Valutazione dei comportamenti fotosintetici mediante misurazioni simultanee della riflettanza delle foglie e delle analisi della fluorescenza della clorofilla

Riepilogo

Descriviamo un nuovo approccio tecnico per studiare le risposte fotosintetiche in impianti superiori che comportano misurazioni simultanee della clorofilla a fluorescenza e riflettanza delle foglie utilizzando un PAM e un radiometro spettrale per il rilevamento dei segnali stessa area foglia in Arabidopsis.

Abstract

La clorofilla un'analisi della fluorescenza è ampiamente utilizzata per misurare i comportamenti fotosintetici nelle piante intatte e ha portato allo sviluppo di molti parametri che misurano in modo efficiente la fotosintesi. L'analisi della riflettanza foglia fornisce diversi indici di vegetazione nell'ecologia e nell'agricoltura, tra cui l'indice di riflettanza fotochimica (PRI), che può essere utilizzato come indicatore della dissipazione dell'energia termica durante la fotosintesi perché è correlato con disinquo non fotochimico (NPQ). Tuttavia, poiché NPQ è un parametro composito, la relativa convalida è necessaria per comprendere la natura del parametro PRI. Per ottenere prove fisiologiche per la valutazione del parametro PRI, abbiamo misurato simultaneamente la fluorescenza clorofilliana e la riflessione delle foglie in xanhophyll ciclo mutante difettoso (npq1) e piante di arabidopsis di tipo selvatico. Inoltre, il parametro q, che probabilmente riflette il ciclo della xantofilla, è stato estratto dai risultati dell'analisi della fluorescenza clorofilla monitorando la cinetica di rilassamento del NPQ dopo aver spento la luce. Queste misurazioni simultanee sono state effettuate utilizzando un fluorometro di clorofilla di modulazione dell'ampiezza dell'umidità dell'impulso (PAM) e un radiometro spettrale. Le sonde in fibra di entrambi gli strumenti sono state posizionate l'una vicino all'altra per rilevare i segnali dalla stessa posizione foglia. Uno strumento PAM ha utilizzato una fonte di luce esterna e le luci di misurazione e la luce satura sono state fornite dallo strumento PAM. Questo sistema sperimentale ci ha permesso di monitorare il PRI dipendente dalla luce nella pianta intatta e ha rivelato che i cambiamenti dipendenti dalla luce in PRI differiscono in modo significativo tra il tipo selvaggio e il mutante npq1. Inoltre, il PRI è stato fortemente correlato con q, il che significa che q - riflette il ciclo di xantofilia. Insieme, queste misurazioni hanno dimostrato che la misurazione simultanea della riflettanza delle foglie e della fluorescenza clorofilla è un approccio valido per la valutazione dei parametri.

Introduzione

La riflettanza delle foglie viene utilizzata per rilevare adistanza gli indici di vegetazione che riflettono la fotosintesi o i tratti nelle piante 1,². L'indice di vegetazione di differenza normalizzata (NDVI), che si basa su segnali di riflessione infrarossi, è uno degli indici di vegetazione più noti per la rilevazione delle proprietà correlate alla clorofilla, ed è utilizzato nelle scienze ecologiche e agricole come indicatore delle risposte ambientali negli alberi o nelle colture³. Negli studi sul campo, sebbene siano stati sviluppati e utilizzati molti parametri (ad esempio, indice clorofillille (CI), indice dell'acqua (WI), ecc., poche verifiche dettagliate di ciò che questi parametri rilevano direttamente (o indirettamente) utilizzando mutanti.

L'analisi della modulazione dell'ampiezza a impulsi (PAM) della fluorescenza clorofilla è un metodo efficace per misurare le reazioni fotosintetiche e i processi coinvolti nel fotosistema II (PSII)⁴. La fluorescenza clorofilla può essere rilevata con una telecamera e utilizzata per lo screening dei mutanti di fotosintesi⁵. Tuttavia, il rilevamento della telecamera della fluorescenza clorofilla richiede protocolli complessi come il trattamento scuro o gli impulsi di saturazione della luce, che sono difficili da implementare negli studi sul campo.

