Construction de plasmides CRISPR et détection de l’efficacité des knockouts dans les cellules mammifères grâce à un système de double luciferase reporter

Résumé

Ici, nous présentons un protocole décrivant une méthode rationalisée pour la génération efficace de plasmides exprimant à la fois l’enzyme CRISPR et l’ARN guide unique associé (SGARN). La co-transfection des cellules mammifères avec ce vecteur sgRNA/CRISPR et un double vecteur de reporter luciferase qui examine la réparation de rupture à double brin permet d’évaluer l’efficacité des KNOCKOUT.

Résumé

Bien que très efficace, la modification d’un site génomique par l’enzyme CRISPR nécessite la génération d’un sgRNA unique au site cible(s) à l’avance. Ces travaux décrivent les étapes clés menant à la construction de vecteurs sgRNA efficaces à l’aide d’une stratégie qui permet la détection efficace des colonies positives par PCR avant le séquençage de l’ADN. Étant donné que l’édition efficace du génome à l’aide du système CRISPR nécessite un SGRNA hautement efficace, une présélection des cibles sgRNA candidats est nécessaire pour gagner du temps et des efforts. Un système double de journaliste de luciferase a été développé pour évaluer l’efficacité de KO en examinant la réparation de rupture de double brin par annealing simple brin. Ici, nous utilisons ce système de reporter pour ramasser la cible préférée xCas9/sgRNA à partir des vecteurs candidats sgRNA pour l’édition génétique spécifique. Le protocole décrit fournira un vecteur d’enzyme sgRNA/CRISPR préféré en 10 jours (en commençant par des oligonucléotides convenablement conçus).

Introduction

Les SGARN CRISPR comprennent une séquence de 20 nucléotides (le protospacer), qui est complémentaire à la séquence^{cible génomique 1,2}. Bien que très efficace, la capacité du système CRISPR/Cas à modifier un site génomique donné nécessite la génération d’un vecteur porteur d’un SGRNA efficace unique au site cible(s)². Cet article décrit les étapes clés de la génération de ce vecteur sgRNA.

Pour réussir l’édition du génome à l’aide du système CRISPR/Cas, l’utilisation de sgARN hautement efficaces est une condition préalable cruciale^3,4,5. Étant donné que les nucléases modifiées utilisées dans l’édition du génome manifestent diverses efficacités à différents loci¹ciblés, une présélection des cibles sgRNA candidats est nécessaire afin de gagner du temps et des efforts^6,7,8,9. Un système double de journaliste de luciferase a été développé pour évaluer l’efficacité de KO en examinant la réparation de rupture de double brin par l’intermédiaire de l’annealing^{simple de brin 3,10.} Ici, nous utilisons ce système de reporter pour choisir une cible crispr sgRNA préférée parmi différents vecteurs candidats sgRNA conçus pour l’édition de gènes spécifiques. Le protocole indiqué ici a été mis en œuvre dans notre groupe et les laboratoires collaborateurs au cours des dernières années pour générer et évaluer crispr sgRNAs.

Le protocole suivant résume comment concevoir sgRNA approprié par le biais de logiciels réseau. Une fois que les sgARN appropriés sont sélectionnés, nous décrivons les différentes étapes pour obtenir les oligonucléotides requis ainsi que l’approche pour insérer les oligonucléotides appariés dans le vecteur d’expression pX330-xCas9. Nous présentons également une méthode pour assembler des vecteurs de reporter sgRNA-expressing et double luciferase basés sur la ligature de ces séquences dans un vecteur d’expression prédigesté (étapes 2-10, figure 1A). Enfin, nous décrivons comment analyser l’efficacité de coupe de l’ADN pour chacun des SGARN (étapes 11-12).

