Avaliação de comportamentos fotossintéticos por medições simultâneas de reflectância foliar e análises de fluorescência de clorofila

Resumo

Nós descrevemos uma aproximação técnica nova para estudar respostas fotossintética em umas plantas mais elevadas que envolvem medidas simultâneas da fluorescência da clorofila a e da reflectância da folha usando um Pam e um radiómetro espectral para a deteção dos sinais do mesma área foliar em Arabidopsis.

Resumo

A análise da fluorescência da clorofila a é amplamente utilizada para medir comportamentos fotossintéticos em plantas intactas, e resultou no desenvolvimento de muitos parâmetros que medem eficientemente a fotossíntese. A análise da reflectância foliar fornece diversos índices de vegetação em ecologia e agricultura, incluindo o índice de reflectância fotoquímico (PRI), que pode ser usado como um indicador de dissipação de energia térmica durante a fotossíntese, pois se correlaciona com têmpera não fotoquímica (NPQ). No entanto, como o NPQ é um parâmetro composto, sua validação é necessária para entender a natureza do parâmetro PRI. Para obter evidências fisiológicas para avaliação do parâmetro PRI, medimos simultaneamente a fluorescência de clorofila e a reflectância foliar no ciclo xantofilo mutante defeituoso (npq1) e no tipo selvagem de plantas de Arabidopsis. Adicionalmente, o parâmetro qZ, que provavelmente reflete o ciclo da xantofilo, foi extraído dos resultados da análise de fluorescência de clorofila, monitorando a cinética de relaxamento do NPQ após a comutação da luz. Essas medidas simultâneas foram realizadas por meio de um fluorômetro de clorofila de modulação de amplitude de pulso (PAM) e um radiômetro espectral. As sondas de fibra de ambos os instrumentos foram posicionadas próximas umas das outras para detectar sinais da mesma posição foliar. Uma fonte de luz externa foi usada para ativar a fotossíntese, e as luzes de medição e luz saturada foram fornecidas a partir do instrumento PAM. Este sistema experimental permitiu-nos de monitorar o PRI Light-dependent na planta intata e revelou que as mudanças luz-dependentes no PRI diferem significativamente entre o tipo selvagem e o mutante npq1 . Além disso, o PRI foi correlacionado fortemente com o QZ, significando que QZ reflete o ciclo do xantofila. Juntas, essas medidas demonstraram que a medida simultânea da reflectância foliar e da fluorescência da clorofila é uma abordagem válida para a avaliação dos parâmetros.

Introdução

A reflectância foliar é utilizada para sentir remotamente os índices de vegetação que refletem a fotossíntese ou traços nas plantas^1,2. O índice de vegetação de diferença normalizada (NDVI), que é baseado em sinais de reflexão infravermelha, é um dos índices de vegetação mais conhecidos para a detecção de propriedades relacionadas à clorofila, e é usado nas ciências ecológicas e agrícolas como um indicador de respostas ambientais em árvores ou culturas³. Em estudos de campo, embora muitos parâmetros (por exemplo, índice de clorofila (IC), índice de água (WI), etc.) tenham sido desenvolvidos e utilizados, poucas verificações detalhadas do que esses parâmetros diretamente (ou indiretamente) detectam foram realizados usando mutantes.

A análise da modulação por amplitude de pulso (PAM) da fluorescência da clorofila é um método efetivo para mensurar as reações fotossintéticas e os processos envolvidos no fotosistema II (PSII)⁴. A fluorescência da clorofila pode ser detectada com uma câmera e usada para a triagem de mutantes de fotossíntese⁵. No entanto, a detecção de câmera de fluorescência de clorofila requer protocolos complexos, como o tratamento escuro ou pulsos de saturação de luz, que são difíceis de implementar em estudos de campo.

