Yaprak Reflektasyonu ve Klorofil Floresan Analizlerinin Eşzamanlı Ölçümleri ile Fotosentetik Davranışların Değerlendirilmesi

Özet

Daha yüksek tesislerde fotosentetik tepkileri incelemek için yeni bir teknik yaklaşım tanımlıyoruz. Arabidopsis'te aynı yaprak alanı.

Özet

Klorofil bir floresan analizi yaygın bozulmamış bitkilerde fotosentetik davranışları ölçmek için kullanılır, ve verimli fotosentez ölçmek birçok parametre geliştirilmesi ile sonuçlandı. Yaprak yansıtma analizi, fotosentez sırasında termal enerji dağılımının bir göstergesi olarak kullanılabilen fotokimyasal yansıma indeksi (PRI) de dahil olmak üzere ekoloji ve tarımda çeşitli bitki idekleri sağlar. fotokimyasal olmayan söndürme (NPQ). Ancak, NPQ bileşik bir parametre olduğundan, PRI parametresinin doğasını anlamak için doğrulaması gereklidir. PRI parametresinin değerlendirilmesi için fizyolojik kanıt elde etmek için, aynı anda kanthophyll döngüsü kusurlu mutant(npq1)ve yabani tip Arabidopsis bitkilerde klorofil floresan ve yaprak yansıması ölçüldü. Ayrıca, büyük olasılıkla xanthophyll döngüsünü yansıtan qZ parametresi, ışığı kapattıktan sonra NPQ gevşeme kinetiği izleyerek klorofil floresan analizi sonuçlarından çıkarıldı. Bu eşzamanlı ölçümler pulse-genlik modülasyonu (PAM) klorofil florometresi ve spektral radyometre kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Her iki cihazdan gelen lif probları aynı yaprak konumundan gelen sinyalleri tespit etmek için birbirine yakın konumlandırılmış. Fotosentezi etkinleştirmek için harici bir ışık kaynağı kullanıldı ve pam aletinden ölçüm ışıkları ve doymuş ışık sağlandı. Bu deneysel sistem bozulmamış bitki ışık bağımlı PRI izlemek için bize sağladı ve PRI ışık bağımlı değişiklikler vahşi türü ve npq1 mutant arasında önemli ölçüde farklılık ortaya koymuştur. Ayrıca, PRI güçlü qZ ile ilişkili olduğunu, qZ xanthophyll döngüsünü yansıtan anlamına gelir. Bu ölçümler birlikte yaprak refleks ve klorofil floresansının eşzamanlı olarak ölçülmesinin parametre değerlendirmesi için geçerli bir yaklaşım olduğunu göstermiştir.

Giriş

Yaprak yansıtma, bitkilerde fotosentez ivediliği veya özellikleri yansıtan bitki ideklerini uzaktan algılamak için kullanılır^1,2. Kızılötesi yansıma sinyallerine dayanan normalleştirilmiş fark bitki indeksi (NDVI), klorofil ile ilgili özelliklerin saptanmasında en yaygın bilinen bitki indekslerinden biridir ve ekoloji ve tarımsal bilimlerde ağaçlarda veya bitkilerde çevresel tepkilerin göstergesi³. Saha çalışmalarında, birçok parametre (örneğin, klorofil indeksi (CI), su indeksi (WI), vb. geliştirilmiş ve kullanılmış olsa da, bu parametrelerin doğrudan (veya dolaylı olarak) algılandığı birkaç ayrıntılı doğrulama mutantlar kullanılarak yapılmıştır.

Klorofil floresansının pulse-genlik modülasyonu (PAM) analizi fotosentetik reaksiyonları ve fotosistem II (PSII)⁴ile ilgili süreçleri ölçmek için etkili bir yöntemdir. Klorofil floresan bir kamera ile tespit edilebilir ve fotosentez mutantlar tarama için kullanılan⁵. Ancak, klorofil floresan kamera tespiti, saha çalışmalarında uygulanması zor olan karanlık tedavi veya ışık doygunluğu darbeleri gibi karmaşık protokoller gerektirir.

