이중 루시파라제 기자 시스템을 통해 포유류 세포에서 CRISPR 플라스미드 의 건설 및 녹아웃 효율 검출

요약

여기서, CRISPR 효소와 관련 단일 가이드 RNA(sgRNAs)를 모두 발현하는 플라스미드의 효율적인 생성을 위한 간소화된 방법을 설명하는 프로토콜을 제시한다. 이 sgRNA/CRISPR 벡터와 이중 루시파라제 리포터 벡터를 결합하여 포유류 세포의 공동 배빙을 통해 녹아웃 효율을 평가할 수 있습니다.

초록

비록 매우 효율적이지만 CRISPR 효소에 의한 게놈 부위를 수정하려면 표적 부위에 고유한 sgRNA 생성이 사전에 필요합니다. 이 작업은 DNA 염기서열 분석 전에 PCR에 의한 양성 식민지를 효율적으로 검출할 수 있는 전략을 사용하여 효율적인 sgRNA 벡터의 시공으로 이어지는 주요 단계를 설명합니다. CRISPR 시스템을 이용한 효율적인 게놈 편집에는 매우 효율적인 sgRNA가 필요하기 때문에 시간과 노력을 절약하기 위해 후보 sgRNA 표적을 사전 선택해야 합니다. 이중 루시파라제 기자 시스템은 단일 가닥 어닐링을 통해 이중 가닥 브레이크 수리를 검토하여 녹아웃 효율성을 평가하기 위해 개발되었습니다. 여기서, 우리는 특정 유전자 편집을 위한 후보 sgRNA 벡터로부터 선호하는 xCas9/sgRNA 표적을 픽업하기 위하여 이 리포터 시스템을 이용합니다. 설명된 프로토콜은 10일 안에 바람직한 sgRNA/CRISPR 효소 벡터를 제공할 것이다(적절하게 설계된 올리고뉴클레오티드로 시작).

서문

CRISPR sgRNA는 게놈 표적 서열^1,2에상보적인 20-뉴클레오티드 서열(protospacer)을 포함한다. 매우 효율적이지만, CRISPR/Cas 시스템이 주어진 게놈 부위를 수정할 수 있는 능력은 대상 부위(들)에 고유한 효율적인 sgRNA를 운반하는 벡터의 생성을 필요로^{한다 2.} 이 백서는 sgRNA 벡터 생성의 주요 단계를 설명합니다.

CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 성공적인 게놈 편집을 위해 고효율 sgRNAs를 사용하는 것은 중요한 전제 조건^{3,4,5입니다.} 게놈 편집에 사용되는 엔지니어링 뉴클레아제는 상이한 표적 로시^1에서다양한 효율성을 나타내기 때문에, 시간과 노력을 절약하기 위해 후보 sgRNA 표적의 사전 선택이 필요하다^6,7,8,9. 이중 루시파라제 기자 시스템은 단일 가닥 어닐링^3,10을통해 이중 가닥 브레이크 수리를 검사하여 녹아웃 효율을 평가하기 위해 개발되었습니다. 여기서 우리는 특정 유전자 편집을 위해 설계된 상이한 후보 sgRNA 벡터로부터 선호하는 CRISPR sgRNA 표적을 선택하기 위해 이 리포터 시스템을 사용합니다. 여기에 명시된 프로토콜은 CRISPR sgRNA를 생성하고 평가하기 위해 지난 몇 년 동안 우리 그룹과 협력 실험실에서 구현되었습니다.

다음 프로토콜은 네트워크 소프트웨어를 통해 적합한 sgRNA를 설계하는 방법을 요약합니다. 적합한 sgRNA가 선택되면, 우리는 pX330-xCas9 발현 벡터에 쌍을 이루는 올리고뉴클레오티드를 삽입하기 위한 접근법뿐만 아니라 필요한 올리고뉴클레오티드를 얻기 위한 상이한 단계를 설명한다. 또한 이러한 시퀀스의 결찰에 기초하여 sgRNA-표현 및 이중 루시파제 리포터 벡터를 조립하는 방법을 미리 소화된 발현 벡터로 조합한다(단계 2-10, 도 1A). 마지막으로 각 sgRNAs(11-12단계)에 대한 DNA 절단 효율을 분석하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. sgRNA 올리고뉴클레오티드 설계

