Bau von CRISPR Plasmiden und Nachweis von Knockout-Effizienz in Säugetierzellen durch ein Dual Luciferase Reporter System

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine optimierte Methode zur effizienten Erzeugung von Plasmiden beschreibt, die sowohl das CRISPR-Enzym als auch die zugehörige Single Guide RNA (sgRNAs) exemittiert. Die Kotransfektion von Säugetierzellen mit diesem sgRNA/CRISPR-Vektor und einem dualen Luziferase-Reportervektor, der die Reparatur von Doppelstrang-Bruch untersucht, ermöglicht die Bewertung der Knockout-Effizienz.

Zusammenfassung

Obwohl hocheffizient, erfordert die Modifikation einer genomischen Stelle durch das CRISPR-Enzym die Generierung einer sgRNA, die für die Zielstelle(en) im Voraus einzigartig ist. Diese Arbeit beschreibt die wichtigsten Schritte, die zum Aufbau effizienter sgRNA-Vektoren führen, mit einer Strategie, die eine effiziente Detektion der positiven Kolonien durch PCR vor der DNA-Sequenzierung ermöglicht. Da eine effiziente Genombearbeitung mit dem CRISPR-System eine hocheffiziente sgRNA erfordert, ist eine Vorauswahl von Kandidaten-sgRNA-Zielen notwendig, um Zeit und Aufwand zu sparen. Ein duales luziferase-Reportersystem wurde entwickelt, um die K.o.-Effizienz zu bewerten, indem die Reparatur von Doppelstrang-Pausen durch einstrangiges Glühen untersucht wird. Hier verwenden wir dieses Reportersystem, um das bevorzugte xCas9/sgRNA-Ziel von Kandidaten-sgRNA-Vektoren für eine spezifische Genbearbeitung abzuholen. Das skizzierte Protokoll wird einen bevorzugten sgRNA/CRISPR-Enzymvektor in 10 Tagen liefern (beginnend mit entsprechend entwickelten Oligonukleotiden).

Einleitung

Die CRISPR sgRNAs bestehen aus einer 20-Nukleotid-Sequenz (dem Protospacer), die die genomische Zielsequenz^1,2ergänzt. Obwohl hocheffizient, erfordert die Fähigkeit des CRISPR/Cas-Systems, eine bestimmte genomische Site zu modifizieren, die Erzeugung eines Vektors, der eine effiziente sgRNA trägt, die für die Zielsite(en)²einzigartig ist. In diesem Artikel werden die wichtigsten Schritte bei der Generierung dieses sgRNA-Vektors beschrieben.

Für eine erfolgreiche Genombearbeitung mit dem CRISPR/Cas-System ist der Einsatz hocheffizienter sgRNAs eine entscheidende Voraussetzung^3,4,5. Da in der Genombearbeitung eingesetzte Nukleasen unterschiedliche Effizienzen an verschiedenen Ziel-Loci¹aufweisen, ist eine Vorauswahl von Kandidaten-sgRNA-Zielen erforderlich, um Zeit und Aufwand^zusparen 6^,7,8,9. Ein duales luziferase Reportersystem wurde entwickelt, um die Knockout-Effizienz zu bewerten, indem die Reparatur von Doppelstrang-Pausen über einstrangiges Glühen^3,10untersucht wird. Hier verwenden wir dieses Reportersystem, um ein bevorzugtes CRISPR sgRNA-Ziel aus verschiedenen Kandidaten-sgRNA-Vektoren auszuwählen, die für die spezifische Genbearbeitung entwickelt wurden. Das hier angegebene Protokoll wurde in den letzten Jahren in unserer Gruppe und in den Kooperierenden Laboratorien implementiert, um CRISPR sgRNAs zu generieren und zu bewerten.