Protocole

1. conception d’oligonucléotide de sgRNA

1. Concevoir des sgARN à l’aide d’outils en ligne tels que l’outil en ligne Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). La séquence PAM est importante en fonction du Cas9 utilisé. Pour xCas9, les séquences PAM pertinentes sont NG et l’ancien outil en ligne Cas-Designer référé peut générer xCas9 sgRNAs pertinents.
   1. Utilisez des outils de conception sgRNA qui englobent des algorithmes pour la prédiction sur et hors cible (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)¹¹. Un score de 0,2 ou plus est préféré.
2. Sélectionnez jusqu’à 3 cibles d’édition génétique pour un dépistage optimal (p. ex., T1, T2 et T3 ont été conçus pour le ciblage génétique exon 1 du mouton DKK2 exon 1 [tableau 1]).

2. Modification oligonucléotide

1. Pour modifier l’oligonucléotide sgRNA, supprimez le motif adjacent protospacer de 3'NG (PAM), en conservant la séquence protospacer (par exemple, séquence de départ pour T1: TGCCTGCTCCTACTGGCCGC [20 nt]).
2. Ajouter le pentanucleotide CACCG à l’extrémité 5'de l’oligo.
   REMARQUE: Lors de la ligature vers le squelette pX330-xCas9, cette séquence contiendra le 3'-end du promoteur U6 motivant la transcription sgRNA. Le tableau « CACC » garantit que l’oligo correspond aux surplombs du plasmide pX330-xCas9 digéré par BbsI. La base « G » est une condition préalable des promoteurs de RNA Polymerase III et garantit le démarrage effectif de la transcription sgRNA (par exemple, l’appétire le tableau 5'-CACCG au protospacer de T1, la réalisation T1-F: CACCGTGCCTGCTCCTACTGGCCGC [25 nt]). L’efficacité de clivage de 21 nt gRNA est significativement différente de celle de 20 nt gRNA^1,12,13,14. Il est généralement conseillé d’utiliser 20 nt avec 5'-G en générant un protospacer plus court, si cela n’est pas possible, puis 21 nt avec 5'-G supplémentaire peut être utilisé.
3. Créez un complément inverse (rc) de la séquence protospacer.
   REMARQUE: Par exemple, le rc du protospacer T1 est GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt).
4. Annexe AAAC à la fin de 5'de la séquence protospacer rc. Annexez un C supplémentaire à l’extrémité 3'du protospacer rc.
   REMARQUE : La séquence « AAAC » garantit que l’oligonucléotide convient au clonage dans le plasmide pX330-xCas9 digéré par BbsI. L’addition « C » sur le 3'-end est essentielle pour annealing avec l’initiation « G » pour la transcription sgRNA décrite ci-dessus (par exemple, AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] est la séquence oligonucléotide finale pour protospacer T1 rc).
5. Commandez les oligonucléotides.

3. Annealing oligonucléotide

1. Diluer les oligonucléotides lyophilisés à une concentration finale de 10 μM dans de l’eau distillée double (ddH₂O).
2. Mélanger les oligonucléotides avant et arrière dans un tube PCR à parois minces, avec un rapport de 1:1 (p. ex., 20 μL chacun) sans ajouter de tampon supplémentaire.
3. Incuber le mélange à 95 °C pendant 5 min, puis baisser la température à 72 °C pendant 10 min. Suivez avec une période de refroidissement à température ambiante (RT) consistant simplement à retirer l’échantillon de la machine PCR et à le placer à RT.
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de phosphorer les mélanges oligonucléotides pour faciliter la ligature.

4. digestion vectorielle sgRNA/CRISPR

1. Digérer 1 μg du vecteur pX330-xCas9 sélectionné avec bbsI (10 unités d’enzyme par 1 μg de plasmide) pendant 2 h à 37 °C (figure 2). Effectuer la digestion du vecteur d’expression pX330-xCas9 sgRNA dans un volume total de 50 μL, contenant 5 μL de tampon de digestion 10x et de l’eau distillée pour atteindre le volume final.
2. Purifier le vecteur digéré par extraction en bande à partir d’un gel d’agarose de 2 % de moins de 10 V/cm et purifier par la suite à l’aide d’une colonne de silice à l’aide d’un kit commercial d’extraction de gel.