L'energia a luce solare assorbita dalla foglia viene consumata principalmente da reazioni fotosintetiche. Al contrario, l'assorbimento dell'energia luminosa in eccesso può generare specie reattive dell'ossigeno, che provocano danni alle molecole fotosintetiche. L'energia luminosa in eccesso deve essere dissipata come calore attraverso meccanismi di spegnimento non fotochimico (NPQ)⁶. L'indice di riflettanza fotochimica (PRI), che riflette i cambiamenti dipendenti dalla luce nei parametri di riflettanza delle foglie, deriva dalla riflettanza a banda stretta a 531 e 570 nm (lunghezza d'onda di riferimento)^7,8. È segnalato per correlare con NPQ nell'analisi della fluorescenza clorofilla⁹. Tuttavia, poiché NPQ è un parametro composito che include il ciclo di xantofilla, la tradizione statale e la fotoinibizione, è necessaria una convalida dettagliata per comprendere quali misure il parametro PRI. Ci siamo concentrati sul ciclo di xantofilla, un sistema di dissipazione termica che prevede la de-epossidazione dei pigmenti di xantofilla (violaxanthin a antheraraanthin e zeaxanthin) e un componente principale del NPQ perché le correlazioni tra PRI e conversione di questi pigmenti è stato riportato in studi precedenti⁸.

Molti mutanti correlati alla fotosintesi sono stati isolati e identificati nell'Arabidopsis. Il mutante npq1 non accumula zeaxanthin perché porta una mutazione in violaxanthin de-eposxidase (VDE), che catalizza la conversione di violaxanthin a zeaxanthin¹⁰. Per stabilire se PRI rileva solo cambiamenti nei pigmenti di xantofilla, abbiamo misurato simultaneamente la fluorescenza PRI e clorofilla nella stessa area fogliare in npq1 e nel tipo selvaggio e poi abbiamo sezionato il NPQ in scale temporali variabili di rilassamento scuro per estrarre il componente correlato alla xantofilla¹¹. Queste misurazioni simultanee forniscono una tecnica preziosa per l'assegnazione degli indici di vegetazione. Inoltre, poiché PRI è correlato alla produttività primaria lorda (GPP), la capacità di assegnare PRI proprio a un componente ha importanti applicazioni nell'ecologia¹².

Protocollo

1. Coltivazione di piante di Arabidopsis

1. Immergere i semi di arabidopsis thaliana in acqua sterilizzata deionizzata in un microtubo e incubare per 2 giorni al buio.
2. Posizionare circa quattro dei semi assorbiti e trattati a freddo sulla superficie del suolo utilizzando una micropipetta. Incubare i vasi piantati in una camera di crescita con una luce di 16 h (120 fotoni mol m^–2 s^–1) e 8 h periodo scuro a 22 e 20 gradi centigradi, rispettivamente.
3. Coltivare una pianta per vaso assottigliando altre piantine dopo la germinazione. Preparare almeno cinque pentole. Incubare le piante nella camera di crescita per altre 4 settimane. Per gli esperimenti vengono utilizzate tre piante.
4. Utilizzare la foglia matura più giovane e completamente aperta per le misurazioni della fotosintesi.

2. Impostazione dello stage campione, strumenti fotosintetici e sorgente luminosa

NOTA: per questo protocollo è stata utilizzata una fase di campionamento personalizzata per il fissaggio di foglie e probe di rilevamento (Figura 1).

