Auswertung photosynthetischer Verhaltensweisen durch gleichzeitige Messungen von Blattreflexion simultanen und Chlorophyllfluoreszenzanalysen

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen neuen technischen Ansatz zur Untersuchung photosynthetischer Reaktionen in höheren Pflanzen mit gleichzeitigen Messungen von Chlorophyll, Fluoreszenz und Blattreflexion mit einem PAM und einem Spektralradiometer zur Detektion von Signalen aus dem gleichen Blattbereichs in Arabidopsis.

Zusammenfassung

Chlorophyll eine Fluoreszenzanalyse ist weit verbreitet, um photosynthetische Verhaltensweisen in intakten Pflanzen zu messen, und hat in der Entwicklung vieler Parameter geführt, die Photosynthese effizient messen. Die Blattreflexionsanalyse liefert mehrere Vegetationsindizes in Ökologie und Landwirtschaft, einschließlich des photochemischen Reflexionsindex (PRI), der als Indikator für die thermische Energieableitung während der Photosynthese verwendet werden kann, da er mit nicht-photochemische Abschreckung (NPQ). Da NPQ jedoch ein zusammengesetzter Parameter ist, ist seine Validierung erforderlich, um die Art des PRI-Parameters zu verstehen. Um physiologische Beweise für die Bewertung des PRI-Parameters zu erhalten, haben wir gleichzeitig Chlorophyllfluoreszenz und Blattreflexion in Xanthophyll-Zyklus defekte Mutant (npq1) und Wild-Typ Arabidopsis Pflanzen gemessen. Zusätzlich wurde der qZ-Parameter, der wahrscheinlich den Xanthophyll-Zyklus widerspiegelt, aus den Ergebnissen der Chlorophyllfluoreszenzanalyse extrahiert, indem die Entspannungskinetik von NPQ nach dem Ausschalten des Lichts überwacht wurde. Diese simultanen Messungen wurden mit einem Puls-Amplituden-Modulations-Chlorophyll-Fluorometer (PAM) und einem Spektralradiometer durchgeführt. Die Fasersonden beider Instrumente wurden nahe beieinander positioniert, um Signale aus der gleichen Blattposition zu erkennen. Zur Aktivierung der Photosynthese wurde eine externe Lichtquelle verwendet, und die Messlichter und das gesättigte Licht wurden vom PAM-Instrument bereitgestellt. Dieses experimentelle System ermöglichte es uns, lichtabhängige PRI in der intakten Pflanze zu überwachen und zeigte, dass lichtabhängige Veränderungen in PRI sich signifikant zwischen dem Wildtyp und dem npq1-Mutanten unterscheiden. Darüber hinaus war PRI stark mit qZ korreliert, was bedeutet, dass qZ den Xanthophyll-Zyklus widerspiegelt. Zusammen zeigten diese Messungen, dass die gleichzeitige Messung der Blattreflexion und Der Chlorophyllfluoreszenz ein gültiger Ansatz für die Parameterauswertung ist.

Einleitung

Blattreflexion wird verwendet, um Vegetationsindizes aus der Ferne zu erkennen, die Photosynthese oder Merkmale in^Pflanzen1^,2widerspiegeln. Der normalisierte Differenzvegetationsindex (NDVI), der auf Infrarot-Reflexionssignalen basiert, ist einer der bekanntesten Vegetationsindizes für den Nachweis von Chlorophyll-bezogenen Eigenschaften und wird in der Ökologie und Agrarwissenschaften als Indikator für Umweltreaktionen in Bäumen oder Kulturen³. Obwohl in Feldstudien viele Parameter (z. B. Chlorophyllindex (CI), Wasserindex (WI) usw.) entwickelt und verwendet wurden, wurden nur wenige detaillierte Überprüfungen dessen, was diese Parameter direkt (oder indirekt) erkennen, mit Mutanten durchgeführt.

