Строительство плазмидов CRISPR и обнаружение эффективности нокаутов в клетках млекопитающих с помощью системы репортеров Dual Luciferase

Резюме

Здесь мы представляем протокол, описывающий обтекаемый метод эффективного поколения плазмидов, выражающей как фермент CRISPR, так и связанные с ним одногидные РНК (sgRNAs). Ко-трансфекции клеток млекопитающих с этим вектором sgRNA/CRISPR и двойной вектор люциферазы репортер, который рассматривает двойной прядь перерыв ремонт позволяет оценку эффективности нокаута.

Аннотация

Несмотря на высокую эффективность, модификация геномного участка ферментом CRISPR требует заранее генерации sgRNA, уникальной для целевого участка. В этой работе описаны ключевые шаги, ведущие к строительству эффективных векторов sgRNA с использованием стратегии, которая позволяет эффективно обнаруживать положительные колонии ПЦР до секвенирования ДНК. Поскольку эффективное редактирование генома с использованием системы CRISPR требует высокоэффективной sgRNA, предварительный отбор кандидатов sgRNA целей необходимо, чтобы сэкономить время и усилия. Двойная система репортер luciferase была разработана для оценки эффективности нокаута путем изучения двойной пряди перерыва ремонт через одну прядь annealing. Здесь мы используем эту систему репортеров, чтобы подобрать предпочтительную цель xCas9/sgRNA от векторов кандидата sgRNA для конкретного редактирования генов. Протокол, изложенный обеспечит предпочтительный вектор фермента sgRNA/CRISPR в течение 10 дней (начиная с надлежащим образом разработанных олигонуклеотидов).

Введение

SgRNAs CRISPR состоит из 20-нуклеотидной последовательности (протопространственника), которая дополняет геномную целевую^{последовательность 1,2.} Несмотря на высокую эффективность, способность системы CRISPR/Cas изменять данный геномный сайт требует генерации вектора, несущего эффективную sgRNA, уникальную для целевого сайта^{(ы) 2.} В настоящем документе описаны ключевые шаги в генерации этого вектора sgRNA.

Для успешного редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas использование высокоэффективных sgRNAs является важнейшим^{условием 3,4,5.} Так как инженерии нуклеазы, используемые в редактировании генома проявляется разнообразная эффективность на различных целевых^{локусов 1}, предварительный отбор кандидатов sgRNA целей необходимо для того, чтобы^{сэкономить время и усилия 6,7,8,9}. Двойная система репортер luciferase была разработана для оценки эффективности нокаута, изучая двойной пряди перерыв ремонт через одну прядь annealing^3,10. Здесь мы используем эту систему репортеров, чтобы выбрать предпочтительную цель CRISPR sgRNA из различных векторов sgRNA кандидата, предназначенных для конкретного редактирования генов. Протокол, заявленный здесь, был реализован в нашей группе и сотрудничающих лабораториях в течение последних нескольких лет для создания и оценки CRISPR sgRNAs.

Следующий протокол подводит итоги, как разработать подходящую sgRNA через сетевое программное обеспечение. После выбора подходящих sgRNAs мы описываем различные шаги для получения необходимых олигонуклеотидов, а также подход к вставке парных олигонуклеотидов в вектор выражения pX330-xCas9. Мы также представляем метод для сборки sgRNA-экспрессии и двойной люциферазы репортер векторов на основе перевязки этих последовательностей в препереваренный вектор выражения (шаги 2-10, рисунок 1A). Наконец, мы описываем, как проанализировать эффективность сокращения ДНК для каждого из sgRNAs (шаги 11-12).

протокол

1. конструкция sgRNA oligonucleotide

1. Дизайн sgRNAs с помощью онлайн-инструментов, таких как Cas-Designer онлайн инструмент (http://www.rgenome.net/cas-designer/). Последовательность PAM важна на основе используемого Cas9. Для xCas9, соответствующие последовательности PAM являются NG и бывший упомянутый Cas-Designer онлайн инструмент может генерировать xCas9 соответствующих sgRNAs.
   1. Используйте инструменты проектирования sgRNA, которые охватывают алгоритмы для прогнозирования на и вне цели (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)¹¹. Предпочтительнее оценка 0,2 или больше.
2. Выберите до 3 целей редактирования генов для оптимального скрининга (например, T1, T2 и T3 были разработаны для овец DKK2 exon 1 ген ориентации -Таблица 1).