Yaprak emilen güneş ışığı enerjisi ağırlıklı olarak fotosentetik reaksiyonlar tarafından tüketilir. Buna karşılık, aşırı ışık enerjisinin emilimi fotosentetik moleküllere zarar veren reaktif oksijen türleri oluşturabilir. Aşırı ışık enerjisi olmayan fotokimyasal söndürme (NPQ) mekanizmaları⁶ile ısı olarak dağıtılmalıdır. Yaprak yansıtma parametrelerindeki ışığa bağlı değişiklikleri yansıtan fotokimyasal yansıma indeksi (PRI), 531 ve 570 nm (referansdalga boyu) 7,⁸dar bant yansıtıcısından türetilmiştir. Klorofil floresananalizinde NPQ ile ilişkili olduğu bildirilmiştir9. Ancak, NPQ xanthophyll döngüsü, devlet geleneği ve fotoinhibisyonu içeren kompozit bir parametre olduğundan, ayrıntılı doğrulama PRI parametre ölçer anlamak için gereklidir. Biz xanthophyll döngüsü, xanthophyll pigmentlerin de-epoksidasyon içeren bir termal dağılım sistemi (antheraxanthin ve zeaxanthin için violaxanthin) ve NPQ ana bileşeni üzerinde duruldu çünkü PRI ve bu dönüşüm arasındaki korelasyon pigmentler önceki çalışmalarda bildirilmiştir⁸.

Arabidopsis'te fotosenteze bağlı birçok mutant izole edilmiş ve tanımlanmıştır. Bu viyolaxanthin de-epoksidaz bir mutasyon taşır çünkü npq1 mutant zeaxanthin birikmez (VDE), hangi zeaxanthin dönüşümkatalizler 10 . PRI sadece xanthophyll pigmentler değişiklikleri algılar olup olmadığını belirlemek için, aynı anda npq1 ve yabani tip aynı yaprak alanında PRI ve klorofil floresan ölçülen ve daha sonra karanlık gevşeme değişen zaman ölçeklerinde npQ diseksiyon ayıklamak için xanthophyll ile ilgili bileşen¹¹. Bu eşzamanlı ölçümler bitki ideklerinin atanması için değerli bir teknik sağlar. Ayrıca, PRI brüt birincil verimlilik (GPP) ile ilişkili olduğundan, PRI'yi tam olarak bir bileşeneatama yeteneği ekoloji 12'de önemli uygulamalara sahiptir.

Protokol

1. Arabidopsis bitkilerinin yetiştirilmesi

1. Arabidopsis thaliana tohumlarını sterilize edilmiş deiyonize suda mikrotüpte ıslatın ve karanlıkta 4 °C'de 2 gün kuluçkaya yatırın.
2. Bir mikropipet kullanarak toprak yüzeyine imbibed, soğuk işlenmiş tohumlar yaklaşık dört yerleştirin. Ekilen saksıları sırasıyla 16 h ışık (120 μmol foton m^–2 s^–1)ve 8 saat karanlık periyotla 22 °C ve 20 °C'de bir büyüme odasına yerleştirin.
3. Çimlenme den sonra diğer fideleri incelterek saksı başına bir bitki yetiştirin. En az beş tencere hazırlayın. Ek bir 4 hafta için büyüme odasında bitkiler inkübün. Deneyler için üç bitki kullanılır.
4. Fotosentez ölçümleri için en genç, tam açık olgun yaprağı kullanın.

2. Örnek sahnenin, fotosentetik aletlerin ve ışık kaynağının ayarlanması

NOT: Bu protokol için, yaprakları ve algılama sondalarını sabitlemekiçin özel olarak oluşturulmuş bir örnek sahne kullanılmıştır (Şekil 1).

1. Özel yapım numune aşamasına 1 cm çapında delikli 10 cm² çelik plaka takın. Bu plakadaki delik büyüklüğü farklı yaprak örnekleri veya bitki türlerini barındıracak şekilde değiştirilebilir. Sahne algılama probları sabitleme için bir klip ve problar ve yaprak örnek arasındaki mesafeyi ayarlamak için bir ayarlayıcı vardır.
2. Klorofil floresanve yaprak yansıtıcıölçümü için ince lif probları hazırlayın. Bu ince lif probları, aynı yaprak konumundan gelen sinyalleri ölçecek şekilde yakın bir şekilde konumlandırılır.
   NOT: Bir PAM klorofil florometresi ve spektral radyometre sırasıyla klorofil bir floresan ve yaprak yansıması sinyal tespiti için uyarlanmıştır. Her iki cihaz da sırasıyla 1 mm ve 2 mm çapında ince elyaf probları kullanır.
3. Bu iki prob'u sıkıca birbirine bağlayın ve plastik bantla sarın.
4. Bantlanmış probları koaksiyel lens tutucusu kullanarak örnek aşamaya takın (Şekil 1'e bakınız), ve yaprak yüzeyine dikey olarak yerleştirin.
   NOT: Spektral radyometredeki fiber optik kablonun görüş alanı α = 25°'dir. Bu yöntemde, lif sondası uçları ile yaprak yüzeyi arasındaki mesafe 1 cm'den kısadır. Bu nedenle, ölçüm yaprağı alanı hemen hemen bu lif aynıdır.
5. Halojen ışık kaynağına cam elyaftan yapılmış biforked Bir ışık kılavuzu takın ve numune aşamasını yaklaşık 45°'lik açılarla her iki yönden ışınlayın.
   NOT: Doğal güneş ışığının dalga boyu dağılımına yakın olan halojen lamba, fotosentezi sağlamak için aktinik ışık olarak kullanılır. Halojen ışık kaynağı, yaprak yüzey sıcaklığındaki artışları önlemek için kızılötesine yakın uzun dalga boylarını kaldıran dahili bir soğuk filtre ile uyarlanmıştır (λ = 400-800 nm).
6. Işık kaynağını, ışık gölgesi dökmeden örnek sahneyi düzgün bir şekilde aydınlatır şekilde ayarlayın.