Die Puls-Amplituden-Modulation (PAM)-Analyse der Chlorophyllfluoreszenz ist eine effektive Methode zur Messung photosynthetischer Reaktionen und Prozesse im Photosystem II (PSII)⁴. Chlorophyllfluoreszenz kann mit einer Kamera nachgewiesen und zum Screening von Photosynthesemutanten⁵verwendet werden. Die Erkennung von Chlorophyllfluoreszenz durch Kameras erfordert jedoch komplexe Protokolle wie dunkle Behandlung oder Lichtsättigungsimpulse, die in Feldstudien nur schwer umzusetzen sind.

Blatt absorbierte Sonnenlichtenergie wird hauptsächlich durch photosynthetische Reaktionen verbraucht. Im Gegensatz dazu kann die Absorption überschüssiger Lichtenergie reaktive Sauerstoffspezies erzeugen, was photosynthetische Moleküle schädigt. Die überschüssige Lichtenergie muss als Wärme durch nicht-photochemische Löschmechanismen (NPQ) abgeführt werden⁶. Der photochemische Reflexionsindex (PRI), der lichtabhängige Veränderungen der Blattreflexionsparameter reflektiert, wird aus der Schmalbandreflexion bei 531 und 570 nm (Referenzwellenlänge)^7,8abgeleitet. Es wird berichtet, dass es mit NPQ in der Chlorophyllfluoreszenzanalyse korrelieren⁹. Da NPQ jedoch ein zusammengesetzter Parameter ist, der den Xanthophyll-Zyklus, die Zustandstradition und die Photoinhibition umfasst, ist eine detaillierte Validierung erforderlich, um zu verstehen, was der PRI-Parameter misst. Wir haben uns auf den Xanthophyll-Zyklus konzentriert, ein thermisches Ableitungssystem mit der De-Epoxidation von Xanthophyllpigmenten (Violaxanthin zu Antheraxanthin und Zeaxanthin) und einem Hauptbestandteil von NPQ, da Korrelationen zwischen PRI und Pigmente wurden in früheren^Studien8 berichtet.

Viele photosynthesebedingte Mutanten wurden isoliert und in Arabidopsis identifiziert. Der npq1 Mutant sammelt kein Zeaxanthin an, da er eine Mutation in Violaxanthin de-Epoxidase (VDE) trägt, die die Umwandlung von Violaxanthin in Zeaxanthin¹⁰katalysiert. Um festzustellen, ob PRI nur Veränderungen in Xanthophyllpigmenten erkennt, haben wir gleichzeitig PRI- und Chlorophyllfluoreszenz im gleichen Blattbereich in npq1 und dem Wildtyp gemessen und dann NPQ zu unterschiedlichen Zeitskalen dunkler Entspannung seziert, um xanthophyll-bezogene Komponente¹¹. Diese simultanen Messungen bieten eine wertvolle Technik für die Zuordnung von Vegetationsindizes. Da PRI mit der Bruttoprimärproduktivität (GPP) korreliert, hat die Möglichkeit, PRI genau einer Komponente zuzuweisen, wichtige Anwendungen in der Ökologie¹².

Protokoll

1. Anbau von Arabidopsis-Pflanzen

1. Arabidopsis thaliana Samen in sterilisiertem entionisiertem Wasser in einem Mikrorohr einweichen und 2 Tage bei 4 °C im Dunkeln brüten.
2. Etwa vier der imprägnierten, kalt behandelten Samen mit einer Mikropipette auf die Bodenoberfläche legen. Die gepflanzten Töpfe in einer Wachstumskammer mit einem 16-h-Licht (120-mol-Photonen m^–2 s^–1)bzw. 8 h dunkler Periode bei 22 °C bzw. 20 °C bebrüten.
3. Wachsen Sie eine Pflanze pro Topf, indem Sie andere Sämlinge nach der Keimung ausdünnen. Bereiten Sie mindestens fünf Töpfe vor. Inkubieren Sie die Pflanzen in der Wachstumskammer für weitere 4 Wochen. Für die Experimente werden drei Pflanzen verwendet.
4. Verwenden Sie das jüngste, vollständig geöffnete reife Blatt für Photosynthesemessungen.