5. Ligation des oligonucléotides annelés de sgRNA au vecteur d’expression

1. Mélanger les oligonucléotides annelés sgRNA (5 μL du mélange de l’étape 4) avec le vecteur pX330-xCas9 digéré par BbsI (purifié, 100 ng).
2. Ajouter 1 μL de ligase et 1 μL de tampon ligase 10x.
3. Ajouter l’eau distillée avec un volume approprié, jusqu’à 10 μL.
4. Incuber toute la nuit à 4 °C.

6. Transformation cellulaire compétente

1. Sortez les cellules compétentes E. coli DH5α du stockage à -80 °C et décongelez-les sur la glace.
2. Ajouter 5 μL du mélange de ligature à 50 μL d’E. coli DH5α compétent et garder le mélange sur la glace pendant 30 min.
3. Chauffer le mélange à 42 °C pendant 90 s.
4. Reposez-le sur la glace pendant 2 min.
5. Récupérer la culture sur un shaker rotatif en 500 μL de supports LB pendant 1 h à 37 °C.
6. Plaque 200 μL de la culture sur une plaque d’agarose de résistance à l’ampicilline LB et l’incuber toute la nuit à 37 °C.

7. Identification des plasmides recombinants corrects par PCR

1. Choisissez 5 à 10 colonies bactériennes de la plaque LB et utilisez chacune d’entre elles pour inoculer un tube de 1,5 mL contenant 1 mL de lb de médias avec ampicilline de 60 mg/mL.
2. Incuber les tubes sur un shaker rotatif pendant 2-3 h.
3. Effectuer la détection de plasmides recombinants corrects en utilisant des paires d’amorce spécifiques pour les oligonucléotides sgRNA [p. ex., amorce avant pour la construction vectorielle d’expression T1 sgRNA (T1-F): CACCGTGCCTGCCTCTCTACTGGCCGC, amorce inverse (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, produisant un amplicon de 287 bp(figure 3)].
   1. Préparer le mélange PCR (Tableau 2).
   2. Utilisez les conditions de cyclisme PCR suivantes : 95 °C pendant 5 min pour la prénaturation; 30 cycles de 95 °C pour 30 s pour la dénaturation, 60 °C pour 30 s pour l’annealage et 72 °C pour 30 s pour l’extension. Une fois les 30 cycles terminés, effectuez une dernière étape d’extension en chauffant pendant 5 min à 72 °C.
   3. Exécutez le produit PCR sur un gel d’agarose de 2 % de moins de 10 V/cm. Une bande de la bonne taille [p. ex., 287 pb] est considérée comme positive.

8. Valider la séquence de l’expression sgRNA plasmide

1. Vérifiez la séquence des colonies positives pcr par sanger séquençage^{15 à} l’aide de l’amorce inverse BbsI-R (voir étape 7.3). Cette amorce anneals sur le site en aval de l’insert oligo sgRNA. Le pX330-xCas9-T1 exprimant la séquence sgRNA contenant le protospacer TGCCTGCTCCTACTGGCCGCGGGGGGGGGGGGGG et xCas9 a été construit.
2. Utilisez l’amorce avant T1-F pour séquencer les colonies positives. L’avant ne pouvait pas donner l’information complète de séquence pour le site entourant le site d’insertion de l’oligo de sgRNA, parce que le fragment de 30-50 bp suivant l’amorce de séquençage ne pouvait pas être exactement lu dehors.