Das folgende Protokoll fasst zusammen, wie geeignete sgRNA über Netzwerksoftware zu entwerfen. Sobald die geeigneten sgRNAs ausgewählt sind, beschreiben wir die verschiedenen Schritte, um die erforderlichen Oligonukleotide zu erhalten, sowie den Ansatz, die gepaarten Oligonukleotide in den pX330-xCas9-Expressionsvektor einzufügen. Wir präsentieren auch eine Methode zur Zusammenstellung von sgRNA-exezierenden und dualen Luziferase-Reportervektoren, die auf der Ligation dieser Sequenzen in einen vorverdauten Expressionsvektor basieren (Schritte 2-10, Abbildung 1A). Schließlich beschreiben wir, wie die DNA-Schneideffizienz für jeden der sgRNAs analysiert werden kann (Schritte 11-12).

Protokoll

1. sgRNA Oligonukleotid-Design

1. Entwerfen Sie sgRNAs mit Online-Tools wie dem Cas-Designer-Onlinetool (http://www.rgenome.net/cas-designer/). Die PAM-Sequenz ist wichtig, basierend auf dem verwendeten Cas9. Für xCas9 sind die relevanten PAM-Sequenzen NG und das frühere cas-Designer-Online-Tool kann xCas9-relevante sgRNAs generieren.
   1. Verwenden Sie sgRNA-Designtools, die Algorithmen für die On- und Off-Target-Vorhersage (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)¹¹umfassen. Es wird eine Punktzahl von 0,2 oder höher bevorzugt.
2. Wählen Sie bis zu 3 Gen-Editing-Ziele für ein optimales Screening aus (z. B. T1, T2 und T3 wurden für Schafe DKK2 exon 1 Gen targeting entwickelt [Tabelle 1]).

2. Oligonukleotid-Modifikation

1. Um das sgRNA-Oligonukleotid zu modifizieren, löschen Sie das angrenzende Motiv 3'-NG protospacer (PAM) und behalten die Protospacer-Sequenz bei (z. B. Startsequenz für T1: TGCCTGCTCTCTTACTGGCCGC [20 nt]).
2. Fügen Sie das Pentanukleotid CACCG an das 5'-Ende des Oligos.
   HINWEIS: Nach der Ligation zum pX330-xCas9-Skelett enthält diese Sequenz das 3'-Ende des U6-Promoters, der die sgRNA-Transkription motiviert. Das Array "CACC" garantiert, dass der Oligo mit den Überhängen des BbsI-verdauten pX330-xCas9-Plasmids übereinstimmt. Die Basis "G" ist eine Voraussetzung für RNA Polymerase III Promotoren und garantiert die effektive Inbetriebnahme der sgRNA-Transkription (z.B. anhängen das 5'-CACCG-Array an den Protospacer von T1, das Erreichen von T1-F: CACCGTGCGCGCCTCTCTGGCCGC [25 nt]). Die Spaltungseffizienz von 21 nt gRNA unterscheidet sich signifikant von der von 20 nt gRNA^1,12,13,14. Es wird allgemein empfohlen, 20 nt mit 5'-G zu verwenden, indem Sie einen kürzeren Protospacer erzeugen, wenn dies nicht möglich ist, dann können 21 nt mit zusätzlichem 5'-G verwendet werden.
3. Erstellen Sie eine umgekehrte Ergänzung (rc) der Protospacer-Sequenz.
   HINWEIS: Der RC des T1-Protospacers ist beispielsweise GCGGCCAGTAGGAGCAGGCA (20 nt).
4. Fügen Sie AAAC an das 5'-Ende der rc-Protospacer-Sequenz an. Fügen Sie ein zusätzliches C an das 3'-Ende des rc-Protospacers an.
   HINWEIS: Die "AAAC"-Sequenz stellt sicher, dass das Oligonukleotid zum Klonen in das bbsI-verdaute pX330-xCas9-Plasmid geeignet ist. Das zusätzliche "C" am 3'-Ende ist für das Glühen mit der oben beschriebenen sgRNA-Transkription unerlässlich (z.B. AAACGCGGCCAGTAGGAGCAGGCAC [25 nt] ist die letzte Oligonukleotidsequenz für T1 rc protospacer).
5. Bestellen Sie die Oligonukleotide.