3. Yaprak yansıtıcı ve klorofil floresansının eşzamanlı ölçümlerinin ayarlanması

NOT: Tüm adımlar, aktinik ışık dışında ışığın algılanmasını önlemek için karanlık odada gerçekleştirilir. Zayıf-yeşil ışık (örneğin, yeşil selofanlı ışık) gerçek ölçümlerden önce kapatılmalıdır.

1. Yaprak numunesi ile örnek aşamasındaki problar arasındaki mesafenin ölçülmesi.
   1. Karanlıkta örnek sahnenin yaprak tutucusu üzerine bir test yaprağı yerleştirin. Sahnedeki çelik bir plakaya yaprağı bastırın (Şekil 1'deki siyah kare).
   2. PAM'i açın ve yaprak örneğini bir ölçüm ışığıyla ışınlanın. Klorofil floresan yoğunluklarının değerleri PAM kontrol yazılımı kullanılarak doğrulanır (bkz.
   3. Ayarlayıcıyı floresan yoğunluğunun yaklaşık 100'e göre ölçtemesi için hareket ettirin. Sonda ve yaprak arasındaki mesafeyi ölçün. Ayarlayıcıyı düzeltin ve mesafenin değerini ayarlayıcıya kaydedin.
   4. Ölçüm ışığını kapatın. Test yaprağını çıkarın.
2. Aktinik ışığın ışın lama yoğunluklarının ölçülmesi
   NOT: Işığa bağlı fotosentetik davranışları gözlemlemek için, yaprak örneğini ışınlamak için değişen yoğunlukta aktinik ışık kullanılır.
   1. Örnek yaprağın yerleştirileceği konuma bir ışık kuantum ölçer ayarlayın.
   2. Halojen ışık kaynağından Gelen ışığı ışınla ve yoğunluğunu ölçün.
   3. Işık kaynağı kadranın hangi konumlarının 30, 60, 120, 240 ve 480 μmol foton m^–2 s^–1yoğunlukları oluşturacağını belirleyin.
      NOT: Arabidopsis bitkileri 120 μmol foton m^–2 s^–1altında yetiştirilir; bu nedenle, aktinik ışığın ışın yoğunlukları küçük ve büyük yoğunluklar bir dizi sağlamak için seçilir.
   4. Kadrandaki her ışınlama yoğunluğunu işaretleyin.
3. Yansıma standardına göre ölçün.
   NOT: Her ışınlama yoğunluğunda yaprak yansıtma oranını hesaplamak için bir yansıma standardı gereklidir.
   1. Yaprak numunesinin konumuna yansıtma standardı olarak beyaz bir plaka yerleştirin.
   2. Spektral radyometreyi aç. Yansıtma sinyali spektral radyometre kontrol yazılımı ile gösterilir. Şu anda spektral veri yok çünkü ışınlayıcı ışık yok.
   3. Bu testteki en yüksek ışınlama yoğunluğu olan 480 μmol foton m^–2 s^–1ile ışınlamak için halojen lambayı açın.
   4. Doygunluğu önlemek için radyometrenin algılama gücünü ayarlayın.
   5. 30, 60, 120, 240 ve 480 μmol fotonm^–2 s^–1ile aydınlatma altında 1 nm aralıklarla 450-850 nm arasında kayıt spektral yansıma .
      NOT: Her spektral ölçümde bir temel elektrik sinyali (karanlık akım) düzeltilir ve çıkarılır.