1. Cas-Designer 온라인 도구(http://www.rgenome.net/cas-designer/)와 같은 온라인 도구를 사용하여 sgRNAs를 디자인합니다. PAM 시퀀스는 사용되는 Cas9을 기반으로 중요합니다. xCas9의 경우 관련 PAM 시퀀스는 NG이며 이전 참조된 Cas-Designer 온라인 도구는 xCas9 관련 sgRNA를 생성할 수 있습니다.
   1. 온/오프 타겟 예측(http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)^11에대한 알고리즘을 포괄하는 sgRNA 설계 도구를 사용합니다. 점수0.2 이상의 점수가 선호됩니다.
2. 최적의 스크리닝을 위한 최대 3개의 유전자 편집 표적을 선택하십시오(예를 들어, T1, T2 및 T3는양 DKK2 엑슨 1 유전자 표적을 대상으로 설계하였다[표 1]).

2. 올리고뉴클레오티드 수정

1. sgRNA 올리고뉴클레오티드를 수정하려면 프로토스페이서 서열(예: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC [20 nt])을 유지하여 3'-NG 프로토스페이스어 인접 모티프(PAM)를 삭제합니다.
2. 오리고의 5 엔드에 펜타뉴클레오티드 CACCG를 추가합니다.
   참고: pX330-xCas9 골격에 대한 결찰시, 이 시퀀스는 sgRNA 전사동기를 부여하는 U6 프로모터의 3'-end를 포함합니다. 배열 "CACC"는 올리고BbsI 소화 pX330-xCas9 플라스미드의 오버행과 일치하는 것을 보장합니다. 기본 "G"는 RNA 폴리머라제 III 프로모터의 전제 조건이며 SgRNA 전사의 효과적인 시작을 보장합니다 (예 : T1의 프로토 스페이스에 5'-CACCG 어레이를 부속시키고 T1-F : CACCGTGCCTCCTACTGGCCCCCCGC [25 nt])를 달성합니다. 21 nt gRNA의 절단 효율은 20 nt gRNA^{1,12,13,14의}것과 크게 다릅니다. 일반적으로 더 짧은 프로토 스페이서를 생성하여 5'-G와 함께 20 nt를 사용하는 것이 좋습니다, 이것이 가능하지 않은 경우 다음 21 추가 5'-G와 21 nt를 사용할 수 있습니다.
3. 프로토스페이서 시퀀스의 역보체(rc)를 만듭니다.
   참고: 예를 들어, T1 프로토스페이서의 rc는 GCGGCCAGTAGGAGCAGCA(20 nt)이다.
4. Rc 프로토스페이서 시퀀스의 5'엔드에 AAAC를 부릅니다. rc 프로토스페이서의 3엔드에 추가 C를 추가로 추가합니다.
   참고: "AAAC" 서열은 올리고뉴클레오티드가 BbsI 소화 pX330-xCas9 플라스미드로 복제하는 데 적합한지 확인합니다. 상기 3엔드에 대한 추가 "C"는 상술한 sgRNA 전사에 대한 "G"를 시정하는 데 필수적이다(예를 들어, AAACGCGGCCAGTAGGAGGAGCAC [25 nt]는 T1 rc 프로토스페이서에 대한 최종 올리고뉴클레오티드 서열이다).
5. 올리고뉴클레오티드를 주문한다.

3. 올리고뉴클레오티드 어닐링

1. 이중 증류수(ddH 2O)에서 10μM의 최종 농도로 리오필화된올리고뉴클레오티드를 희석시하십시오.
2. 추가 버퍼를 추가하지 않고 1:1 비율(예: 20 μL)을 메인태닝하는 얇은 벽 PCR 튜브에서 앞뒤로 올리고뉴클레오티드를 혼합합니다.
3. 혼합물을 95°C에서 5분 동안 배양한 다음 온도를 72°C로 10분 동안 경사로로 내려보도록 합니다. 단순히 PCR 기계에서 샘플을 제거하고 RT에 배치로 구성된 실온 (RT)에서 냉각 기간을 따르십시오.
   참고: 결찰을 용이하게 하기 위해 올리고뉴클레오티드 혼합물을 인계할 필요는 없습니다.