3. Oligonukleotid-Glühen

1. Lyophilisierte Oligonukleotide in doppeldestilliertem Wasser (ddH₂O) verdünnen.
2. Mischen Sie Vorwärts- und Rückwärtsoligonukleotide in einem dünnwandigen PCR-Rohr mit einem Verhältnis von 1:1 (z. B. je 20 l), ohne einen zusätzlichen Puffer hinzuzufügen.
3. Inkubieren Sie die Mischung bei 95 °C für 5 min und rampen Sie dann die Temperatur auf 72 °C für 10 min. Folgen Sie mit einer Abkühlzeit bei Raumtemperatur (RT), die darin besteht, die Probe einfach von der PCR-Maschine zu entfernen und bei RT zu platzieren.
   HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Oligonukleotid-Mischungen zu phosphorylieren, um die Ligation zu erleichtern.

4. sgRNA/CRISPR Vektorverdauung

1. Digest 1 g des ausgewählten pX330-xCas9-Vektors mit BbsI (10 Einheiten Enzym pro 1 g Plasmid) für 2 h bei 37 °C(Abbildung 2). Führen Sie die Verdauung des pX330-xCas9 sgRNA Expressionsvektors in einem Gesamtvolumen von 50 l durch, das 5 l 10-fachen Verdauungspuffer und destilliertes Wasser enthält, um das Endvolumen zu erreichen.
2. Reinigen Sie den verdauten Vektor durch Bandextraktion von einem 2% Agarose-Gel unter 10 V/cm und reinigen Sie anschließend mit einer Kieselsäuresäule mit einem kommerziellen Gel-Extraktionskit.

5. Ligation der geglühten sgRNA-Oligonukleotide zum Expressionsvektor

1. Mischen Sie die geglühten sgRNA-Oligonukleotide (5 l der Mischung aus Schritt 4) mit dem BbsI-verdauten pX330-xCas9-Vektor (gereinigt, 100 ng).
2. Fügen Sie 1 L Ligase und 1 l 10x LigasePuffer hinzu.
3. Destilliertes Wasser mit entsprechendem Volumen, bis zu 10 l, hinzufügen.
4. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.

6. Kompetente Zelltransformation

1. E. coli DH5- kompetente Zellen bei -80 °C aus der Lagerung nehmen und auf Eis auftauen.
2. Fügen Sie 5 l der Ligationsmischung auf 50 l des kompetenten E. coli DH5- und 30 min auf Eis zu halten.
3. Hitze schockieren das Gemisch bei 42 °C für 90 s.
4. Ruhen Sie es auf Eis für 2 min.
5. Stellen Sie die Kultur auf einem Drehshaker in 500 l LB-Medien für 1 h bei 37 °C wieder her.
6. Platte 200 l der Kultur auf einer Ampicillinresistenz LB Agaroseplatte und inkubieren Sie es über Nacht bei 37 °C.

7. Identifizierung der richtigen rekombinanten Plasmide durch PCR

1. Wählen Sie 5 bis 10 Bakterienkolonien aus der LB-Platte und verwenden Sie jede von ihnen, um ein 1,5 ml-Rohr mit 1 ml LB-Medien mit 60 mg/ml Ampicillin zu impfen.
2. Inkubieren Sie die Rohre auf einem Drehschüttler für 2-3 h.
3. Durchführung des Nachweises korrekter rekombinanter Plasmide unter Verwendung spezifischer Primerpaare für die sgRNA-Oligonukleotide [z.B. Vorwärtsprimer für T1 sgRNA Expressionsvektorkonstruktion (T1-F): CACCGTGCGCGCTCCTACTCTCTGCGC, Reverse Primer (BbsI-R): AAAGTCCCTATTGGCGTTAC, Produktion eines 287 bp Amplicon (Abbildung 3)].
   1. Bereiten Sie die PCR-Mischung vor (Tabelle 2).
   2. Verwenden Sie die folgenden PCR-Zyklusbedingungen: 95 °C für 5 min für die Vordenaturierung; 30 Zyklen von 95 °C für 30 s für Denaturierung, 60 °C für 30 s zum Glühen und 72 °C für 30 s für Dieverlängerung. Nach Abschluss der 30 Zyklen einen letzten Verlängerungsschritt durch Erhitzen für 5 min bei 72 °C durchführen.
   3. Führen Sie das PCR-Produkt auf einem 2% Agarose-Gel unter 10 V/cm aus. Ein Band mit der richtigen Größe [z.B. 287 bp] gilt als positiv.