4. Bir floresan yaprak yansıması ve klorofil eşzamanlı ölçümleri ve fotosentetik parametrelerin hesaplanması

1. Yaprak numune siseviyesinde bir bitki ayarlayın.
   1. Arabidopsis bitkisini büyüme odasıyla aynı sıcaklık ve neme sahip kontrollü karanlık odaya transfer edin.
   2. PSII reaksiyon merkezinden elektronları dağıtmak ve fotokimyasal olmayan söndürme yi gevşetmek için 22 °C'de 1 saat karanlıkta bitkiyi kuluçkaya yatırın.
   3. Karanlık uyarlanmış tüm bitkiyi numune aşamasının altınabir laboratuvar jakına yerleştirin (Şekil 1).
   4. Örnek yaprağı yaprak tutucuya sabitleyin, böylece yaprak yüzeyi algılama problarına dik olacak.
2. PSII'nin maksimum kuantum veriminin ölçülmesi.
   1. PAM'i açın ve eğriyi kaydetmeye başlayın. Bu değere 0denir.
   2. Ölçüm ışığını açın ve eğrinin yanıt vermesi için yaklaşık 30 s bekleyin. Bu değere F₀denir.
   3. PAM'den 0,8 s için 4000 μmol fotonların doymuş nabzını verin^{– 2} s^–1.
   4. Artmış floresan yoğunluğu ile eğrideki ani artışen en yüksek değeri elde edin. Bu değere F_Mdenir.
   5. Aşağıdaki denklemi kullanarak PSII'nin karanlıktaki maksimum kuantum verimini (F_V/F_M)hesaplayın.
      F_V/F_M = (F_M – F₀) / F_M
3. Fotosentetik davranışların sabit durumda ölçülmesi.
   1. F_M kaydından sonra ölçüm ışığı açık olan dış ışık kaynağı olarak halojen lambayı açın (bkz. 4.2.4). İlk olarak, yaprak örneğini en zayıf ışıkla ışınla (30 μmol fotonm^–2 s^–1).
   2. Yaprak yansımasını izlemek için aynı anda spektral radyometreyi açın.
   3. Fotosentetik reaksiyonun ışık koşullarında sabit bir duruma ulaşması için 20 dakika veya daha uzun bekleyin. Sabit durumda floresan yoğunluğu Fsdenir.
   4. Aktinik ışıkla aydınlatma sırasında 1 dk aralıklarla doyunur bir darbe tedarik edin. Darbeli ışık altında elde edilen maksimum floresan değeri Ne F _M'denir.
   5. Aktinik ışığı yaktıktan sonra 20 dk'da F_M' verilerini kaydedin.
   6. En iyi leştirilmiş tümleştirme zamanında 10 tarama yaparak, koyu akım çıkarma ile yaprak yansıtma verilerini alın.
4. Fotosentetik parametrelerin sabit durumda hesaplanması.
   1. Aşağıdaki denklemi kullanarak, aktinik ışık altında doymuş darbeler ile ışınlanması ile tahmin edilebilir PSII fotokimya (Φ_PSII),kuantum verimleri hesaplayın.
      Φ_PSII = (F_M'- F_S) / F_M′
   2. PSII reaksiyon merkezinden lineer elektron akını (LEF) ^aşağıdakigibi tahmin edin4 .
      LEF = Aktinik ışığın ışınlama yoğunluğu × Φ_PSII × 0.5 × 0.84
   3. Aşağıdaki denklemi kullanarak termal dağılım ifade edilebilir NPQ, hesaplayın.
      NPQ = (F_M - F_M') / F_M′
      NOT: Işık enerjisi öncelikle fotosentez reaksiyonları tarafından tüketilir. Ancak, bitkiler fotosentez tarafından tüketilen enerjiden daha fazla ışık enerjisi emdiğinde, aşırı enerjiyi önlemek için termal dağılma mekanizmaları indüklenir.
   4. Aynı ışık koşullarında radyometre ile elde edilen spektral verileri kullanarak, yaprak yansıtma oranını aşağıdaki gibi hesaplayabilirsiniz.
      Yansıtma oranı = R_yaprağı / R_standardı
   5. Aşağıdaki gibi 531 nm ve 570 nm PRI hesaplayın. Bu iki dalga boyu yansıtma oranından çıkarılır.
      PRI = (R₅₃₁–R₅₇₀) / (R₅₃₁+R₅₇₀)
      NOT: R bir yansıtıcıdır.
5. Fotokimyasal olmayan söndürme gevşeme kinetiğinin ölçülmesi.
   1. Fs ve yaprak yansıması elde ettikten sonra aktinik ışığı kapatın.
   2. Işığı kapattıktan sonra PAM tarafından 10 dakika boyunca klorofil floresansı izleyin.
   3. Karanlık gevşeme sırasında 1 dakika aralıklarla doyunur darbe sağlayın. Karanlığın altında doygunluk darbesi tarafından indüklenen maksimum floresan değeri F_M''denir. Bir testte F M''den on tane alın.
   4. Aktinik ışığı kapattıktan sonra 2 dk ve 10 dk'da F M'' verilerini kaydedin.
   5. Setteki aktinik ışığı bir sonraki ışın yoğunluğuna, 60 μ mol fotonm^–2 s^–1'eçevirin.
   6. 20 dakika boyunca bir ışık adaptasyonunu ve 1 dakika boyunca 1 dakika boyunca koyu bir gevşemeyi 1 dk aralıklarla zonklayan doygunluk ışığını tekrarlayın. Yukarıda açıklandığı gibi tüm verileri kaydedin. 120, 240 ve 480 μ mol fotonm^–2 s^–1'deışınlama kullanarak tüm adımları ve ölçümleri tekrarlayın.
6. Gevşeme kinetiklerinden fotokimyasal olmayan söndürme parametrelerinin hesaplanması.
   NOT: NPQ'nun ışığa bağlı indüksiyonu,ışık kaynağı 13'ü kapatarak rahatlar. Gevşeme zaman ölçeklerini ayarlayarak her NPQ işlevini kesirlemek mümkündür.
   1. 2 dk koyu adaptasyondan sonra F_M'′ kullanarak qE (enerjiye bağlı söndürme) fraksiyonu tahmin edin.
      qE = (F_M2m′'–F_M') / F_M′
      NOT: QE fraksiyonu 1-2 dk içinde hızla tersine çevrilir. Bu fraksiyon esas olarak PsbS protonasyonu ve thylakoid membran¹³boyunca ışığa bağlı ΔpH bağlıdır xanthophyll dönüşüm, bir parçası içerir. Her ikisi de degradenin bozulması üzerine geri döndürülebilir.
   2. 10 dk koyu adaptasyonsonra F_M'′ kullanarak qZ (zeaxanthin bağımlı söndürme) fraksiyonu hesaplayın.
      qZ = (F_M10m''–F_M') / F_M′
      NOT: Aktinik ışık tan sonra yaklaşık 10 dakika sonra NPQ bir gevşeme kinetik bir xanthophyll döngüsü yansıtır¹⁴. Xanthophyll dönüşümünün çoğu yaklaşık 10 dakika (qZ) daha uzun zaman ölçeklerinde tersine çevrilir, çünkü dönüştürme vde (violaxanthin de-epoxidaz) enzimatik reaksiyon gerektirir. Fraksiyon, ΔpH'nin thylakoid membran boyunca bozulması ile de rahatlar.
   3. QI (fotoinhibitory durumu) aşağıdaki gibi hesaplayın.
      qI = (F_M–F_M10m'′) / F_M′
      NOT: NPQ fraksiyonları arasında en yavaş iyileşmenin PSII'nın fotohasarı olduğu düşünülmektedir (D1 cirosunu gösterir). 10 dk¹⁵tarafından kurtarılamayan fotoinhibitory durumunun (qI) bu fraksiyonu.