4. sgRNA/CRISPR 벡터 소화

1. 37°C(도2)에서2시간 동안 BbsI(플라스미드 1μg당 10단위 효소)를 선택된 pX330-xCas9 벡터의 다이제스트 1 μg. pX330-xCas9 sgRNA 발현 벡터의 소화를 총 부피 50 μL로 실시하여 10배 소화 버퍼 및 증류수의 5μL을 함유하여 최종 부피를 달성한다.
2. 10 V/cm 미만의 2% 아가로즈 젤에서 대역 추출에 의해 소화된 벡터를 정화하고, 이후 상업용 젤 추출 키트를 사용하여 실리카 컬럼을 사용하여 정화한다.

5. 아닐드 sgRNA 올리고뉴클레오티드의 발현 벡터에 대한 리깅

1. 아닐드 스그RNA 올리고뉴클레오티드(4단계에서 혼합물의 5μL)를 BbsI 소화 pX330-xCas9 벡터(정제, 100 ng)와 혼합한다.
2. 리게아제 1μL과 10배 리구아제 버퍼 1μL를 추가합니다.
3. 증류수를 적절한 부피로 최대 10μL까지 추가합니다.
4. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

6. 유능한 세포 변환

1. 대장균 DH5α 유능한 세포를 -80°C에서 저장하여 얼음 위에 해동하십시오.
2. 유능한 대장균 DH5α의 50 μL에 결찰 믹스의 5 μL을 추가하고 30 분 동안 얼음에 혼합물을 유지합니다.
3. 혼합물을 42°C에서 90s로 열 충격.
4. 2 분 동안 얼음에 휴식.
5. 37°C에서 1시간 동안 LB 배지의 500 μL에서 로터리 셰이커의 배양을 회복한다.
6. 플레이트 200 μL 에 암피실린 저항 LB 아가로즈 플레이트에 배양하고 37 °C에서 하룻밤 을 배양.

7. PCR에 의한 올바른 재조합 플라스미드 식별

1. LB 플레이트에서 5 ~10 개의 세균 성 식민지를 선택하고 각각을 사용하여 60 mg / mL 암피실린으로 LB 미디어 1 mL을 포함하는 1.5 mL 튜브를 접종하십시오.
2. 2-3 시간 동안 회전 셰이커에 튜브를 배양합니다.
3. SgRNA 올리고뉴클레오티드에 대한 특정 프라이머 쌍을 사용하여 올바른 재조합 플라스미드의 검출을 수행합니다[예를 들어, T1 sgRNA 발현 벡터 시공(T1-F): CACCGTGCCTCCTCCTACTGGCCGC, 역프라이머(BbsI-R): AAAGTCCCCCTTTTGTGTCGTTTCGTT-2[1][2].
   1. PCR혼합물(표 2)을준비합니다.
   2. 다음 PCR 사이클링 조건을 사용하십시오: 95°C5 분 동안 5분 동안 사전 데칭; 30 °C의 95 °C의 30 사이클은 30 s에 대한 데니앤링을 위한 30 s, 확장을 위한 30s용 72°C. 30사이클이 완료된 후, 72°C에서 5분 동안 가열하여 최종 연장 단계를 수행한다.
   3. PCR 제품을 10 V/cm 미만의 2% 아가로즈 젤로 실행합니다. 적당한 크기의 밴드[예를 들어, 287 bp]는 양성으로 간주됩니다.

8. sgRNA 발현 플라스미드의 시퀀스 검증

1. 역프라이머 BbsI-R을사용하여 Sanger 시퀀싱^15에 의해 PCR 양성 콜로니의 순서를 확인합니다(단계 7.3 참조). sgRNA 올리고 인서트의 사이트 다운스트림에서 이 프라이머 탄음. pX330-xCas9-T1발성스RNA 서열을 발현하는 프로토스페이스R TGCCTGCTCCTGGCCGCGGGG및 xCas9가 구성되었다.
2. 전방 프라이머 T1-F를 사용하여 양수 콜로니를 시퀀스합니다. 시퀀싱 프라이머 에 이어 30-50 bp 단편이 정확하게 판독할 수 없기 때문에 전방은 sgRNA 올리고의 삽입 부위를 둘러싼 부위에 대한 완전한 서열 정보를 제공할 수 없었다.

