Construção de Plasmids CRISPR e Detecção de Eficiência de Nocaute em Células Mamíferas através de um Sistema de Repórteres Dual Luciferase

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo um método simplificado para a geração eficiente de plasmídeos expressando tanto a enzima CRISPR quanto o RNA guia único associado (sgRNAs). A co-transfecção de células mamíferas com este vetor sgRNA/CRISPR e um vetor de repórter de luciferase dupla que examina o reparo de quebra de dois fios permite avaliação da eficiência do nocaute.

Resumo

Embora altamente eficiente, a modificação de um site genômico pela enzima CRISPR requer a geração de um sgRNA exclusivo do site de destino de antemão. Este trabalho descreve os principais passos que levam à construção de vetores sgRNA eficientes usando uma estratégia que permite a detecção eficiente das colônias positivas por PCR antes do sequenciamento de DNA. Uma vez que a edição eficiente do genoma usando o sistema CRISPR requer um sgRNA altamente eficiente, uma pré-seleção de alvos sgRNA candidatos é necessária para economizar tempo e esforço. Um sistema de repórter de dupla luciferase foi desenvolvido para avaliar a eficiência do nocaute examinando o reparo de quebra de dois fios através de um único ressarcimento de fios. Aqui, usamos este sistema de repórteres para pegar o alvo xCas9/sgRNA preferido dos vetores sgRNA candidatos para edição específica de genes. O protocolo delineado fornecerá um vetor de enzima sgRNA/CRISPR preferido em 10 dias (começando com oligonucleotídeos devidamente projetados).

Introdução

Os sgRNAs CRISPR compreendem uma sequência de 20 nucleotídeos (o protoespaço), que é complementar à sequência genômica de alvo^1,2. Embora altamente eficiente, a capacidade do sistema CRISPR/Cas de modificar um determinado site genômico requer a geração de um vetor que carrega um sgRNA eficiente exclusivo do site de destino². Este artigo descreve os principais passos na geração desse vetor sgRNA.

Para a edição de genoma bem-sucedida usando o sistema CRISPR/Cas, o uso de sgRNAs altamente eficientes é um pré-requisito crucial^3,4,5. Uma vez que os núcleos projetados usados na edição de genomas manifestam diversas eficiências em diferentes loci¹direcionados , uma pré-seleção de metas de sgRNA candidatos é necessária para economizar tempo e esforço^6,7,8,9. Um sistema de repórter de dupla luciferase foi desenvolvido para avaliar a eficiência do nocaute examinando o reparo de quebra de dois fios através de um único fio de ressarcimento^3,10. Aqui usamos este sistema de repórteres para escolher um alvo sgRNA CRISPR preferido de diferentes vetores sgRNA candidatos projetados para edição específica de genes. O protocolo aqui estabelecido foi implementado em nosso grupo e laboratórios colaboradores nos últimos anos para gerar e avaliar as SGRNAs crispr.

O protocolo a seguir resume como projetar sgRNA adequado através de software de rede. Uma vez selecionados os sgRNAs adequados, descrevemos as diferentes etapas para obter os oligonucleotídeos necessários, bem como a abordagem para inserir os oligonucleotídeos emparelhados no vetor de expressão pX330-xCas9. Também apresentamos um método para a montagem de vetores de repórter sgRNA e dupla luciferase baseado na ligadura dessas sequências em um vetor de expressão predigdenciado (passos 2-10, Figura 1A). Finalmente descrevemos como analisar a eficiência de corte de DNA para cada um dos sgRNAs (etapas 11-12).

Protocolo

1. sgRNA design de oligonucleotídeo

1. Design sgRNAs usando ferramentas on-line, como a ferramenta online Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). A sequência PAM é importante com base no Cas9 que está sendo usado. Para xCas9, as sequências pam relevantes são NG e a antiga ferramenta on-line Cas-Designer referida pode gerar sgRNAs relevantes xCas9.
   1. Use ferramentas de design sgRNA que englobam algoritmos para previsão on-and-target (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)¹¹. É preferível uma pontuação de 0,2 ou superior.
2. Selecione até 3 alvos de edição de genes para uma triagem ideal (por exemplo, T1, T2 e T3 foram projetados para o alvo genético DKK2 exon 1 de ovelhas[Tabela 1]).

