הערכה של התנהגויות פוטוסינטתיים על ידי מדידות סימולטני של השתקפות עלה וניתוחים כלורופיל פלואורסצנטית

Summary

אנו מתארים גישה טכנית חדשה כדי ללמוד תגובות פוטוסינטתיים בצמחים גבוהים יותר מעורבים מדידות בו של כלורופיל מחזירי אור והשתקפות העלה באמצעות פאם ורדיומטר ספקטרלי לאיתור אותות מן אותו אזור עלה באראידאופזיס.

Abstract

כלורופיל a ניתוח פלואורסצנטית משמש רבות כדי למדוד התנהגויות פוטוסינתטית בצמחים שלמים, והביא לפיתוח של פרמטרים רבים, כי ביעילות למדוד הפוטוסינתזה. ניתוח השתקפות העלה מספק מדדים צמחייה באקולוגיה ובחקלאות, כולל מדד ההשתקפות הפוטוכימית (PRI), שניתן להשתמש בו כאינדיקטור לפליטת אנרגיה תרמית במהלך הפוטוסינתזה משום שהוא תואם שאינם כימיקלים פוטוכימיים (NPQ). עם זאת, מאחר ש-NPQ הוא פרמטר מורכב, האימות שלו נדרש כדי להבין את טבעו של הפרמטר PRI. כדי להשיג ראיות פיסיולוגיים עבור הערכה של הפרמטר PRI, אנו בו למדוד כלורופיל פלואורסצנט השתקפות העלה במחזור קסופיל פגום מוטציה (npq1) ו-פראי מסוג Arabidopsis צמחים. בנוסף, את הפרמטר qZ, אשר כנראה משקף את מחזור קסופיל, חולץ מן התוצאות של ניתוח כלורופיל פלואורסצנטית על ידי ניטור קינטיקה הרפיה של NPQ לאחר החלפת האור. מדידות אלה בוצעו באמצעות אפנון משרעת הדופק (פאם) כלורופיל פלואורומטרים ורדיומטר ספקטרלי. הבדיקות סיבים משני המכשירים היו ממוקמים קרוב זה לזה כדי לזהות אותות מאותו מיקום עלה. מקור אור חיצוני שימש להפעלת הפוטוסינתזה, ונוריות המדידה והאור הרווי סופקו מכלי פם. מערכת ניסויית זו אפשרה לנו לפקח על פרי תלוי האור במפעל שלם וגילה כי שינויים תלויים באור ב-PRI שונים באופן משמעותי בין סוג פראי ו npq1 מוטציות. יתר על כן, PRI היה בקורלציה מאוד עם qZ, כלומר qZ משקף את מחזור קסופיל. יחד, מדידות אלה הראו כי מדידה בו של השתקפות העלה ו-כלורופיל פלואורסצנטית היא גישה חוקית להערכת פרמטרים.

Introduction

השתקפות העלים משמשת לחוש מרחוק מדדי צמחייה המשקפים פוטוסינתזה או תכונות בצמחים^1,2. מדד הצמחייה המנורמלת (ndvi), המבוסס על אותות השתקפות אינפרא-אדום, הוא אחד המדדים הידועים ביותר בתחום הצומח לאיתור מאפיינים הקשורים לכלורופיל, והוא משמש בתחום האקולוגיה והמדעים החקלאיים כ אינדיקציה לתגובות סביבתיות בעצים או ביבולים³. במחקרים בשטח, למרות פרמטרים רבים (למשל, כלורופיל index (CI), אינדקס מים (WI), וכו ') פותחו ושימשו, כמה וכמה מפורט של מה הפרמטרים הללו ישירות (או בעקיפין) לזהות בוצעו באמצעות מוטציות.

הדופק משרעת אפנון (פאם) ניתוח של כלורופיל פלואורסצנטית היא שיטה יעילה למדוד תגובות פוטוסינתטית ותהליכים המעורבים פוטוסינתטיים II (פסיב)⁴. כלורופיל הקרינה ניתן להבחין עם מצלמה משמש להקרנה מוטציות פוטוסינתזה⁵. עם זאת, זיהוי המצלמה של כלורופיל פלואורסצנטית דורש פרוטוקולים מורכבים כגון טיפול כהה או פעימות הרוויה באור, אשר קשה ליישם במחקרים שטח.