Sonuçlar

Şekil 1, klorofil floresansını ve yaprak yansımasını aynı anda ölçmek için kurulan deneysel in şematik bir diyagramını sunar. PAM ve spektral radyometrenin lif probları, özel yapım numune aşamasında yaprak tutucudaki yaprak yüzeyine dik olarak ayarlanmış ve halojen lamba, hem sol hem de sağ yönlerden herhangi bir döküm yapmadan aktinik ışık ışınlaması için kullanılmıştır. Gölge. PAM ve yaprak yansıtma sinyalleri ayrı si...

Tartışmalar

Bu çalışmada, PRI'nin klorofil floresansını ve yaprak reflektünü eş zamanlı olarak ölçerek kanthophyll pigmentlerini temsil ettiğini gösteren ek kanıtlar elde ettik.

Güneş ışığına benzer dalga boylarına sahip bir halojen ışık, fotosentezi etkinleştirmek için aktinik ışık kaynağı olarak kullanılmak üzere uyarlanmıştır. Biz başlangıçta yaprak yüzeyinin termal hasar görmesini önlemek için beyaz bir LED ışık kaynağı kullanılır, ama bu üretilen ya...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halogen light source	OptoSigma	SHLA-150
Light quantum meter	LI-COR	LI-1000
PAM chlorophyll fluorometer	Walz	JUNIOR-PAM
PAM controliing software	Walz	WinControl-3.27
Reflectance standard	Labsphere, Inc.	SRT-99-050
Spectral radiometer	ADS Inc.	Field Spec3
Spectral radiometer controlling software	ADS Inc.	RS3