8. Validieren Sie die Sequenz des sgRNA-Expressionsplasmids

1. Überprüfen Sie die Reihenfolge der PCR-positiven Kolonien durch Sanger-Sequenzierung¹⁵ mit dem Reverse Primer BbsI-R (siehe Schritt 7.3). Diese Grundierung anneals an der Stelle flussabwärts des sgRNA Oligoeinsatzes. Die pX330-xCas9-T1, die eine sgRNA-Sequenz mit Protospacer TGCCTGCTCTTACTGGCCGCGG und xCas9 exzessiiert, wurde konstruiert.
2. Verwenden Sie die Vorwärtsgrundierung T1-F, um die positiven Kolonien zu sequenzieren. Der Vorwärts-Teil konnte keine vollständigen Sequenzinformationen für die Stelle geben, die die Einfügestelle des sgRNA-Oligos umgibt, da 30-50 bp Fragment nach dem Sequenzierungsprimer nicht genau ausgelesen werden konnte.

9. Konstruktion von dualen luziferase Reporter Vektor

1. Synthesize 300-500 bp DNA-Fragmente, die die sgRNA-Ziele enthalten, und subklonieren Sie es in einen dualen Luziferase-Reportervektor durch Doppelverdauung [z.B. Subklon 440 bp Schafe DKK2 exon1 Fragment in pSSA-Dual Plasmid^16,17 durch Die Verwendung von Doppelverdauung mit AscI und SalI, resultierende pSSA-Dual-DKK2].
2. Synthesize 300-500 bp DNA-Fragmente, die die sgRNA-Ziele enthalten. Beachten Sie, dass die Sequenzen der DNA-Fragmente Teile der genomischen Sequenzen sein müssen, die von der NCBI-Website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) oder verwandten Referenzen abgerufen werden könnten.
3. Wählen Sie einen geeigneten Dual-Luziferase-Reportervektor wie pSSA-Dual^16,17 (oder zwei Vektoren, die Galleluzifase bzw. Renilla-Luziferase exdrücken) und verdauen Sie dann diesen Vektor und die oben genannten DNA-Fragmente mit zwei Endonukleasen wie AscI und SalI.
4. Schließlich ligate diese beiden Fragmente mit T4 DNA Ligase, was zu pSSA-Dual-Target. Einzelheiten für die Doppelverdauung und Ligation sind in Tabelle 3 bzw. Tabelle 4aufgeführt. Es ist erwähnenswert, dass der Reportervektor in stabilen Bakterienstämmen (wie Top10) verstärkt werden sollte, die mit niedrigerer Rotationsgeschwindigkeit (in der Regel nicht mehr als 200 Umdrehungen pro Minute) kultiviert werden sollen, um eine DNA-Rekombination zu vermeiden.