העלה נספג אנרגיה סולארית אור נצרך בעיקר על ידי תגובות פוטוסינתטית. לעומת זאת, ספיגת אנרגיית אור עודפת יכולה ליצור מינים של חמצן תגובתי, הגורמת נזק למולקולות פוטוסינטתיים. אנרגיה עודפת עודף חייב להיות מתפזר כחום באמצעות שאינם פוטוכימיקלים (NPQ) מנגנונים⁶. מדד ההשתקפות של פוטוכימיה (PRI), המשקף שינויים תלויי-אור בפרמטרים של השתקפות העלה, נגזר מההשתקפות של הפס הצר ב-531 ו-570 nm (אורך הגל ההפניה)^7,8. הוא דיווח לתאם עם NPQ בניתוח כלורופיל פלואורסצנטית⁹. עם זאת, מאז NPQ הוא פרמטר מורכב הכולל את המחזור קסופיל, מסורת המדינה, ו-photoinhibition, אימות מפורט נדרש כדי להבין מה הפרמטר PRI מודד. התמקדנו במחזור קסופיל, מערכת פיזור תרמית המערבת את דה-אפוקסי של פיגמנטים מבוססי קסופיל (ויאקאנדק לאנתרמיה וזקסנדק) ומרכיב עיקרי של NPQ משום שקשרים בין פרי והמרה של אלה פיגמנטים דווחו במחקרים קודמים⁸.

מוטציות רבות הקשורות לפוטוסינתזה מבודדות וזוהו בarabidopsis. Npq1 מוטציה אינו מצטבר וזקסנדק משום שהוא נושא מוטציה ב-de-אפוקסי דה-אפוקסידל (vde), אשר מזרז את ההמרה של ויואקאנדק לווזקסנדק¹⁰. כדי לקבוע אם פרי רק מזהה שינויים בפיגמנטים קסופיל, אנו בו נמדד PRI ו כלורופיל פלואורסצנטית באותו אזור עלה ב npq1 ואת הפראי סוג ולאחר מכן גזור NPQ בסולמות זמן שונים של הרפיה כהה כדי לחלץ מרכיב ה-קסנפיזיל הקשור¹¹. המידות הסימולטניות מספקות טכניקה בעלת ערך להקצאה של מדדי צמחייה. יתרה מזאת, מכיוון שפרי התואם לפרודוקטיביות הראשונית הגסה (GPP), היכולת להקצות את PRI בדיוק לרכיב אחד יש יישומים חשובים באקולוגיה¹².

Protocol

1. טיפוח הצמחים הערידופזיס

1. משרים את הזרעים של המלון במים מעוקרים בתוך מיקרוצינורית, ומודתיטה למשך יומיים ב -4 ° c בחשכה.
2. מניחים כ -4 מתוך הספוג, הזרעים שטופלו קר על פני הקרקע באמצעות מיקרופיפטה. מודטה את הסירים שנשתלו בחדר הגידול עם אור 16 h (120 μm הפוטונים מ^{– 2} s^{– 1}) ו 8 h התקופה החשוכה ב 22 ° צ' ו 20 ° c, בהתאמה.
3. לגדל צמח אחד לכל סיר על ידי דילול שתילים אחרים לאחר נביטה. הכינו לפחות חמישה סירים. מודלת את הצמחים בחדר הגידול במשך 4 שבועות נוספים. שלושה מפעלים משמשים לניסויים.
4. השתמש בעלה המבוגר והפתוח למדידות הפוטוסינתזה.

2. הגדרת השלב לדוגמה, מכשירים פוטוסינתטיים ומקור אור

הערה: עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש בשלב מדגם מותאם אישית לתיקון בדיקות עלים וגילוי (איור 1).

1. לחבר צלחת 10 ס מ² פלדה עם חור קוטר 1 ס מ על הבמה מותאם אישית לדוגמה. גודל החור בצלחת זו ניתן לשנות כדי להכיל דגימות עלה שונות או מינים צמח. הבמה כוללת קליפ לתיקון בדיקות האיתור והמתאם להתאמת המרחק בין הבדיקות ודגימת העלה.
2. הכינו בדיקה של סיבים דקים עבור מדידת כלורופיל פלואורסצנטית והשתקפות העלה. אלה בדיקה סיבים דקים ימוקמו באופן מקרוב, כך שהם מודדים אותות מאותו מיקום עלה.
   הערה: כלורופיל פלואורומטר של פם ורדיומטרים ספקטרליות הותאמו לזיהוי אותות של כלורופיל מחזירי אור והשתקפות עלים, בהתאמה. שני המכשירים משתמשים בבדיקות סיבים דקים עם קטרים של 1 מ"מ ו -2 מ"מ, בהתאמה.
3. התאימו את שני הגששים האלה בחוזקה ועטפו אותם בנייר פלסטיק.
4. הצמד את הבדיקות הודבקו לשלב המדגם באמצעות מחזיק עדשה קואקסיאלי (ראה איור 1), ומקם אותם אנכית למשטח העלה.
   הערה: שדה הראייה של כבל הסיבים האופטיים במד הקרינה הספקטרלי הוא α = 25 °. בשיטה זו, המרחק בין עצות בדיקה סיבים ומשטח עלה הוא קצר יותר 1 ס מ. לכן, אזור עלה המדידה הוא כמעט זהה לזה של סיבים.
5. הצמד מדריך תאורה בימוזני עשוי מסיבי זכוכית למקור האור הלוגן ומקרין את השלב המדגם משני הכיוונים בזוויות של כ 45 °.
   הערה: מנורת הלוגן, הקרובה להתפלגות אורך הגל של אור השמש הטבעי, משמשת כאור אקמית לגרימת פוטוסינתזה. מקור האור הלוגן הותאם עם מסנן קר מובנה, אשר מסיר אורכי גל ארוך מתוך האינפרא אדום, כדי למנוע עליות בטמפרטורת פני העלה (λ = 400 כדי 800 nm).
6. כוונן את מקור האור כך שהאור יהיה אחיד ומאיר את השלב לדוגמה מבלי להטיל צל.