2. Модификация олигонуклеотида

1. Чтобы модифицировать sgRNA oligonucleotide, удалите 3'-NG протопространственный смежный мотив (PAM), сохраняя последовательность протопространственника (например, начальная последовательность для T1: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC (20 nt).
2. Добавьте пентануклеотид CACCG к 5'-конец олиго.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После перевязки на скелет pX330-xCas9, эта последовательность будет содержать 3'-конец U6 промоутер мотивации sgRNA транскрипции. Массив "CACC" гарантирует, что олиго соответствует свесам bbsI-перевариваемой плазмиды pX330-xCas9. Базовая "G" является обязательным условием промоутеров РНК-полимеразы III и гарантирует эффективный запуск транскрипции sgRNA (например, приложение массива 5'-CACCG к протопространству T1, достижение T1-F: CACCGTGCCTCTCTACTGGCCGC (25 nt). Эффективность расщепления 21 nt gRNA значительно отличается от 20 nt gRNA^1,12,13,14. Как правило, рекомендуется использовать 20 nt с 5'-G, генерируя более короткий протопространитель, если это невозможно, то 21 nt с дополнительными 5'-G могут быть использованы.
3. Создайте обратный комплект (rc) последовательности протопространственного.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, rc протопространца T1 является GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt).
4. Прим. AAAC к 5'-конец последовательности rc protospacer. Примыкать дополнительный C к 3'-конец rc protospacer.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность "AAAC" гарантирует, что олигонуклеотид подходит для клонирования в bbsI-переваривается pX330-xCas9 плазмида. Дополнительные "C" на 3'-конец имеет важное значение для annealing с инициированием "G" для транскрипции sgRNA описано выше (например, AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC (25 nt) является окончательным oligonucleotide последовательность для T1 rc протопространственник).
5. Закажите олигонуклеотиды.

3. Олигонуклеотид аннеалирование

1. Разбавить лиофилизированные олигонуклеотиды до конечной концентрации 10 МКМ в двойной дистиллированной воде (ddH₂O).
2. Смешайте вперед и обратное олигонуклеотидов в тонкой стенке ПЦР трубки maintaning 1:1 соотношение (например, 20 йл каждый) без добавления каких-либо дополнительных буфера.
3. Инкубировать смесь при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем рампы вниз температуры до 72 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Следуйте с периодом охлаждения при комнатной температуре (RT), состоящий из простого удаления образца из машины ПЦР и размещения его на RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно фосфорилировать олигонуклеотидные смеси для облегчения перевязки.

4. переваривание вектора sgRNA/CRISPR

1. Дайджест 1 мкг выбранного вектора pX330-xCas9 с bbsI (10 единиц фермента на 1 мкг плазмиды) для 2 ч при 37 градусах Цельсия(рисунок 2). Проведи пищеварение вектора экспрессии pX330-xCas9 в общем объеме 50 МКЛ, содержащего 5 МКЛ буфера пищеварения 10x и дистиллированной воды для достижения конечного объема.
2. Очистить переваренный вектор путем извлечения полосы из 2% агарозного геля под 10 В/см и впоследствии очистить с помощью колонки кремнезема с помощью коммерческого комплекта извлечения геля.

5. Перевязка аннальных олигонуклеотидов sgRNA к вектору выражения

1. Смешайте анналированную sgRNA олигонуклеотиды (5 мкл смеси из шага 4) с bbsI-усваиваемым вектором pX330-xCas9 (очищенный, 100 нг).
2. Добавьте 1 мл лигазы и 1 йл буфера 10x лигазы.
3. Добавьте дистиллированную воду с соответствующим объемом, до 10 мл.
4. Инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию.

6. Компетентная трансформация клеток

1. Вывихит из хранилища компетентные клетки E. coli DH5 и оттаивать их на льду при -80 градусов по Цельсию.
2. Добавьте 5 мкл перевязки смеси до 50 мкл компетентной кишечной палочки DH5 и держите смесь на льду в течение 30 мин.
3. Тепло удар смеси при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 90 с.
4. Отдых на льду в течение 2 мин.
5. Восстановите культуру на роторном шейкере в 500 МКЛ ЛГ-медиа на 1 ч при 37 градусов по Цельсию.
6. Плита 200 МКЛ культуры на ампициллин сопротивление LB агарозной пластины и инкубировать его на ночь при 37 градусов по Цельсию.

7. Определение правильной рекомбинантной плазмиды ПЦР

1. Выберите от 5 до 10 бактериальных колоний из пластины LB и используйте каждую из них, чтобы привить одну трубку 1,5 мл, содержащую 1 мл ЛБ-медиа с 60 мг/мл ампициллина.
2. Инкубировать трубки на роторный шейкер в течение 2-3 ч.
3. Провести обнаружение правильных рекомбинантных плазмидов с помощью конкретных праймер пар для sgRNA oligonucleotides , например, впередгрунтовкидля T1 sgRNA экспрессии векторной конструкции (T1-F): CACCGTGCGCTCCTACTGGGGCCGC, обратный грунт (BbsI-R): AAAGTCCATTGGTTAC
   1. Подготовка смеси ПЦР(таблица 2).
   2. Используйте следующие условия езды на велосипеде ПЦР: 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут для недоношенных; 30 циклов по 95 градусов по Цельсию для денатурации, 60 градусов по Цельсию для аннеаляции и 72 градуса по Цельсию для расширения. После завершения 30 циклов выполните заключительный шаг расширения, нагревая в течение 5 минут при 72 градусах Цельсия.
   3. Вы запустите продукт ПЦР на 2% агарозный гель под 10 В/см. Группа нужного размера (например, 287 б.п.) считается положительной.