10. Zelltransfektion

1. Extrahieren Sie Endotoxinfreie Plasmide für die oben genannten Vektoren. Bewerten Sie die Reinheit und Konzentration der Plasmide mit geeigneten Instrumenten. Für diese Plasmide wird eine Endkonzentration von nicht weniger als 500 ng/l und ein Reinheitsverhältnis von 1,7-1,9 bei Absorptionsstärke 260/280 nm (A260/A280) empfohlen.
2. Kotranstranssektieren Sie eine geeignete Zelllinie wie PIEC¹⁸ mit den Plasmiden in gleichem Verhältnis (z.B. pX330-xCas9-T1: pSSA-Dual-DKK2=1:1, 0,5 g Plasmid für jede Duplizierung bei Verwendung von 24 Well-Platten). Verwenden Sie einen leeren Vektor wie pX330-xCas9 als negatives Steuerelement.
   1. Einen Tag vor der Transfektion, Plattenzellen in einer 24-Well-Kulturplatte mit einer Dichte von 2 x 10⁵ Zellen/Well. Zellen sind bereit für die Transfektion, wenn sie einen Zusammenfluss von 60-80% erreichen.
   2. Vor dem Transfektionszeitpunkt den Überstand so weit wie möglich entfernen und für jeden Brunnen vorsichtig 0,5 ml frische Medien hinzufügen.
   3. Transfektionsreagenz in DMEM-Medien im Verhältnis 1:25 verdünnen und gut mischen.
   4. Bereiten Sie den Master-Mix der DNA vor, indem Sie 0,5 g DNA in 25 l DMEM-Medien verdünnen, und fügen Sie dann 1 L P3000-Reagenz hinzu.
   5. Fügen Sie verdünnte DNA zu jeder Tube des verdünnten Transfektionsreagenzes (1:1 Verhältnis) hinzu.
   6. 10–15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   7. Fügen Sie den Zellen 50 L DNA-Lipid-Komplex hinzu.
   8. Inkubieren Sie Zellen für 24 h bei 37 °C. Analysieren Sie dann transfizierte Zellen wie in Schritt 11.

11. Dual-Luciferase-Erkennung

1. Bereiten Sie eine ausreichende Menge des 1x passiven Lysepuffers (PLB) vor, indem Sie 1 Volumen von 5x PLB zu 4 Volumen destilliertem Wasser hinzufügen und gut mischen.
2. Passive Lyse von Zellen, die in 24-Well-Kulturplatten kultiviert werden.
   1. Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den kultivierten Zellen, und wenden Sie vorsichtig ein ausreichendes Volumen an Phosphatgepufferter Saline (PBS) an, um die Oberfläche des Kulturgefäßes zu waschen. Wirbeln Sie das Gefäß kurz, um abgetrennte Zellen und Restwachstumsmedium zu entfernen. Entfernen Sie die Spüllösung vollständig, bevor Sie PLB-Reagenz auftragen.
   2. Geben Sie 100 l 1x PLB in jede Kultur gut, um die Zellmonolayer vollständig abzudecken. Lassen Sie die Kulturplatten für 20 min stehen.
   3. Übertragen Sie das Lysat zur weiteren Handhabung oder Lagerung in ein Rohr oder eine Durchstechflasche.
3. Bereiten Sie Luziferase-Assay-Reagenz (LAR) vor, indem Sie das mitgelieferte lyophilisierte Luziferase-Assay-Substrat in 10 ml des mitgelieferten Luziferase-Assaypuffers wieder aufsetzen.
4. Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen vor, um die gewünschte Anzahl von Dual-Luciferase-Reporter-Assays (100 L Reagenz pro Assay) durchzuführen. Fügen Sie 1 Volumen von 50x Stop-Substrat zu 50 Volumen Stop-Puffer in einem Glas oder silikonisierte Polypropylen-Rohr.
5. Dual-Luciferase-Reporter (DLR) Assay
   1. Programmierluminometer, um eine 2-Sekunden-Vorleseverzögerung zu gewährleisten, gefolgt von einem 10-Sekunden-Messzeitraum.
   2. Vorgeben Sie 100 l Luziferase-Assay-Reagenz in die entsprechende Anzahl von Luminometer-Röhren, um die gewünschte Anzahl von DLR-Assays zu vervollständigen.
   3. Sorgfältig bis zu 20 l Zelllysat in das Luminometerrohr mit LAR übertragen; 2- oder 3-mal durch Pipettieren mischen. Legen Sie das Rohr in das Luminometer und initiieren Sie das Lesen.
   4. Entfernen Sie das Probenröhrchen aus dem Luminometer, fügen Sie 100 L Stop-Reagenz und Wirbel kurz hinzu, um sie zu mischen. Ersetzen Sie die Probe im Luminometer, und initiieren Sie das Lesen.
   5. Zeichnen Sie die Renilla-Luziferase-Aktivität normalisiert, um die Galle Luziferase Aktivität, nämlich die reziproke des Verhältnisses auf dem Bildschirm angezeigt.
   6. Entsorgen Sie das Reaktionsrohr, und fahren Sie mit dem nächsten Test fort.