3. הגדרת מדידות סימולטני של השתקפות העלה והכלורופיל פלואורסצנטית

הערה: כל השלבים מתבצעים בחדר החשוך כדי למנוע את גילוי האור השונה מאור אקמית. אור ירוק חלש (למשל, cellophaned light) צריך להיות כבוי לפני המידות בפועל.

1. מדידת המרחק בין דגימת העלה לבין הבדיקות בשלב המדגם.
   1. מניחים עלה בדיקה על מחזיק העלה של השלב לדוגמה בחושך. לחצו על העלה כנגד צלחת פלדה על הבמה (ריבוע שחור באיור 1).
   2. הדליקו את הפאם והדליקו את דגימת העלה באור מדידה. ערכי עוצמות הכלורופיל של הקרינה הפלואורסצנטית מאושרות באמצעות תוכנת השליטה של פאם (ראה טבלת חומרים).
   3. הזיזו את המתאם כך שעוצמת. הקרינה הפלואורסצנטית תמדוד כ-100 למדוד את המרחק בין המכשיר לבין העלה. תקן את המתאם ורשום את הערך של המרחק במתאם.
   4. . כבה את האור המדידה הסר את עלה הבדיקה.
2. מדידת עוצמות הזוהר של האור האקוריק
   הערה: כדי להתבונן באופני התנהגות פוטוסינתטיים תלויי-אור, אור אקקמית בעוצמה משתנה משמש לצורך הצגת דגימת העלה.
   1. הגדר מד קוונטי קל במיקום בו העלה לדוגמה ימוקם.
   2. מקרין אור ממקור אור הלוגן ומדידת העוצמה.
   3. לקבוע אילו מיקומים של חיוג מקור האור יפיק עוצמות של 30, 60, 120, 240, ו480 μ:פוטונים m^{– 2} s^{– 1}.
      הערה: צמחי Arabidopsis גדלים תחת 120 μm מול פוטונים^{– 2} s^{– 1}; לפיכך, העוצמות האירואיות של האור האקוריק נבחרו על מנת לספק מגוון של עוצמות קטנות וגדולות.
   4. סמן כל עוצמת הקרינה על החוגה.
3. מדידת תקן השתקפות.
   הערה: תקן השתקפות נדרש כדי לחשב את יחס ההשתקפות של העלה בכל אינטנסיביות מקרינה.
   1. מניחים צלחת לבנה כתקן השתקפות במיקום של דגימת העלה.
   2. . תדליק רדיומטר ספקטרלי האות השתקפות מוצג על ידי. תוכנת השליטה של הרדיומטר הספקטרלי בשלב זה, אין נתונים ספקטרלי כי אין אור מקרין.
   3. הפעל את מנורת הלוגן כדי להקרין עם 480 μm בפוטונים מ^{– 2} s^{– 1}, את העוצמה הגבוהה ביותר הקרינה במבחן הזה.
   4. כוונן את עוצמת הזיהוי של מד הקרינה כדי למנוע רוויה.
   5. הקלטת השתקפות ספקטרלית בין 450 – 850 ננומטר ב 1 מרווחי ננומטר תחת תאורה עם 30, 60, 120, 240, ו 480 μm פוטונים^{– 2} s^{– 1}.
      הערה: אות חשמל בסיסית (זרם כהה) מתוקנת ומופחתים בכל מדידה ספקטרלית.