8. Проверить последовательность плазмидной экспрессии sgRNA

1. Проверить последовательность положительных колоний ПЦР с помощью последовательности Sanger^{15 с помощью} обратного грунтовки BbsI-R(см. шаг 7.3). Это грунтовка anneals на сайте вниз по течению от sgRNA олиго вставки. Был построен pX330-xCas9-T1, выражаюющий последовательность sgRNA, содержащую протопространство TGCCTGCTCCTACTGGGCGG и xCas9.
2. Используйте перемотка вперед T1-F для последовательности положительных колоний. Передняя не смогла дать полную информацию последовательности для места окружая место вставки олиго sgRNA, потому что 30-50 bp фрагмент следуя за грунтовкой последовательности не смогли точно быть прочитаны вне.

9. Строительство двойного вектора репортер люциферазы

1. Синтезировать 300-500 bp фрагменты ДНК, содержащие цели sgRNA и субклон его в двойной вектор люциферазы репортера через двойное пищеварение , например, субклон 440 bp овец DKK2 exon1 фрагмент в pSSA-Dual плазмида^16,17 с помощью двойного пищеварения с AscI и SalI, в результате ПССА-Дуал-DKK2.
2. Синтезировать 300-500 bp фрагментов ДНК, содержащих цели sgRNA. Обратите внимание, что последовательности фрагментов ДНК должны быть частями геномных последовательностей, которые могут быть получены с веб-сайта NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) или связанных с ними ссылок.
3. Выберите подходящий двойной вектор люциферазы репортер, таких как pSSA-Dual^16,17 (или два вектора, выражают светлячок люцифераза и ренилла люцифераза соответственно), а затем переварить этот вектор и^{фрагменты ДНК,} оказано выше, с двумя эндонуклеазами, такими как AscI и SalI.
4. Наконец ligate эти два фрагмента с T4 ДНК Ligase, в результате чего pSSA-двойной цели. Подробная информация о двойном пищеварении и перевязки отображается в таблице 3 и таблице 4соответственно. Стоит отметить, что вектор репортеров следует усиливать при стабильных штаммах бактерий (таких как Top10), которые рекомендуется культурировать с меньшей скоростью вращения (обычно не более 200 об/мин), чтобы избежать рекомбинации ДНК.

10. Трансфекция клеток

1. Экстракт эндотоксин-свободных плазмидов для векторов, заявленных выше. Оцените чистоту и концентрацию плазмидов с помощью подходящих инструментов. Для этих плазмидов рекомендуется окончательная концентрация не менее 500 нг/йл и соотношение чистоты 1,7-1,9 при поглощении 260/280 нм (A260/A280).
2. Со-трансфект соответствующей клеточной линии, такие как PIEC¹⁸ с плазмидами в равной пропорции (например, pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2-1:1, 0,5 мкг плазмида для каждого дублирования при использовании 24 пластины хорошо). Используйте пустой вектор, такой как pX330-xCas9 в качестве отрицательного контроля.
   1. За день до трансфекции, пластины клеток в 24-хорошо культуры пластины при плотности 2 х 10^{5 клеток} / хорошо. Клетки будут готовы к трансфекции, когда они достигнут слияния 60-80%.
   2. Перед точкой времени трансфекции удалите супернатант как можно больше и аккуратно добавьте 0,5 мл свежих средств массовой информации для каждой хорошо.
   3. Разбавить трансфектный реагент в DMEM-средствах при соотношении 1:25 и хорошо перемешать.
   4. Подготовьте мастер-микс ДНК, разбавляя 0,5 мкг ДНК в 25 МКЛ DMEM-медиа, а затем добавьте 1 МКЛ реагента P3000.
   5. Добавьте разбавленную ДНК в каждую трубку разбавленного трансфектного реагента (1:1).
   6. Инкубация в течение 10-15 мин при комнатной температуре.
   7. Добавьте к клеткам 50 МКЛ ДНК-липидного комплекса.
   8. Инкубационые клетки в течение 24 ч при 37 градусах Цельсия. Затем проанализируйте трансфицированные клетки, как в шаге 11.