2. Einrichten der Probenstufe, der photosynthetischen Instrumente und der Lichtquelle

HINWEIS: Für dieses Protokoll wurde eine kundenspezifische Beispielstufe zur Fixierung von Blättern und Erkennungssonden verwendet (Abbildung 1).

1. Befestigen Sie eine 10 cm² Stahlplatte mit einem Loch von 1 cm Durchmesser auf der maßgeschneiderten Probenbühne. Die Lochgröße in dieser Platte kann geändert werden, um verschiedene Blattproben oder Pflanzenarten aufzunehmen. Die Bühne verfügt über einen Clip zur Befestigung der Erkennungssonden und einen Einsteller, um den Abstand zwischen den Sonden und der Blattprobe anzupassen.
2. Bereiten Sie dünne Fasersonden zur Messung der Chlorophyllfluoreszenz und Blattreflexion vor. Diese dünnen Fasersonden werden so eng positioniert, dass sie Signale aus der gleichen Blattposition messen.
   HINWEIS: Ein PAM-Chlorophyll-Fluorometer und ein Spektralradiometer wurden für den Signalnachweis von Chlorophyll, Fluoreszenz bzw. Blattreflexion, angepasst. Beide Instrumente verwenden dünne Fasersonden mit Durchmessern von 1 mm bzw. 2 mm.
3. Passen Sie diese beiden Sonden fest zusammen und wickeln Sie sie mit Kunststoffband.
4. Befestigen Sie die aufgeklebten Sonden mit einem koaxialen Linsenhalter auf die Probenstufe (siehe Abbildung 1), und positionieren Sie sie vertikal zur Blattoberfläche.
   ANMERKUNG: Das Sichtfeld des Glasfaserkabels im Spektralradiometer ist - = 25°. Bei dieser Methode ist der Abstand zwischen den Fasersondenspitzen und der Blattoberfläche kürzer als 1 cm. Daher ist die Messblattfläche fast die gleiche wie die der Faser.
5. Befestigen Sie eine biforkierte Lichtführung aus Glasfasern an der Halogenlichtquelle und bestrahlen Sie die Probenstufe aus beiden Richtungen in Winkeln von ca. 45°.
   HINWEIS: Eine Halogenlampe, die nahe an der Wellenlängenverteilung des natürlichen Sonnenlichts liegt, wird als aktinisches Licht zur Induktion der Photosynthese verwendet. Die Halogenlichtquelle wurde mit einem eingebauten Kaltfilter angepasst, der lange Wellenlängen aus dem nahen Infrarot entfernt, um einen Anstieg der Blattoberflächentemperatur zu verhindern (- = 400 bis 800 nm).
6. Stellen Sie die Lichtquelle so ein, dass das Licht die Probenbühne gleichmäßig beleuchtet, ohne Schatten zu werfen.

3. Gleichzeitige Messungen der Blattreflexion und Chlorophyllfluoreszenz

HINWEIS: Alle Schritte werden im dunklen Raum ausgeführt, um die Erkennung von lichtausgenommen als aktinisches Licht zu vermeiden. Ein schwachgrünes Licht (z.B. grünzellophaniertes Licht) sollte vor den eigentlichen Messungen ausgeschaltet werden.