4. מדידות בו של השתקפות העלה והכלורופיל לקרינה פלואורסצנטית וחישוב פרמטרים פוטוסינתטיים

1. הציבו מפעל בתנוחת דגימת העלה.
   1. העבירו את צמח Arabidopsis מן החדר המבוגר אל החדר החשוך מבוקר עם אותה טמפרטורה ולחות כמו זה של חדר הצמיחה.
   2. מכון המפעל במשך 1 שעות בחושך ב -22 ° צ' כדי להפיג את האלקטרונים ממרכז התגובה של מרכז התגובות ולהירגע מתוך כימיה לא-פוטוכימית.
   3. מניחים את הצמח הכהה המותאם כולו על שקע מעבדה תחת השלב לדוגמה (איור 1).
   4. לתקן את העלה לדוגמה על מחזיק העלה, כך משטח העלה הוא בניצב לבדיקות זיהוי.
2. מדידה של התשואה הקוונטית המירבית של פסיב.
   1. תדליק את הפאם ותתחיל. להקליט את העקומה ערך זה נקרא 0.
   2. הפעל את אור המדידה, והמתן כ-30 בקירוב לעיקול כדי להגיב. ערך זה נקרא F₀.
   3. תן דופק רווי של 4000 μm בפוטונים מ^{– 2} s^{– 1} עבור 0.8 s מתוך פאם.
   4. השג את הערך הגבוה ביותר של הדקר בעקומה עם עוצמת קרינה מוגברת. ערך זה נקרא F_M.
   5. חשב את התשואה הקוונטית המירבית של פסיב בחשיכה (F_V/f_M), באמצעות המשוואה הבאה.
      F_V/f_M = (f_m – F₀)/ F_m
3. מדידת התנהגויות פוטוסינטטיות במצב יציב.
   1. הפעל את מנורת הלוגן כמקור האור החיצוני עם אור המדידה לאחר הקלטת F_M (ראה 4.2.4). ראשית, הדליקו את דגימת העלה עם האור החלש ביותר (30 μm בפוטונים –² s^{– 1}).
   2. הפעל את מד הקרינה הספקטרלי באותו הזמן כדי לעקוב אחר השתקפות העלה.
   3. המתן 20 דקות או יותר עבור התגובה פוטוסינתטית להגיע למצב יציב תחת תנאי האור. העוצמה הפלואורסצנטית של המצב הקבוע נקראת Fs.
   4. לספק דופק שחור במרווחים של 1 דקות במהלך תאורה עם האור האקאני. ערך הזריחה המקסימלי שהושג תחת האור הפעמו נקרא F_M′.
   5. להקליט את הנתונים של F_M′ ב 20 דקות לאחר הפעלת האור האקמית.
   6. לקחת נתונים השתקפות העלה על ידי ממוצע 10 סריקות בזמן שילוב אופטימיזציה, עם חיסור הנוכחי כהה.
4. חישוב של פרמטרים פוטוסינתטיים במצב יציב.
   1. חשב את התשואות הקוונטיות של הפוטוכימיה של פסיי_(Φ), שניתן להעריך באמצעות הקרנת פולסים רוויים תחת אור אקקמית, באמצעות המשוואה הבאה.
      Φ_פסיב = (F_M′- F_S)/ F_M′
   2. מעריכים את שטף האלקטרונים הליניארי (השמאלי) ממרכז התגובות של ה-פסיא כדלקמן ⁴.
      שמאלה = העוצמה האיקרינה של האור האקוריק × Φ_פסיב × 0.5 × 0.84
   3. חשב את ה-NPQ, שניתן לבטא את הפיזור התרמי, באמצעות המשוואה הבאה.
      NPQ = (F_M - F_M′)/ F_M′
      הערה: אנרגיית האור נצרכת בעיקר על-ידי תגובות הפוטוסינתזה. עם זאת, כאשר הצמחים סופגים אנרגיה קלה יותר מאשר אנרגיה הנצרכת על ידי הפוטוסינתזה, המנגנון של פליטת תרמית הם המושרה כדי למנוע את עודפי האנרגיה.
   4. באמצעות נתונים ספקטרלי שנרכשו עם רדיומטר תחת אותם תנאים אור, לחשב את היחס השתקפות העלה כדלקמן.
      יחס השתקפות = R_עלה /r_{סטנדרטי}
   5. חישוב פרי מ 531 ננומטר ו 570 nm כדלקמן. שני אורכי גל אלה מופקים מיחס השתקפות.
      פרי = (R₅₃₁– r₅₇₀)/(r₅₃₁+ r₅₇₀)
      הערה: R הוא השתקפות.
5. מדידת קינטיקה של הרפיה של שאינם פוטוכימיקלים.
   1. כבה את האור האקאני לאחר. שרכשת השתקפות של העלה
   2. לעקוב אחר כלורופיל פלואורסצנטית על ידי פאם במשך 10 דקות לאחר כיבוי האור.
   3. לספק דופק שחור במרווחים של 1 דקות במהלך הרפיה כהה. הערך המרבי של הזריחה הנגרמת על ידי פעימת הרוויה תחת הכהה נקרא F_M′ ' ′. השג 10 של F_M′ ′ במבחן אחד.
   4. שמור את הנתונים של F_M′ ′ ב 2 דקות ו-10 דקות לאחר כיבוי האור האקשתי.
   5. הפוך את האור האקאני על הגדר לעוצמת הקרינה הבאה, 60 μ בפוטונים מ^{– 2} s^{– 1}.
   6. חזור על עיבוד אור עבור 20 דקות והרפיה כהה עבור 10 דקות עם אור רוויה של פעימות במרווחי זמן של 1 דקות. הקלט את כל הנתונים כמתואר לעיל. חזור על כל השלבים והמדידות באמצעות הקרנה ב-120, 240 ו480 μ m^{– 2} s^{– 1}.
6. החישוב של הפרמטרים של כימיקל שאינם פוטוכימיים מן הקינטיקה הרפיה.
   הערה: אינדוקציה תלוי אור של NPQ הוא רגוע על ידי כיבוי מקור האור¹³. ניתן לאנגיופלסטיקה כל פונקציה NPQ על ידי התאמת קשקשים זמן הרפיה.
   1. להעריך את qE (מקווצ'ינג תלוי האנרגיה) השבר באמצעות F_M′ ′ לאחר הסתגלות 2 דקות כהה.
      qe = (F_M2m′ ′ –F_M′)/ F_M′
      הערה: השבר qE מתהפך במהירות בתוך 1 – 2 דקות. שבר זה כולל בעיקר psbs פרוטונציה וחלק המרה קסופיל, אשר תלויה ΔpH המושרה באור על פני קרום תילקואיד¹³. שניהם הפיכה בפירוט של מעבר הצבע.
   2. לחשב את qZ (מקוואקאקאז התלויה התלויים) שבר באמצעות F_M′ ′ לאחר 10-דקות הסתגלות כהה.
      qz = (F_M10m′ ′ –F_M′)/ F_M′
      הערה: קינטיקה הרפיה של NPQ ב כ 10 דקות לאחר האור לאחר האקאואית משקף מחזור קסופיל¹⁴. רוב ההמרה קסופיל הפוכה בצירי זמן ארוכים יותר של כ -10 דקות (qZ) מכיוון שההמרה דורשת תגובה אנזימטית של VDE. השבר הוא גם רגוע על ידי פירוק של ΔpH על פני קרום תילקואיד.
   3. חשב את הצ (מצב פוטועכבות) כדלקמן.
      qI = (f_M–f_M10m′ ′)/ f_m′
      הערה: ההתאוששות האיטית ביותר בקרב שברים NPQ הוא חשב להיות פוטונזק של פסיב (המציין את מחזור D1). חלק זה של מצב פוטועכבות (qI), אשר אינו מתאושש על ידי 10 דקות¹⁵.

