampone di dosaggio della luciferasi in dotazione.
4. Preparare un volume adeguato per eseguire il numero desiderato di saggi di reporter a doppia luciferasi (100 μL di reagente per saggio). Aggiungere 1 volume di substrato di arresto 50x a 50 volumi di tampone di arresto in un tubo di vetro o polipropilene siliconizzato.
5. Saggio del giornalista a doppia luciferasi (DLR)
   1. Programma i luminometri per fornire un ritardo di pre-lettura di 2 secondi, seguito da un periodo di misurazione di 10 secondi.
   2. Predispense 100 μL di reagente di saggio luciferasi nel numero appropriato di tubi luminometrici per completare il numero desiderato di saggi DLR.
   3. Trasferire con cura fino a 20 μL di lisato cellulare nel tubo del luminometro contenente LAR; mescolare pipettando 2 o 3 volte. Posizionare il tubo nel luminometro e iniziare la lettura.
   4. Rimuovere il tubo campione dal luminometro, aggiungere 100 μL di reagente di arresto e vortice per mescolare brevemente. Sostituire il campione nel luminometro e iniziare la lettura.
   5. Registrare l'attività della renilla luciferasi normalizzata con l'attività della lucciola luciferasi, vale a dire il reciproco del rapporto visualizzato sullo schermo.
   6. Scartare il tubo di reazione e procedere al saggio successivo.

Risultati

I metodi delineati in questo protocollo sono per la costruzione di vettori di espressione sgRNA e xCas9 e quindi per lo screening di ottimizzazione degli oligo sgRNA con efficienze di targeting genico relativamente più elevate. Qui vediamo un esempio rappresentativo di 3 bersagli di sgRNA alle pecore DKK2 esone 1. I vettori di espressione SgRNA e xCas9 possono essere costruiti predigerendo la dorsale vettoriale (Figura 2) seguita legandolo in una serie di brevi frammenti di DNA a d...

Discussione

Le procedure di clonazione vettoriale dello sgRNA che abbiamo descritto qui facilitano la produzione efficiente di sgRNA, con la maggior parte dei costi derivati dall'ordinamento oligonucleotide e dal sequenziamento vettoriale. Mentre il metodo delineato è progettato per consentire agli utenti di generare sgRNA da utilizzare con CRISPR /Cas9, il protocollo può essere facilmente adattato per l'uso con ortologhi Cas9 o altre endonucleasi guidate da RNA come Cpf1, introducendo piccole modifiche alla dorsale vettoriale e a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
A new generation of full touch screen gradient PCR instrument	LongGene	A200	Target gene amplification
AscI restriction enzymes	New England Biolabs	R0558V	Cutting target vectors
BbsI restriction enzyme	New England Biolabs	R0539S	Cutting target vectors
Clean workbench	AIRTECH	SW-CJ-2FD/VS-1300L-U	A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment
DH5α Competent Cells	TaKaRa	K613	Plasmid vector transformation
Dual-Luciferas Reporter Assay System	Promega	E1910	Dual-luciferas reporter assay
Electric thermostatic water bath	Sanfa Scientific Instruments	DK-S24	Heating reagent by constant temperature in water bath
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C	Control voltage, current, etc.
Eppendorf Reference 2	Eppendorf China Ltd.	Reference 2	Accurately draw and transfer traces of liquid
Gel imaging analyzer	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	WD-9413B	For the analysis of electrophoresis gel images
GloMax 20/20 Luminometer	Promega	E5311	Detect dual luciferase activity
High speed refrigerated centrifuge	BMH	sigma 3K15	Nucleic acid extraction and purification
Intelligent biochemical incubator	Sanfa Scientific Instruments	SHP-160	Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment
LB Broth Agar	Sangon Biotech	A507003-0250	For the cultivation of E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit	Thermo Fisher	L3000015	DNA Transfection
SalI restriction enzymes	New England Biolabs	R3138V	Cutting target vectors
SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit	Sangon Biotech	B518131-0050	Recycling DNA fragments
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit	Sangon Biotech	B518191-0100	Extraction of plasmid DNA
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202V	Link DNA fragment
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0	TaKaRa	9761	DNA purification
Vertical pressure steam sterilizer	JIBIMED	LS-50LD	High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment
Water bath thermostat	Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.	SHZ-82	Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.