1. Messung des Abstands zwischen der Blattprobe und den Sonden auf der Probenstufe.
   1. Legen Sie ein Testblatt auf den Blatthalter der Probenstufe im Dunkeln. Drücken Sie das Blatt gegen eine Stahlplatte auf der Bühne (schwarzes Quadrat in Abbildung 1).
   2. Schalten Sie das PAM ein und bestrahlen Sie die Blattprobe mit einem Messlicht. Die Werte der Chlorophyllfluoreszenzintensitäten werden mit einer PAM-Steuerungssoftware bestätigt (siehe Materialtabelle).
   3. Bewegen Sie den Regler so, dass die Fluoreszenzintensität etwa 100 misst. Messen Sie den Abstand zwischen der Sonde und dem Blatt. Fixieren Sie den Einsteller, und notieren Sie den Wert des Abstands auf dem Einsteller.
   4. Schalten Sie das Messlicht aus. Entfernen Sie das Testblatt.
2. Messung der Strahlungsintensitäten des aktinischen Lichts
   HINWEIS: Zur Beobachtung lichtabhängiger photosynthetischer Verhaltensweisen wird aktinisches Licht unterschiedlicher Intensität zur Bestrahlung der Blattprobe verwendet.
   1. Legen Sie ein Lichtquantenmessgerät an der Position fest, an der das Probenblatt platziert werden würde.
   2. Bestrahlen Sie Licht von der Halogenlichtquelle und messen Sie die Intensität.
   3. Bestimmen Sie, welche Positionen des Lichtquellenzifferblatts Intensitäten von 30, 60, 120, 240 und 480 mol Photonen m^–2 s^–1erzeugen würden.
      ANMERKUNG: Arabidopsis-Pflanzen werden unter 120 mol Photonen m^–2 s^–1angebaut; Daher werden die Bestrahlungsintensitäten des aktinischen Lichts ausgewählt, um eine Reihe von kleinen und großen Intensitäten zu liefern.
   4. Markieren Sie jede Bestrahlungsintensität auf dem Zifferblatt.
3. Messen Sie einen Reflexionsstandard.
   HINWEIS: Zur Berechnung des Blattreflexionsverhältnisses bei jeder Strahlungsintensität ist ein Reflexionsstandard erforderlich.
   1. Platzieren Sie eine weiße Platte als Reflexionsstandard an der Position der Blattprobe.
   2. Schalten Sie ein Spektralradiometer ein. Das Reflexionssignal wird durch die Spektral-Radiometer-Steuerungssoftware angezeigt. Derzeit gibt es keine Spektraldaten, da es kein bestrahlendes Licht gibt.
   3. Schalten Sie die Halogenlampe ein, um sie mit 480 mol Photonen m^–2 s^–1zu bestrahlen, der höchsten Strahlungsintensität in diesem Test.
   4. Passen Sie die Erkennungsstärke des Radiometers an, um eine Sättigung zu vermeiden.
   5. Zeichnen Sie die Spektralreflexion zwischen 450–850 nm in 1 nm Intervallen unter Beleuchtung mit 30, 60, 120, 240 und 480 mol Photonen m^–2 s^–1auf.
      HINWEIS: Ein elektrisches Basissignal (dunkler Strom) wird bei jeder Spektralmessung korrigiert und subtrahiert.

4. Simultane Messungen der Blattreflexion und Chlorophyll eine Fluoreszenz, und Berechnung der photosynthetischen Parameter