9. 이중 루시파라제 기자 벡터 의 건설

1. SgRNA 표적을 함유한 300-500 bp DNA 단편을 이중 소화(예를 들어, 서브클론 440bp 양 DKK2 엑슨1 단편을 pSSA-Dual plasmid^16,17)로 이중 루시파아제 리포터 벡터로 서브클론하여 SCI및 SI-SI를 이용한 이중 다이제스트를 사용하여 생성한다.
2. sgRNA 표적을 포함하는 300-500 bp DNA 단편을 합성합니다. DNA 단편의 서열은 NCBI 웹사이트(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 또는 관련 참조로부터 얻을 수 있는 게놈 서열의 일부여야 합니다.
3. pSSA-Dual^16,17(또는 반딧불 루시파라를 각각 표현하는 두 개의 벡터)와 같은 적합한 이중 루시파라제 기자 벡터를 선택한 다음 이 벡터와 DNA 조각을 AscI 및 SalI와 같은 두 개의 엔도니셀로 소화한다.
4. 마지막으로 T4 DNA 리간아제로 이 두 조각을 리게이트하여 pSSA-Dual-Target으로 이 결과로 나아갑니다. 이중 소화 및 결찰에 대한 세부 정보는 표 3과 표 4에각각 표시됩니다. 리포터 벡터는 DNA 재조합을 피하기 위해 낮은 회전 속도(일반적으로 200rpm 이하)로 배양하는 것이 좋습니다 안정적인 박테리아 균주(Top10)에서 증폭되어야 한다는 점을 언급할 필요가 있다.

10. 세포 질주

1. 위에 명시된 벡터에 대한 내독소가 없는 플라스미드를 추출합니다. 적합한 계측기는 플라스미드의 순도와 농도를 평가한다. 흡수도 260/280 nm(A260/A280)에서 500 ng/μL 이하의 최종 농도와 순도 비 1.7-1.9(A260/A280)를 권장합니다.
2. 동일한 비율로 플라스미드와 PIEC^18과 같은 적절한 세포줄을 공동 transfect (예를 들어, pX330-xCas9-T1: pSSSA-Dual-DKK2=1:1, 0.5 μg 플라스미드 24 웰 플레이트를 사용할 때). pX330-xCas9와 같은 빈 벡터를 음수 컨트롤로 사용합니다.
   1. 1일 전, 24웰 배양판에 있는 플레이트 셀은 2 x 10⁵ 셀/웰의 밀도로. 세포는 60-80 %의 합류를 달성 할 때 형질 전환에 대한 준비가 될 것입니다.
   2. 대입 시간 점 전에, 가능한 한 많은 상체를 제거하고 부드럽게 각 우물에 대한 신선한 미디어의 0.5 mL을 추가합니다.
   3. DMEM 미디어에서 1:25의 비율로 트랜스페션 시약을 희석하고 잘 섞습니다.
   4. DMEM 매체의 25 μL에 DNA의 0.5 μg를 희석시켜 DNA의 마스터 믹스를 준비한 다음 P3000 시약의 1 μL을 추가합니다.
   5. 희석된 형질 전환 시약의 각 튜브에 희석 된 DNA를 추가하십시오 (1:1 비율).
   6. 실온에서 10-15분 동안 배양하십시오.
   7. DNA 지질 복합체 50μL을 세포에 추가합니다.
   8. 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양한다. 그런 다음 11단계에서와 같이 감염된 세포를 분석합니다.