11. Обнаружение двойной люциферазы

1. Подготовьте достаточное количество 1x пассивного буфера лиза (PLB), добавив 1 том 5x PLB до 4 томов дистиллированной воды и хорошо перемешать.
2. Пассивныйлиз клеток, выученных в 24-колодец культурных пластин.
   1. Удалите среду роста из культурных клеток и аккуратно нанесите достаточный объем фосфатного буферного солевого раствора (PBS) для мытья поверхности культурного сосуда. Закружить сосуд кратко, чтобы удалить отдельные клетки и остаточной среды роста. Полностью удалите раствор полоскания перед нанесением реагента PLB.
   2. Выпределите 100 МКЛ 1x PLB в каждую культуру хорошо, чтобы полностью покрыть монослой клетки. Пусть культурные тарелки стоят 20 минут.
   3. Перенесите лисат в трубку или флакон для дальнейшей обработки или хранения.
3. Подготовка люциферазы анализ реагента (LAR) путем повторного анализа при условии лиофилизированных люциферазы анализ субстрата в 10 мл поставляемого буфера анализа люциферазы.
4. Подготовьте достаточный объем для выполнения желаемого количества анализов репортеров с двойным люциферазой (100 реагентов в соответствии с анализом). Добавьте 1 том 50-х стоп-субстрата к 50 томам стоп-буфера в стеклянной или силиконовой полипропилеевой трубке.
5. Двойная люцифераза репортер (DLR) анализ
   1. Программные люминометры для обеспечения 2-секундной предварительной задержки чтения, а затем 10-секундный период измерения.
   2. Предрасполагает 100 Л люциферазы анализ реагента в соответствующее количество люминометровых трубок для завершения желаемого количества DLR анализов.
   3. Тщательно перенесите до 20 МКЛ лизоляции клеток в люминометровую трубку, содержащую LAR; смешать с помощью пипетки 2 или 3 раза. Поместите трубку в люминометр и инициировать чтение.
   4. Удалите образец трубки из люминометра, добавьте 100 МКЛ стоп-реагента и вихрь кратко перемешать. Замените образец в люминометре и инициируют чтение.
   5. Запись ренилла люцифераза активность нормализовалась к активности светлячка люциферазы, а именно взаимное соотношение отображается на экране.
   6. Отбросьте реакционной трубки, и перейти к следующему анализу.

Результаты

Методы, изложенные в этом протоколе, для строительства векторов экспрессии sgRNA и xCas9, а затем для оптимизации скрининга sgRNA oligos с относительно более высокой эффективностью таргетинга генов. Здесь мы помечим репрезентативный пример 3 целей sgRNA для овец DKK2 exon 1. SgRNA и xCas9 выражая векторы ...

Обсуждение

Описанные здесь процедуры клонирования вектора sgRNA облегчают эффективное производство sgRNAs, при этом большая часть затрат приходится на заказ олигонуклеотида и секвенирование векторов. В то время как изложенный метод предназначен, чтобы позволить пользователям генерировать sgRNAs для и?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A new generation of full touch screen gradient PCR instrument	LongGene	A200	Target gene amplification
AscI restriction enzymes	New England Biolabs	R0558V	Cutting target vectors
BbsI restriction enzyme	New England Biolabs	R0539S	Cutting target vectors
Clean workbench	AIRTECH	SW-CJ-2FD/VS-1300L-U	A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment
DH5α Competent Cells	TaKaRa	K613	Plasmid vector transformation
Dual-Luciferas Reporter Assay System	Promega	E1910	Dual-luciferas reporter assay
Electric thermostatic water bath	Sanfa Scientific Instruments	DK-S24	Heating reagent by constant temperature in water bath
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C	Control voltage, current, etc.
Eppendorf Reference 2	Eppendorf China Ltd.	Reference 2	Accurately draw and transfer traces of liquid
Gel imaging analyzer	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	WD-9413B	For the analysis of electrophoresis gel images
GloMax 20/20 Luminometer	Promega	E5311	Detect dual luciferase activity
High speed refrigerated centrifuge	BMH	sigma 3K15	Nucleic acid extraction and purification
Intelligent biochemical incubator	Sanfa Scientific Instruments	SHP-160	Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment
LB Broth Agar	Sangon Biotech	A507003-0250	For the cultivation of E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit	Thermo Fisher	L3000015	DNA Transfection
SalI restriction enzymes	New England Biolabs	R3138V	Cutting target vectors
SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit	Sangon Biotech	B518131-0050	Recycling DNA fragments
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit	Sangon Biotech	B518191-0100	Extraction of plasmid DNA
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202V	Link DNA fragment
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0	TaKaRa	9761	DNA purification
Vertical pressure steam sterilizer	JIBIMED	LS-50LD	High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment
Water bath thermostat	Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.	SHZ-82	Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.