9. Construction d’un double vecteur de journaliste luciferase

1. Synthétiser des fragments d’ADN de 300 à 500 pb contenant les cibles sgRNA et les subcloner en un double vecteur de reporter luciferase par double digestion [p. ex., sous-vêtements 440 bp moutons DKK2 exon1 fragment en pSSA-Dual plasmid^16,17 en utilisant une double digestion avec AscI et SalI, résultant pSSA-Dual-DKK2].
2. Synthétiser 300-500 bp fragments d’ADN contenant les cibles sgRNA. Notez que les séquences des fragments d’ADN doivent faire partie des séquences génomiques, qui pourraient être obtenues à partir du site Web du NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ou de références connexes.
3. Choisissez un vecteur de reporter à double luciferase approprié tel que pSSA-Dual^16,17 (ou deux vecteurs exprimant respectivement luciferase et renilla luciferase) et digérer ce vecteur et les fragments d’ADN énoncés ci-dessus avec deux endonucleases tels que AscI et SalI.
4. Enfin ligate ces deux fragments avec T4 ADN Ligase, résultant en pSSA-Dual-Target. Les détails de la double digestion et de la ligature sont affichés respectivement dans le tableau 3 et le tableau 4. Il convient de mentionner que le vecteur reporter doit être amplifié dans des souches bactériennes stables (telles que Top10), qui sont recommandées pour être cultivés avec une vitesse de rotation inférieure (généralement pas plus de 200 rpm), dans le but d’éviter la recombinaison de l’ADN.

10. Transfection cellulaire

1. Extraire les plasmides sans endotoxine pour les vecteurs indiqués ci-dessus. Évaluer la pureté et la concentration des plasmides à l’aide d’instruments appropriés. Une concentration finale d’au moins 500 ng/μL et un rapport de pureté de 1,7-1,9 à absorption 260/280 nm (A260/A280) sont recommandés pour ces plasmides.
2. Co-transfecter une lignée cellulaire appropriée telle que PIEC¹⁸ avec les plasmides en proportion égale (pX330-xCas9-T1 : pSSA-Dual-DKK2=1:1, 0,5 μg plasmide pour chaque duplication lors de l’utilisation de 24 plaques de puits). Utilisez un vecteur vide tel que pX330-xCas9 comme un contrôle négatif.
   1. Un jour avant la transfection, plaques dans une plaque de culture de 24 puits à une densité de 2 x 10⁵ cellules/puits. Les cellules seront prêtes pour la transfection quand elles atteignent une confluence de 60-80%.
   2. Avant le point de temps de transfection, retirez le supernatant autant que possible et ajoutez doucement 0,5 mL de médias frais pour chaque puits.
   3. Diluer le réaccente de transfection dans les supports DMEM au rapport de 1:25 et bien mélanger.
   4. Préparez un mélange maître d’ADN en diluant 0,5 μg d’ADN dans 25 μL de supports DMEM, puis ajoutez 1 μL de réagençage P3000.
   5. Ajouter de l’ADN dilué à chaque tube de réaccente de transfection diluée (rapport 1:1).
   6. Incuber de 10 à 15 min à température ambiante.
   7. Ajouter 50 μL de complexe ADN-lipide aux cellules.
   8. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C. Ensuite, analyser les cellules transfected comme dans l’étape 11.

11. Détection de la double luciferase

1. Préparer une quantité suffisante du tampon de lyse passive 1x (PLB) en ajoutant 1 volume de 5x PLB à 4 volumes d’eau distillée et bien mélanger.
2. Lyse passive des cellules cultivés dans des plaques de culture de 24 puits.
   1. Retirez le milieu de croissance des cellules de culture et appliquez doucement un volume suffisant de solution saline tamponnée de phosphate (PBS) pour laver la surface du récipient de culture. Faites tourbillonner brièvement le vaisseau pour enlever les cellules détachées et le milieu de croissance résiduel. Retirez complètement la solution de rinçage avant d’appliquer le réaccentiage PLB.
   2. Distribuez 100 μL de 1x PLB dans chaque culture bien pour couvrir complètement le monocouche cellulaire. Laissez reposer les plaques de culture pendant 20 min.
   3. Transférez le lysate dans un tube ou un flacon pour une manipulation ou un stockage plus long.
3. Préparez le réagenage d’essai de luciferase (LAR) en résuspendant le substrat d’essai lyophilisé fourni de luciferase dans 10 mL du tampon fourni d’essai de luciferase.
4. Préparez un volume suffisant pour effectuer le nombre désiré d’analyses de journaliste à double luciferase (100 μL de réacomplament par essai). Ajouter 1 volume de substrat d’arrêt de 50 x à 50 volumes de tampon d’arrêt dans un tube en verre ou en polypropylène siliconisé.
5. Essai du journaliste à double luciferase (DLR)
   1. Luminomètres du programme pour fournir un délai de 2 secondes avant la lecture, suivi d’une période de mesure de 10 secondes.
   2. Predispense 100 μL de réagencé luciferase dans le nombre approprié de tubes luminomètres pour compléter le nombre désiré d’analyses DLR.
   3. Transférer soigneusement jusqu’à 20 μL de lysate cellulaire dans le tube de luminomètre contenant du LAR; mélanger par pipetting 2 ou 3 fois. Placez le tube dans le luminomètre et initiez la lecture.
   4. Retirer brièvement le tube d’échantillon du luminomètre, ajouter 100 μL de réageni d’arrêt et de vortex pour mélanger. Remplacez l’échantillon dans le luminomètre et initiez la lecture.
   5. Enregistrez l’activité de la renilla luciferase normalisée à l’activité luciferase de la lide de feu, à savoir la réciprocité du rapport affiché à l’écran.
   6. Jetez le tube de réaction et passez à l’analyse suivante.