תוצאות

איור 1 מציג תרשים סכמטי של הניסוי המוגדר לצורך בו מדידת כלורופיל פלואורסצנטית והשתקפות העלה. בדיקת סיבים של פאם ורדיומטר הספקטרלו הוגדרו ניצב על פני העלה על מחזיק העלה בשלב המדגם מותאם אישית, ומנורת הלוגן שימש הקרנה אור אקמית מכיוונים שמאל וימין מבלי להט?...

Discussion

במחקר זה, הצלחנו להשיג ראיות נוספות כדי להראות כי פרי מייצג פיגמנטים קסטאים על ידי במקביל מדידת כלורופיל פלואורסצנטית והשתקפות העלה.

אור הלוגן, שבו יש אורכי גל דומים לאור השמש, הותאם לשימוש כמקור אור אקמית להפעלת הפוטוסינתזה. השתמשנו בתחילה מקור אור LED לבן כדי למנוע נזק תרמי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halogen light source	OptoSigma	SHLA-150
Light quantum meter	LI-COR	LI-1000
PAM chlorophyll fluorometer	Walz	JUNIOR-PAM
PAM controliing software	Walz	WinControl-3.27
Reflectance standard	Labsphere, Inc.	SRT-99-050
Spectral radiometer	ADS Inc.	Field Spec3
Spectral radiometer controlling software	ADS Inc.	RS3