1. Attaccare una lastra di 10 cm² con un foro di 1 cm di diametro sullo stadio campione su misura. La dimensione del foro in questa piastra può essere modificata per ospitare diversi campioni di foglie o specie vegetali. Lo stage ha una clip per fissare le sonde di rilevamento e un regolatore per regolare la distanza tra le sonde e il campione di foglia.
2. Preparare sonde in fibra sottile per misurare la fluorescenza della clorofilla e la riflettanza delle foglie. Queste sonde in fibra sottile saranno posizionate da vicino in modo da misurare i segnali dalla stessa posizione foglia.
   NOTA: un fluorometro clorofillia PAM e un radiometro spettrale sono stati adattati per la rilevazione del segnale di clorofilla, rispettivamente a fluorescenza e riflettanza delle foglie. Entrambi gli strumenti utilizzano sonde in fibra sottile con diametri rispettivamente di 1 e 2 mm.
3. Montare queste due sonde strettamente insieme e avvolgerle con nastro di plastica.
4. Ritagliare le sonde registrate sullo stage campione utilizzando un supporto per lenti coassiali (vedere La Figura 1) e posizionarle verticalmente sulla superficie della foglia.
   NOTA: Il campo visivo del cavo in fibra ottica nel radiometro spettrale è di 25 gradi. In questo metodo, la distanza tra le punte della sonda in fibra e la superficie della foglia è inferiore a 1 cm. Pertanto, l'area della foglia di misurazione è quasi la stessa di quella della fibra.
5. Fissare una guida luminosa biforked fatta di fibre di vetro alla sorgente luminosa alogena e irradiare lo stadio del campione da entrambe le direzioni ad angoli di circa 45 gradi.
   NOTA: Una lampada alogena, che è vicina alla distribuzione della lunghezza d'onda della luce solare naturale, viene utilizzata come luce actinica per indurre la fotosintesi. La sorgente luminosa alogena è stata adattata con un filtro freddo integrato, che rimuove le lunghezze d'onda lunghe da infrarossi vicino, per evitare aumenti della temperatura della superficie della foglia ( da 400 a 800 nm).
6. Regolate la sorgente luminosa in modo che la luce illumini uniformemente lo stage campione senza proiettare ombre.

3. Impostazione di misurazioni simultanee della riflettanza delle foglie e della fluorescenza della clorofilla

NOTA: tutti i passaggi vengono eseguiti nella stanza buia per evitare il rilevamento di luce diversa dalla luce actinica. Una luce verde-debole (ad esempio, luce verde-cellophaned) deve essere spenta prima delle misurazioni effettive.

1. Misurazione della distanza tra il campione di foglia e le sonde sullo stadio del campione.
   1. Posizionare una foglia di prova sul supporto foglia dello stadio campione al buio. Premere la foglia contro una piastra d'acciaio sullo stage (quadrato nero nella Figura 1).
   2. Accendere il PAM e irradiare il campione di foglia con una luce di misura. I valori delle intensità di fluorescenza clorofilla sono confermati utilizzando il software di controllo PAM (vedere Tabella dei materiali).
   3. Spostare il regolatore in modo che l'intensità della fluorescenza mipari circa 100. Misurare la distanza tra la sonda e la foglia. Fissare il regolatore e registrare il valore della distanza sul regolatore.
   4. Spegnere la luce di misura. Rimuovere la foglia di prova.
2. Misurazione dell'intensità di irradiazione della luce actica
   NOTA: Per osservare i comportamenti fotosintetici dipendenti dalla luce, la luce actinica di intensità variabile viene utilizzata per irradiare il campione di foglie.
   1. Impostare un misuratore quantico di luce nella posizione in cui verrà posizionata la foglia del campione.
   2. Irradiare la luce dalla fonte di luce alogena e misurare l'intensità.
   3. Determinare quali posizioni del quadrante della sorgente luminosa genererebbero intensità di 30, 60, 120, 240 e 480 fotoni mol m^–2 s^–1.
      NOTA: le piante di Arabidopsis sono coltivate sotto 120 fotoni di mol m^–2 s^–1; pertanto, le intensità di irradiazione della luce actica vengono selezionate per fornire una gamma di piccole e grandi intensità.
   4. Contrassegnare ogni intensità di irradiazione sul quadrante.
3. Misurare uno standard di riflessione.
   NOTA: è necessario uno standard di riflessione per calcolare il rapporto di riflettanza delle foglie ad ogni intensità di irradiazione.
   1. Posizionare una piastra bianca come standard di riflettanza nella posizione del campione di foglia.
   2. Accendere un radiometro spettrale. Il segnale di riflettanza è mostrato dal software di controllo del radiometro spettrale. Al momento, non ci sono dati spettrali perché non c'è luce irradiante.
   3. Accendere la lampada alogena per irradiare con fotoni di 480 m^–2 s^–1, la più alta intensità di irradiazione in questo test.
   4. Regolare l'intensità di rilevamento del radiometro per evitare la saturazione.
   5. Registrare la riflettanza spettrale tra 450-850 nm a intervalli di 1 nm sotto illuminazione con fotoni 30, 60, 120, 240 e 480 -mol m^–2 s^–1.
      NOTA: Un segnale elettrico della linea di base (corrente oscura) viene corretto e sottratto ad ogni misurazione spettrale.