1. Stellen Sie eine Pflanze an der Blattprobenposition ein.
   1. Übertragen Sie die Arabidopsis-Pflanze aus der gewachsenen Kammer in den kontrollierten dunklen Raum mit der gleichen Temperatur und Luftfeuchtigkeit wie die der Wachstumskammer.
   2. Inkubieren Sie die Pflanze für 1 h im Dunkeln bei 22 °C, um Elektronen aus dem PSII-Reaktionszentrum abzuleiten und sich von nicht-photochemischer Abschreckung zu entspannen.
   3. Legen Sie die dunkel angepasste ganze Pflanze auf eine Laborbuchse unter der Probenstufe (Abbildung 1).
   4. Fixieren Sie das Probenblatt am Blatthalter, sodass die Blattoberfläche senkrecht zu den Detektionssonden ist.
2. Messung der maximalen Quantenausbeute von PSII.
   1. Schalten Sie den PAM ein, und starten Sie die Aufzeichnung der Kurve. Dieser Wert wird als 0bezeichnet.
   2. Schalten Sie das Messlicht ein, und warten Sie etwa 30 s, bis die Kurve reagiert. Dieser Wert wird F₀genannt.
   3. Geben Sie einen gesättigten Puls von 4000 'mol Photonen m^–2 s^–1 für 0,8 s aus dem PAM.
   4. Erhalten Sie den höchsten Wert der Spitze in der Kurve mit erhöhter Fluoreszenzintensität. Dieser Wert wird F_Mgenannt.
   5. Berechnen Sie die maximale Quantenausbeute von PSII im Dunkeln (F_V/F_M), mit der folgenden Gleichung.
      F_V/F_M = (F_M – F₀) / F_M
3. Messung des photosynthetischen Verhaltens im stationären Zustand.
   1. Schalten Sie die Halogenlampe als externe Lichtquelle ein, wobei das Messlicht nach der Aufnahme von F_M eingeschaltet ist (siehe 4.2.4). Bestrahlen Sie zunächst die Blattprobe mit dem schwächsten Licht (30 'mol photons m^–2 s^–1).
   2. Schalten Sie gleichzeitig das Spektralradiometer ein, um die Blattreflexion zu überwachen.
   3. Warten Sie 20 min oder länger, bis die photosynthetische Reaktion unter den Lichtverhältnissen einen stabilen Zustand erreicht. Die Fluoreszenzintensität des steady state wird Fsgenannt.
   4. Geben Sie bei der Beleuchtung mit dem aktinischen Licht einen Sättigungsimpuls in Intervallen von 1 min an. Der maximale Fluoreszenzwert, der unter dem gepulsten Licht erreicht wird, wird F_Mgenannt.
   5. Zeichnen Sie die Daten von F_M' in 20 min auf, nachdem Sie das aktinische Licht eingeschaltet haben.
   6. Nehmen Sie Blattreflexionsdaten, indem Sie durchschnittlich 10 Scans zu einer optimierten Integrationszeit mit einer dunklen Stromsubtraktion durchführen.
4. Berechnung photosynthetischer Parameter im stationären Zustand.
   1. Berechnen Sie die Quantenausbeute der PSII-Photochemie_(PSII), die durch Bestrahlung mit gesättigten Impulsen unter aktinischem Licht unter Verwendung der folgenden Gleichung geschätzt werden kann.
      PSII = (F_M-- F_S) / F_M
   2. Schätzen Sie den linearen Elektronenfluss (LEF) aus dem PSII-Reaktionszentrum wie folgt ⁴.
      LEF = Die Bestrahlungsintensität des aktinischen Lichts -_PSII - 0,5 x 0,84
   3. Berechnen Sie den NPQ, der die wärmeableitende Ableitung ausgedrückt werden kann, mit der folgenden Gleichung.
      NPQ = (F_M - F_M) / F_M
      HINWEIS: Lichtenergie wird hauptsächlich durch Photosynthesereaktionen verbraucht. Wenn Jedoch Pflanzen mehr Lichtenergie aufnehmen als Energie, die durch Photosynthese verbraucht wird, werden die Mechanismen für die wärmeableitende Ableitung induziert, um die überschüssige Energie zu vermeiden.
   4. Berechnen Sie anhand der spektralen Daten, die mit dem Radiometer unter den gleichen Lichtverhältnissen erfasst wurden, das Blattreflexionsverhältnis wie folgt.
      Reflexionsverhältnis =_R-Blatt /_R-Standard
   5. Berechnen Sie PRI aus 531 nm und 570 nm wie folgt. Diese beiden Wellenlängen werden aus dem Reflexionsverhältnis extrahiert.
      PRI = (R₅₃₁–R₅₇₀) / (R₅₃₁+R₅₇₀)
      HINWEIS: R ist eine Reflexion.
5. Messung der Entspannungskinetik der nichtphotochemischen Abschreckung.