Ergebnisse

Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden sind für die Konstruktion von sgRNA- und xCas9-Expressionsvektoren und dann für das Optimierungsscreening von sgRNA-Oligos mit relativ höheren Gen-Targeting-Effizienzen. Hier zeigen wir ein repräsentatives Beispiel von 3 sgRNA-Zielen für Schafe DKK2 exon 1. SgRNA- und xCas9-Expressionsvektoren können durch Vorverdauen des Vektorrückgrats (Abbildung 2) aufgebaut werden, gefolgt von der Ligaung in einer Reihe kurzer Doppelstrang-DN...

Diskussion

Die sgRNA-Vektorklonierungsverfahren, die wir hier beschrieben haben, erleichtern die effiziente Produktion von sgRNAs, wobei die meisten Kosten aus der Oligonukleotid-Reihenfolge und Vektorsequenzierung abgeleitet werden. Während die skizzierte Methode entwickelt wurde, um Benutzern die Generierung von sgRNAs für die Verwendung mit CRISPR/Cas9 zu ermöglichen, kann das Protokoll leicht für die Verwendung mit Cas9-Orthoologen oder anderen RNA-geführten Endonukleasen wie Cpf1 angepasst werden, wodurch kleinere Modifik...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A new generation of full touch screen gradient PCR instrument	LongGene	A200	Target gene amplification
AscI restriction enzymes	New England Biolabs	R0558V	Cutting target vectors
BbsI restriction enzyme	New England Biolabs	R0539S	Cutting target vectors
Clean workbench	AIRTECH	SW-CJ-2FD/VS-1300L-U	A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment
DH5α Competent Cells	TaKaRa	K613	Plasmid vector transformation
Dual-Luciferas Reporter Assay System	Promega	E1910	Dual-luciferas reporter assay
Electric thermostatic water bath	Sanfa Scientific Instruments	DK-S24	Heating reagent by constant temperature in water bath
Electrophoresis	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	DYY-6C	Control voltage, current, etc.
Eppendorf Reference 2	Eppendorf China Ltd.	Reference 2	Accurately draw and transfer traces of liquid
Gel imaging analyzer	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	WD-9413B	For the analysis of electrophoresis gel images
GloMax 20/20 Luminometer	Promega	E5311	Detect dual luciferase activity
High speed refrigerated centrifuge	BMH	sigma 3K15	Nucleic acid extraction and purification
Intelligent biochemical incubator	Sanfa Scientific Instruments	SHP-160	Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment
LB Broth Agar	Sangon Biotech	A507003-0250	For the cultivation of E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit	Thermo Fisher	L3000015	DNA Transfection
SalI restriction enzymes	New England Biolabs	R3138V	Cutting target vectors
SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit	Sangon Biotech	B518131-0050	Recycling DNA fragments
SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit	Sangon Biotech	B518191-0100	Extraction of plasmid DNA
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202V	Link DNA fragment
TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0	TaKaRa	9761	DNA purification
Vertical pressure steam sterilizer	JIBIMED	LS-50LD	High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment
Water bath thermostat	Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.	SHZ-82	Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air.