4. Misurazioni simultanee della riflettanza delle foglie e della clorofilla a fluorescenza e calcolo dei parametri fotosintetici

1. Impostare una pianta nella posizione del campione foglia.
   1. Trasferire la pianta dell'Arabidopsis dalla camera coltivata alla camera oscura controllata con la stessa temperatura e umidità della camera di crescita.
   2. Incubare la pianta per 1 h al buio a 22 gradi centigradi per dissipare gli elettroni dal centro di reazione PSII e per rilassarsi di spegnimento non fotochimico.
   3. Posizionare l'intero impianto adattato al buio su un jack di laboratorio sotto la fase del campione (Figura 1).
   4. Fissare la foglia del campione al supporto della foglia in modo che la superficie della foglia sia perpendicolare alle sonde di rilevamento.
2. Misurazione del rendimento quantico massimo di PSII.
   1. Accendere il PAM e iniziare a registrare la curva. Questo valore è denominato 0.
   2. Accendere la luce di misura e attendere circa 30 s affinché la curva risponda. Questo valore è denominato F₀.
   3. Dare un impulso saturo di 4000 fotoni mol m^–2 s^–1 per 0,8 s dal PAM.
   4. Ottenere il valore più alto del picco nella curva con maggiore intensità di fluorescenza. Questo valore è denominato F_M.
   5. Calcolare la resa media massima di PSII al buio (F_V/F_M), utilizzando l'equazione seguente.
      F_V/F_M - (F_M – F₀) / F_M
3. Misurazione dei comportamenti fotosintetici a stato costante.
   1. Accendere la lampada alogena come fonte di luce esterna con la luce di misura accesa dopo la registrazione di F_M (vedere 4.2.4). In primo luogo, irradiate il campione di foglia con la luce più debole (30 fotoni mol m^–2 s^–1).
   2. Accendere il radiometro spettrale allo stesso tempo per monitorare la riflettanza foglia.
   3. Attendere 20 min o più per la reazione fotosintetica per raggiungere lo stato costante in condizioni di luce. L'intensità di fluorescenza dello stato stazionario è chiamata Fs.
   4. Fornire un impulso saturante a intervalli di 1 min durante l'illuminazione con la luce actinica. Il valore massimo di fluorescenza raggiunto sotto la luce pulsata è chiamato F_M.
   5. Registrare i dati di F_Ma 20 min dopo aver acceso la luce actica.
   6. Prendi in media i dati di riflettanza foglia calcolando una media di 10 scansioni in un momento di integrazione ottimizzato, con una sottrazione di corrente scura.
4. Calcolo dei parametri fotosintetici allo stato stazionario.
   1. Calcolare le rese quantiche della fotochimica PSII_(PSII),che può essere stimata irradiando con impulsi saturi sotto la luce actinica, utilizzando la seguente equazione.
      -_PSII - (F_M'- F_S) / F_M
   2. Stimare il flusso di elettroni lineari (LEF) dal centro di reazione PSII come segue ⁴.
      LEF - L'intensità dell'irradiazione della luce actica
   3. Calcolare il NPQ, che può essere espresso la dissipazione termica, utilizzando la seguente equazione.
      NPQ (F_M - F_M)/ F_M
      NOTA: L'energia luminosa viene consumata principalmente dalle reazioni della fotosintesi. Tuttavia, quando le piante assorbono più energia luminosa dell'energia consumata dalla fotosintesi, i meccanismi per la dissipazione termica sono indotti per evitare l'energia in eccesso.
   4. Utilizzando i dati spettrali acquisiti con il radiometro nelle stesse condizioni di luce, calcolare il rapporto di riflettanza foglia come segue.
      Rapporto di riflessione -_{verde R} /_{R standard}
   5. Calcolare PRI da 531 nm e 570 nm come indicato di seguito. Queste due lunghezze d'onda vengono estratte dal rapporto di riflettanza.
      PRI - (R₅₃₁–R₅₇₀) / (R₅₃₁- R₅₇₀)
      NOTA: R è una riflettanza.
5. Misurazione della cinetica di rilassamento di spegnimento non fotochimico.
   1. Spegnere la luce actica dopo l'acquisizione di Fs e riflettamento foglia.
   2. Monitorare la fluorescenza clorofilla di PAM per 10 min dopo aver spento la luce.
   3. Fornire un impulso saturante a intervalli di 1 min durante il rilassamento scuro. Il valore massimo di fluorescenza indotto dall'impulso di saturazione sotto il buio è chiamato F_M. Ottenere dieci di F_Min un test.
   4. Salvare i dati di F_Ma 2 min e 10 min dopo aver spento la luce actica.
   5. Accendere la luce attiva impostata sulla successiva intensità di irradiazione, 60 s fotoni mol m^–2 s^–1.
   6. Ripetere un adattamento leggero per 20 min e un rilassamento scuro per 10 min con luce di saturazione pulsante ad intervalli di 1 min. Registrare tutti i dati come descritto sopra. Ripetere tutti i passaggi e le misurazioni utilizzando l'irradiazione a 120, 240 e 480 fotoni mol m^–2 s^–1.
6. Calcolo dei parametri della cinetura non fotochimica dalle cinedi di rilassamento.
   NOTA: l'induzione dipendente dalla luce di NPQ viene allentata spegnendo la sorgente luminosa¹³. È possibile frazionare ogni funzione NPQ regolando le scale temporali di rilassamento.
   1. Stimate la frazione qE (spegnimento dipendente dall'energia) utilizzando F_M, dopo l'adattamento scuro di 2 minuti.
      qE (F2m)
      NOTA: la frazione qE viene rapidamente invertita entro 1-2 min. Questa frazione comprende principalmente la protonazione PsbS e parte della conversione di xantofilla, che dipendono dalla pH di zcrazione indotta dalla luce attraverso la membrana tilakoide¹³. Entrambi sono reversibili sulla scomposizione del gradiente.
   2. Calcolare la frazione q (scquo dipendente dalla zeaxanthin) utilizzando F_M, dopo l'adattamento scuro di 10 minuti.
      ( F_M10m
      NOTA: Una cinetica di rilassamento di NPQ a circa 10 min dopo luce actica spenta riflette un ciclo di xantofilla¹⁴. La maggior parte della conversione di xantofilla è invertita a scale temporali più lunghe di circa 10 min (q) perché la conversione richiede una reazione enzimatica VDE (violaxanthin de-epoxidase). La frazione è anche rilassata dalla ripartizione della pH attraverso la membrana tilakoide.
   3. Calcolare il qI (stato fotoiniinioso) come segue.
      qI - (F_M–F_M10m) / F_M
      NOTA: Il recupero più lento tra le frazioni NPQ è considerato fotodanno di PSII (che indica il fatturato D1). Questa frazione dello stato fotoinibitorio (qI), che non recupera di 10 min¹⁵.