2. Modificação de oligonucleotídeo

1. Para modificar o oligonucleotídeo sgRNA, exclua o motivo adjacente do protoespaço de 3'-NG (PAM), mantendo a sequência do protoespaço (por exemplo, sequência inicial para T1: TGCCTGCCTCTACTGGCCGC [20 nt]).
2. Adicione o caccg pentanucleotídeo ao fim de 5'end do oligo.
   NOTA: Após a ligadura para o esqueleto pX330-xCas9, esta sequência conterá o 3'-end do promotor U6 motivando a transcrição sgRNA. A matriz "CACC" garante que o oligo esteja combinando com as saliências do plasmídeo pX330-xCas9 digerido pelo BbsI. A base "G" é um pré-requisito dos promotores do RNA Polymerase III e garante a inicialização eficaz da transcrição sgRNA (por exemplo, anexando a matriz de 5'-CACCG ao protoespaço do T1, alcançando T1-F: CACCGTGCCTGCCTCTACTCTGGCCGC [25 nt]). A eficiência do decote de 21 nt gRNA é significativamente diferente da de 20 nt gRNA^1,12,13,14. É geralmente aconselhável usar 20 nt com 5'-G gerando um protoespaço mais curto, se isso não for possível, então 21 nt com 5'-G extra podem ser usados.
3. Crie um complemento reverso (rc) da sequência do protoespaço.
   NOTA: Por exemplo, o rc do protoespaço T1 é GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt).
4. Anexar AAAC ao final de 5'/10 da sequência rc protospacer. Adeia um C adicional ao 3'-end do protoespaço.
   NOTA: A sequência "AAAC" garante que o oligonucleotídeo seja adequado para clonagem no plasmídeo pX330-xCas9 digerido pelo BbsI. O adicional "C" no 3'-end é essencial para a ressarcimento com o início "G" para a transcrição sgRNA descrita acima (por exemplo, AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] é a sequência final de oligonucleotídeo para o protoespaçor T1 rc).
5. Ordene os oligonucleotídeos.

3. Oligonucleotídeos

1. Diluir oligonucleotídeos liofilizados a uma concentração final de 10 μM em água dupla destilada (ddH₂O).
2. Misture oligonucleotídeos para a frente e para frente em um tubo PCR de parede fina, maintaning uma razão de 1:1 (por exemplo, 20 μL cada) sem adicionar qualquer buffer extra.
3. Incubar a mistura a 95 °C por 5 min e, em seguida, diminuir a temperatura para 72 °C por 10 min. Siga com um período de resfriamento à temperatura ambiente (RT) que consiste em simplesmente remover a amostra da máquina PCR e colocá-la em RT.
   NOTA: Não é necessário fosforilarar as misturas de oligonucleotídeos para facilitar a ligadura.

4. digestão vetorial sgRNA/CRISPR

1. Digerir 1 μg do vetor pX330-xCas9 selecionado com BbsI (10 unidades de enzima por 1 μg de plasmídeo) por 2 h a 37 °C(Figura 2). Conduza a digestão do vetor de expressão sgRNA pX330-xCas9 em um volume total de 50 μL, contendo 5 μL de tampão de digestão de 10x e água destilada para alcançar o volume final.
2. Purifique o vetor digerido por extração de banda a partir de um gel de 2% de agarose abaixo de 10 V/cm e, posteriormente, purifique usando uma coluna de sílica usando um kit de extração de gel comercial.

5. Ligação dos oligonucleotídeos sgRNA enaltados ao vetor de expressão

1. Misture os oligonucleotídeos sgRNA enlatados (5 μL da mistura a partir do passo 4) com o vetor pX330-xCas9 digerido por BbsI (purificado, 100 ng).
2. Adicione 1 μL de ligase e 1 μL de tampão ligase de 10x.
3. Adicione água destilada com volume apropriado, até 10 μL.
4. Incubar durante a noite a 4 °C.

6. Transformação celular competente

1. Retire as células competentes E. coli DH5α do armazenamento a -80 °C e descongele-as no gelo.
2. Adicione 5 μL da mistura de ligadura a 50 μL de E. coli DH5α competente e mantenha a mistura no gelo por 30 minutos.
3. Aqueça a mistura a 42 °C durante 90 s.
4. Descanse no gelo por 2 minutos.
5. Recupere a cultura em um agitador rotativo em 500 μL de mídia LB por 1 h a 37 °C.
6. Placa 200 μL da cultura em uma placa de agarose resistência à ampicilina LB e incuba-la durante a noite a 37 °C.

7. Identificação dos plasmídeos recombinantes corretos por PCR

1. Escolha de 5 a 10 colônias bacterianas da placa LB e use cada uma delas para inocular um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de mídia LB com 60 mg/mL de ampicillina.
2. Incubar os tubos em um agitador rotativo por 2-3 h.
3. Realize a detecção de plasmídeos recombinantes corretos usando pares de primer específicos para os oligonucleotídeos sgRNA [por exemplo, primer avançado para construção vetorial de expressão T1 sgRNA (T1-F): CACCGTGCCTCTCTACTCTGGCCGC, primer reverso (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, produzindo um amplicon de 287 bps (Figura 3)].
   1. Prepare a mistura PCR(Tabela 2).
   2. Use as seguintes condições de ciclismo PCR: 95 °C para 5 min para pré-desnaturação; 30 ciclos de 95 °C para 30 s para desinaturação, 60 °C para 30 s para ressar e 72 °C para 30 s para extensão. Após a conclusão dos 30 ciclos, realize uma etapa final de extensão por aquecimento por 5 min a 72 °C.
   3. Execute o produto PCR em um gel de 2% de agarose abaixo de 10 V/cm. Uma banda do tamanho certo [por exemplo, 287 bp] é considerada positiva.