   1. Schalten Sie das aktinische Licht aus, nachdem Sie Fs und Blattreflexion erworben haben.
   2. Chlorophyllfluoreszenz durch PAM 10 min nach dem Ausschalten des Lichts überwachen.
   3. Geben Sie während der dunklen Entspannung einen sättigungspuls in Intervallen von 1 min an. Der maximale Fluoreszenzwert, der durch den Sättigungsimpuls unter der Dunkelheit induziert wird, wird F_Mgenannt. Erhalten Sie zehn von F_Min einem Test.
   4. Speichern Sie die Daten von F_Min 2 min und 10 min nach dem Ausschalten des aktinischen Lichts.
   5. Drehen Sie das aktinische Licht auf die nächste Strahlungsintensität, 60 mol Photonen m^–2 s^–1.
   6. Wiederholen Sie eine Lichtanpassung für 20 min und eine dunkle Entspannung für 10 min mit pulsierendem Sättigungslicht in Intervallen von 1 min. Zeichnen Sie alle Daten wie oben beschrieben auf. Wiederholen Sie alle Schritte und Messungen mit Bestrahlung bei 120, 240 und 480 mol Photonen m^–2 s^–1.
6. Berechnung der Parameter der nicht-photochemischen Abschreckung aus der Entspannungskinetik.
   HINWEIS: Die lichtabhängige Induktion von NPQ wird durch Ausschalten der Lichtquelle¹³gelockert. Es ist möglich, jede NPQ-Funktion zu fraktionieren, indem die Entspannungszeitskalen angepasst werden.
   1. Schätzen Sie den qE-Anteil (energieabhängiges Abschrecken) mit F_Mnach 2-min-Dunkelanpassung.
      qE = (F_M2m–F_M) / F_M
      HINWEIS: Der qE-Anteil wird innerhalb von 1–2 min schnell umgekehrt. Diese Fraktion umfasst hauptsächlich PsbS-Protonation und einen Teil der Xanthophyll-Umwandlung, die von lichtinduzierten pH über die Thylakoidmembran¹³abhängen. Beide sind bei Aufschlüsselung des Gradienten reversibel.
   2. Berechnen Sie den qZ-Anteil (zeaxanthinabhängiges Abschrecken) mit F_Mnach 10-min-Dunkelanpassung.
      qZ = (F_M10m' –F_M') / F_M'
      HINWEIS: Eine Entspannungskinetik von NPQ bei ca. 10 min nach aktinischem Licht reflektiert einen Xanthophyllzyklus¹⁴. Der größte Teil der Xanthophyll-Umwandlung wird bei längeren Zeitskalen von ca. 10 min (qZ) umgekehrt, da die Umwandlung eine vDE (Violaxanthin de-Epoxidase) enzymatische Reaktion erfordert. Die Fraktion wird auch durch den Abbau des pH über die Thylakoid-Membran gelockert.
   3. Berechnen Sie den qI (Photoinhibitory-Zustand) wie folgt.
      qI = (F_M–F_M10m)/ F_M
      HINWEIS: Die langsamste Erholung unter den NPQ-Fraktionen ist vermutlich Photoschaden von PSII (mit Angabe des D1-Umsatzes). Dieser Bruchteil des photohemmenden Zustands (qI), der sich nicht um 10 min¹⁵erholt.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt einen schematischen Diagramm des Versuchsaufbaus zur gleichzeitigen Messung der Chlorophyllfluoreszenz und Blattreflexion. Die Fasersonden des PAM und des Spektralradiometers wurden senkrecht zur Blattoberfläche am Blatthalter auf der kundenspezifischen Probenstufe eingestellt, und eine Halogenlampe wurde für die aktinische Lichtbestrahlung aus linker und rechter Richtung verwendet, ohne Schatten. Die PAM- und Blattreflexionssignale wurden...

Diskussion

In dieser Studie haben wir zusätzliche Beweise dafür erhalten, dass PRI Xanthophyllpigmente darstellt, indem gleichzeitig Chlorophyllfluoreszenz und Blattreflexion gemessen werden.

Ein Halogenlicht, das Wellenlängen hat, die dem Sonnenlicht ähneln, wurde für den Einsatz als aktinische Lichtquelle zur Aktivierung der Photosynthese angepasst. Wir verwendeten zunächst eine weiße LED-Lichtquelle, um thermische Schäden an der Blattoberfläche zu vermeiden, aber dies führte zu einer langsam...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halogen light source	OptoSigma	SHLA-150
Light quantum meter	LI-COR	LI-1000
PAM chlorophyll fluorometer	Walz	JUNIOR-PAM
PAM controliing software	Walz	WinControl-3.27
Reflectance standard	Labsphere, Inc.	SRT-99-050
Spectral radiometer	ADS Inc.	Field Spec3
Spectral radiometer controlling software	ADS Inc.	RS3