Risultati

La figura 1 presenta un diagramma schematico dell'impostazione sperimentale per misurare simultaneamente la fluorescenza della clorofilla e la riflettanza delle foglie. Le sonde in fibra del PAM e del radiometro spettrale sono state impostate perpendicolarmente alla superficie della foglia sul supporto della foglia sullo stadio del campione su misura, e una lampada alogena è stata utilizzata per l'irradiazione della luce actinica sia da sinistra che da destr...

Discussione

In questo studio, abbiamo ottenuto ulteriori prove per dimostrare che il PRI rappresenta i pigmenti di xantofilla misurando simultaneamente la fluorescenza clorofilla e la riflettanza delle foglie.

Una luce alogena, che ha lunghezze d'onda simili alla luce solare, è stata adattata per l'uso come fonte di luce actinica per attivare la fotosintesi. Inizialmente abbiamo usato una fonte di luce LED bianca per evitare danni termici della superficie della foglia, ma questo ha prodotto cinetica di r...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halogen light source	OptoSigma	SHLA-150
Light quantum meter	LI-COR	LI-1000
PAM chlorophyll fluorometer	Walz	JUNIOR-PAM
PAM controliing software	Walz	WinControl-3.27
Reflectance standard	Labsphere, Inc.	SRT-99-050
Spectral radiometer	ADS Inc.	Field Spec3
Spectral radiometer controlling software	ADS Inc.	RS3