8. Validar a sequência de plasmídeo de expressão sgRNA

1. Verifique a sequência de colônias positivas de PCR pelo Sanger sequenciamento¹⁵ usando o primer reverso BbsI-R (ver passo 7.3). Esta primer se acotorna no local a jusante da inserção sgRNA oligo. Foi construída a sequência sgRNA de expressão pX330-xCas9-T1 contendo protoespaço TGCCTGCCTCTACTGGCCGGGGGG e xCas9.
2. Use o primer T1-F para sequenciar as colônias positivas. O atacante não pôde dar informações completas de sequência para o site em torno do local de inserção do oligo sgRNA, pois o fragmento de 30-50 bp após o primer de sequenciamento não poderia ser exatamente lido.

9. Construção de vetor de repórter de dupla luciferase

1. Sintetizar fragmentos de DNA de 300-500 bp contendo os alvos sgRNA e subclone-lo em um vetor de repórter de luciferase dupla através de digestão dupla [por exemplo, subclone 440 bp ovelhas DKK2 exon1 fragmento em pSSA-Dual plasmid^16,17 usando digestão dupla com AscI e SalI, resultando pSSA-Dual-D2KK].
2. Sintetizar fragmentos de DNA de 300-500 bp contendo os alvos sgRNA. Observe que as sequências dos fragmentos de DNA devem ser partes das sequências genômicas, que poderiam ser obtidas a partir do site ncbi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ou referências relacionadas.
3. Selecione um vetor de repórter de dupla luciferase adequado, como pSSA-Dual^16,17 (ou dois vetores expressando luciferase de vagalume e renilla luciferase respectivamente) e, em seguida, digerir este vetor e os fragmentos de DNA indicados acima com dois endonucleases como AscI e SalI.
4. Finalmente ligar esses dois fragmentos com Ligase de DNA T4, resultando em pSSA-Dual-Target. Os detalhes para dupla digestão e ligadura são exibidos na Tabela 3 e Tabela 4, respectivamente. Vale ressaltar que o vetor repórter deve ser amplificado em cepas de bactérias estáveis (como top10), que são recomendadas para serem cultivadas com menor velocidade rotacional (tipicamente não mais do que 200 rpm), com o propósito de evitar a recombinação do DNA.

10. Transfecção celular

1. Extrair plasmídeos livres de endotoxinas para vetores acima. Avalie a pureza e concentração dos plasmídeos utilizando instrumentos adequados. Recomenda-se uma concentração final de nada menos que 500 ng/μL e uma razão de pureza de 1,7-1,9 na absorvância 260/280 nm (A260/A280) para estes plasmídeos.
2. Co-transfeito uma linha celular apropriada como PIEC¹⁸ com os plasmídeos em igual proporção (por exemplo, pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1, 0,5 μg plasmid para cada duplicação ao usar placa de 24 poços). Use um vetor vazio como pX330-xCas9 como um controle negativo.
   1. Um dia antes da transfecção, as células da placa em uma placa de cultura de 24 poços a uma densidade de 2 x 10⁵ células/bem. As células estarão prontas para a transfecção quando alcançarem uma confluência de 60-80%.
   2. Antes do ponto de tempo de transfecção, remova o supernascente o máximo possível e adicione suavemente 0,5 mL de mídia fresca para cada poço.
   3. Diluir reagente de transfecção na mídia DMEM na proporção de 1:25 e misturar bem.
   4. Prepare a mistura mestre de DNA diluindo 0,5 μg de DNA em 25 μL de mídia DMEM e, em seguida, adicione 1 μL de reagente P3000.
   5. Adicione DNA diluído a cada tubo de reagente de transfecção diluído (proporção 1:1).
   6. Incubar por 10-15 min em temperatura ambiente.
   7. Adicione 50 μL de dna-lipídicos complexo às células.
   8. Incubar células por 24 h a 37 °C. Em seguida, analise as células transfeinadas como no Passo 11.