11. 이중 루시파아제 검출

1. 증류수 4권에 5x PLB 1부피를 첨가하여 1x 수동 용해 버퍼(PLB)의 충분한 양을 준비하고 잘 섞는다.
2. 24웰 배양판에서 배양된 세포의 수동용용.
   1. 배양 된 세포에서 성장 배지를 제거하고 배양 용기의 표면을 세척하기 위해 충분한 인산완충식염수(PBS)를 부드럽게 적용합니다. 분리된 세포와 잔류 성장 배지를 제거하기 위해 혈관을 잠시 소용돌이시다. PLB 시약을 적용하기 전에 헹구기 용액을 완전히 제거합니다.
   2. 세포 단층을 완전히 커버하기 위해 각 배양에 1x PLB의 100 μL을 분배합니다. 문화 접시가 20 분 동안 서있게하십시오.
   3. 추가 처리 또는 보관을 위해 용하를 튜브 또는 유리병으로 전송합니다.
3. 제공된 루시파라제 분석 기판의 10mL에서 제공된 리오필화 분석 분석기기판을 10mL로 재보아 루시파아제 분석 분석 시약(LAR)을 준비한다.
4. 이중 루시파라제 기자 분석의 원하는 수를 수행하기 위해 적절한 볼륨을 준비 (분석사당 100 μL 시약). 유리 또는 실리콘 폴리 프로필렌 튜브에 정지 버퍼의 50 볼륨에 50 배 정지 기판의 1 볼륨을 추가합니다.
5. 이중 루시파라제 기자 (DLR) 분석
   1. 프로그램 발광계는 2초 사전 판독 지연을 제공하고 10초 측정 기간을 제공합니다.
   2. 프리디스펜스 100 μL의 루시파라제 분석 시약은 적절한 수의 광미계 튜브로 시약되어 원하는 수의 DLR 분석제를 완료합니다.
   3. LAR를 함유한 광미계 튜브로 최대 20 μL의 세포 리세이트까지 조심스럽게 전송; 2~ 3회 피펫팅하여 섞는다. 튜브를 광미계에 놓고 읽기를 시작합니다.
   4. 요광계에서 샘플 튜브를 제거하고 100 μL의 정지 시약및 소용돌이를 짧게 추가하여 섞습니다. 발광계의 샘플을 교체하고 읽기를 시작합니다.
   5. 반딧불 루시파아제 활동, 즉 화면에 표시되는 비율의 상호 작용으로 정규화된 레닐라 루시파라제 활동을 기록합니다.
   6. 반응 튜브를 버리고 다음 분석으로 진행합니다.

결과

이 프로토콜에 설명된 방법은 sgRNA 및 xCas9 발현 벡터의 시공을 위한 다음 상대적으로 높은 유전자 표적화 효율을 가진 sgRNA 올리고스의 최적화 스크리닝을 위한 것이다. 여기서 는 양 DKK2 엑슨 1에 대한 3sgRNA 표적의 대표적인 예를 표시합니다. SgRNA 및 xCas9 발현 벡터는 벡터 백본(그림2)을예소화한 다음, 어닐링 올리고 쌍을 통해 짧은 이중 가닥 DNA 단편을 연이어 계게 함...

토론

우리가 여기서 설명한 sgRNA 벡터 복제 절차는 올리고뉴클레오티드 주문 및 벡터 시퀀싱에서 파생된 대부분의 비용으로 sgRNAs의 효율적인 생산을 용이하게 합니다. 설명된 방법은 사용자가 CRISPR/Cas9와 함께 사용하기 위해 sgRNA를 생성할 수 있도록 설계되었지만, 프로토콜은 Cas9 정형소또는 Cpf1과 같은 다른 RNA 유도 엔도넬리스와 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수 있으며 벡터 백본 및 올리고뉴클레...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
A new generation of full touch screen gradient PCR instrument	LongGene	A200	Target gene amplification
AscI restriction enzymes	New England Biolabs	R0558V	Cutting target vectors
BbsI restriction enzyme	New England Biolabs	R0539S	Cutting target vectors
Clean workbench	AIRTECH	SW-CJ-2FD/VS-1300L-U	A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment
DH5α Competent Cells	TaKaRa	K613	Plasmid vector transformation
Dual-Luciferas Reporter Assay System	Promega	E1910	Dual-luciferas reporter assay
Electric thermostatic water bath	Sanfa Scientific Instruments	DK-S24	Heating reagent by constant temperature in water bath
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C	Control voltage, current, etc.
Eppendorf Reference 2	Eppendorf China Ltd.	Reference 2	Accurately draw and transfer traces of liquid
Gel imaging analyzer	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	WD-9413B	For the analysis of electrophoresis gel images
GloMax 20/20 Luminometer	Promega	E5311	Detect dual luciferase activity
High speed refrigerated centrifuge	BMH	sigma 3K15	Nucleic acid extraction and purification
Intelligent biochemical incubator	Sanfa Scientific Instruments	SHP-160	Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment
LB Broth Agar	Sangon Biotech	A507003-0250	For the cultivation of E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit	Thermo Fisher	L3000015	DNA Transfection
SalI restriction enzymes	New England Biolabs	R3138V	Cutting target vectors
SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit	Sangon Biotech	B518131-0050	Recycling DNA fragments
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit	Sangon Biotech	B518191-0100	Extraction of plasmid DNA
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202V	Link DNA fragment
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0	TaKaRa	9761	DNA purification
Vertical pressure steam sterilizer	JIBIMED	LS-50LD	High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment
Water bath thermostat	Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.	SHZ-82	Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.