Résultats

Les méthodes décrites dans ce protocole sont pour la construction de vecteurs d’expression sgRNA et xCas9, puis pour le dépistage d’optimisation des oligos sgRNA avec des efficacités de ciblage génétique relativement plus élevées. Ici, nous affichons un exemple représentatif de 3 cibles sgRNA pour les moutons DKK2 exon 1. SgRNA et xCas9 exprimant des vecteurs peuvent être construits en prédigestant l’épine dorsale vectorielle (Figure 2) suivie par ligating dans une...

Discussion

Les procédures de clonage vectoriel sgRNA que nous avons décrites ici facilitent la production efficace de sgARN, avec la plupart des coûts dérivés de la commande d’oligonucléotide et du séquençage vectoriel. Alors que la méthode décrite est conçue pour permettre aux utilisateurs de générer des sgARN pour une utilisation avec CRISPR/Cas9, le protocole peut facilement être adapté pour une utilisation avec des orthologues Cas9 ou d’autres endonucleases guidés par l’ARN tels que Cpf1, introduisant des ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A new generation of full touch screen gradient PCR instrument	LongGene	A200	Target gene amplification
AscI restriction enzymes	New England Biolabs	R0558V	Cutting target vectors
BbsI restriction enzyme	New England Biolabs	R0539S	Cutting target vectors
Clean workbench	AIRTECH	SW-CJ-2FD/VS-1300L-U	A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment
DH5α Competent Cells	TaKaRa	K613	Plasmid vector transformation
Dual-Luciferas Reporter Assay System	Promega	E1910	Dual-luciferas reporter assay
Electric thermostatic water bath	Sanfa Scientific Instruments	DK-S24	Heating reagent by constant temperature in water bath
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C	Control voltage, current, etc.
Eppendorf Reference 2	Eppendorf China Ltd.	Reference 2	Accurately draw and transfer traces of liquid
Gel imaging analyzer	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	WD-9413B	For the analysis of electrophoresis gel images
GloMax 20/20 Luminometer	Promega	E5311	Detect dual luciferase activity
High speed refrigerated centrifuge	BMH	sigma 3K15	Nucleic acid extraction and purification
Intelligent biochemical incubator	Sanfa Scientific Instruments	SHP-160	Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment
LB Broth Agar	Sangon Biotech	A507003-0250	For the cultivation of E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit	Thermo Fisher	L3000015	DNA Transfection
SalI restriction enzymes	New England Biolabs	R3138V	Cutting target vectors
SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit	Sangon Biotech	B518131-0050	Recycling DNA fragments
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit	Sangon Biotech	B518191-0100	Extraction of plasmid DNA
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202V	Link DNA fragment
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0	TaKaRa	9761	DNA purification
Vertical pressure steam sterilizer	JIBIMED	LS-50LD	High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment
Water bath thermostat	Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.	SHZ-82	Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.