11. Detecção de dupla luciferase

1. Prepare uma quantidade suficiente do tampão de 1x de lise passiva (PLB) adicionando 1 volume de 5x PLB a 4 volumes de água destilada e misture bem.
2. Lise passiva de células cultivadas em placas de cultura de 24 poços.
   1. Remova o meio de crescimento das células cultivadas e aplique suavemente um volume suficiente de soro fisco tamponado de fosfato (PBS) para lavar a superfície do vaso cultural. Gire o vaso brevemente para remover células separadas e meio de crescimento residual. Remova completamente a solução de enxágue antes de aplicar reagente PLB.
   2. Dispense 100 μL de 1x PLB em cada cultura bem para cobrir completamente a monocamada celular. Deixe as placas de cultura ficarem por 20 minutos.
   3. Transfira o lise para um tubo ou frasco para posterior manuseio ou armazenamento.
3. Prepare o reagente de ensaio de luciferase (LAR) reutilizando o substrato de ensaio de luciferase fornecido em 10 mL do tampão de ensaio de luciferase fornecido.
4. Prepare um volume adequado para realizar o número desejado de ensaios de repórter de dupla luciferase (100 μL reagente por ensaio). Adicione 1 volume de substrato de parada de 50x a 50 volumes de tampão de parada em um copo ou tubo de polipropileno siliconado.
5. Ensaio de repórter de dupla luciferase (DLR)
   1. Programar luminômetros para fornecer um atraso pré-leitura de 2 segundos, seguido de um período de medição de 10 segundos.
   2. Predispense 100 μL de reagente de ensaio de luciferase no número apropriado de tubos de luminômetro para completar o número desejado de ensaios DLR.
   3. Transfira cuidadosamente até 20 μL de lise celular para o tubo luminômetro contendo LAR; misturar por pipetação 2 ou 3 vezes. Coloque o tubo no luminômetro e inicie a leitura.
   4. Remova o tubo de amostra do luminômetro, adicione 100 μL de reagente stop e vórtice brevemente para misturar. Substitua a amostra no luminômetro e inicie a leitura.
   5. Regisso recorde a atividade de renilla luciferase normalizada para a atividade de luciferase de vagalume, ou seja, a recíproca da razão exibida na tela.
   6. Descarte o tubo de reação e siga para o próximo ensaio.

Resultados

Os métodos descritos neste protocolo são para a construção de vetores de expressão sgRNA e xCas9 e, em seguida, para a triagem de otimização de oligos sgRNA com eficiências relativamente mais altas de segmentação genética. Aqui exibimos um exemplo representativo de 3 alvos sgRNA para ovelhas DKK2 exon 1. Os vetores de expressão SgRNA e xCas9 podem ser construídos predigesting a espinha dorsal vetorial (Figura 2), seguido por ligante-lo em uma série de fragmentos curtos...

Discussão

Os procedimentos de clonagem de vetores sgRNA que descrevemos aqui facilitam a produção eficiente de sgRNAs, com a maioria dos custos derivados do pedido de oligonucleotídeos e sequenciamento vetorial. Embora o método delineado seja projetado para permitir que os usuários gerem sgRNAs para uso com CRISPR/Cas9, o protocolo pode ser facilmente adaptado para uso com ortomologias Cas9 ou outros endonucleases guiados por RNA, como o Cpf1, introduzindo pequenas modificações na espinha dorsal vetorial e nas sequências d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
A new generation of full touch screen gradient PCR instrument	LongGene	A200	Target gene amplification
AscI restriction enzymes	New England Biolabs	R0558V	Cutting target vectors
BbsI restriction enzyme	New England Biolabs	R0539S	Cutting target vectors
Clean workbench	AIRTECH	SW-CJ-2FD/VS-1300L-U	A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment
DH5α Competent Cells	TaKaRa	K613	Plasmid vector transformation
Dual-Luciferas Reporter Assay System	Promega	E1910	Dual-luciferas reporter assay
Electric thermostatic water bath	Sanfa Scientific Instruments	DK-S24	Heating reagent by constant temperature in water bath
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C	Control voltage, current, etc.
Eppendorf Reference 2	Eppendorf China Ltd.	Reference 2	Accurately draw and transfer traces of liquid
Gel imaging analyzer	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	WD-9413B	For the analysis of electrophoresis gel images
GloMax 20/20 Luminometer	Promega	E5311	Detect dual luciferase activity
High speed refrigerated centrifuge	BMH	sigma 3K15	Nucleic acid extraction and purification
Intelligent biochemical incubator	Sanfa Scientific Instruments	SHP-160	Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment
LB Broth Agar	Sangon Biotech	A507003-0250	For the cultivation of E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit	Thermo Fisher	L3000015	DNA Transfection
SalI restriction enzymes	New England Biolabs	R3138V	Cutting target vectors
SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit	Sangon Biotech	B518131-0050	Recycling DNA fragments
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit	Sangon Biotech	B518191-0100	Extraction of plasmid DNA
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202V	Link DNA fragment
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0	TaKaRa	9761	DNA purification
Vertical pressure steam sterilizer	JIBIMED	LS-50LD	High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment
Water bath thermostat	Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.	SHZ-82	Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.