A energia de luz solar absorvida pela folha é consumida principalmente por reações fotossintéticas. Em contrapartida, a absorção de excesso de energia luminosa pode gerar espécies reactivas de oxigénio, o que provoca danos às moléculas fotossintéticas. O excesso de energia luminosa deve ser dissipado como calor através de mecanismos de têmpera não fotoquímica (NPQ)⁶. O índice de reflectância fotoquímica (PRI), que reflete mudanças dependentes da luz nos parâmetros de reflectância foliar, é derivado da reflectância de banda estreita em 531 e 570 nm (comprimento de onda de referência)^7,8. É relatado para correlacionar com NPQ na análise da fluorescência da clorofila⁹. No entanto, como o NPQ é um parâmetro composto que inclui o ciclo da xantofilo, a tradição do estado e a Fotoinibição, é necessária uma validação detalhada para entender o que o parâmetro PRI mede. Nós focamos no ciclo de xantofila, um sistema de dissipação térmica que envolve o de-epoxidation de pigmentos do xantofila (Violaxanthin a antheraxanthin e o zeaxanthin) e um componente principal de npq porque as correlações entre o PRI e a conversão destes os pigmentos foram relatados em estudos precedentes⁸.

Muitos mutantes relacionados à fotossíntese foram isolados e identificados em Arabidopsis. O mutante npq1 não acumula o zeaxantina porque carreg uma mutação no de-epoxidase do violaxantina (VDE), que catalisa a conversão de violaxantina a zeaxantina¹⁰. Para estabelecer se o PRI detecta somente mudanças em pigmentos do xantofila, Nós medimos simultaneamente o PRI e a fluorescência da clorofila na mesma área de folha em npq1 e no selvagem-tipo e então no npq dissecado em escalas de tempo variando do abrandamento escuro para extrair componente relacionado com a xantofilo¹¹. Essas medições simultâneas fornecem uma técnica valiosa para a atribuição de índices de vegetação. Além disso, desde que o PRI correlaciona com a produtividade preliminar bruta (GPP), a habilidade de atribuir o PRI precisamente a um componente tem aplicações importantes na ecologia¹².

Protocolo

1. cultivo de plantas de Arabidopsis

1. Mergulhe sementes de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em água desionizada esterilizada em um microtubo, e incubar por 2 dias a 4 ° c no escuro.
2. Coloc aproximadamente quatro das sementes imbibed, frio-tratadas na superfície do solo usando uma micropipeta. Incubar os vasos plantados em uma câmara de crescimento com uma luz de 16 h (120 μmol fótons m^{– 2} s^{– 1}) e 8 h de período escuro a 22 ° c e 20 ° c, respectivamente.
3. Cresça uma planta por o potenciômetro diluindo outras plântulas após a germinação. Prepare pelo menos cinco potes. Incubar as plantas na câmara de crescimento por um adicional de 4 semanas. Três plantas são usadas para os experimentos.
4. Use a folha madura mais jovem e totalmente aberta para medições de fotossíntese.

2. Configurando o estágio da amostra, os instrumentos fotossintéticos e a fonte luminosa

Nota: para este protocolo, foi utilizado um estágio de amostra personalizado para a fixação de folhas e sondas de detecção (Figura 1).

1. Prenda uma placa de aço de 10 cm² com um furo do diâmetro de 1 cm no estágio feito-à-medida da amostra. O tamanho do furo nesta placa pode ser mudado para acomodar amostras diferentes da folha ou espécies de planta. O estágio tem um grampo para fixar as pontas de prova da deteção e um ajustador para ajustar a distância entre as pontas de prova e a amostra da folha.
2. Prepare pontas de prova finas da fibra para medir a fluorescência da clorofila e a reflectância da folha. Estas pontas de prova finas da fibra serão posicionadas pròxima de modo que meçam sinais da mesma posição da folha.
   Nota: um fluorômetro de clorofila PAM e um radiômetro espectral foram adaptados para detecção de sinais de fluorescência de clorofila A e reflectância foliar, respectivamente. Ambos os instrumentos usam pontas de prova finas da fibra com diâmetros de 1 milímetro e de 2 milímetros, respectivamente.
3. Ajuste estas duas pontas de prova firmemente junto e envolva-as com a fita plástica.
4. Grampeie as pontas de prova gravadas no estágio da amostra usando um suporte de lente coaxial (veja Figura 1), e posicione-os verticais à superfície da folha.
   Nota: o campo de visão do cabo de fibra óptica no radiômetro espectral é α = 25 °. Neste método, a distância entre as pontas da sonda de fibra e a superfície foliar é inferior a 1 cm. Conseqüentemente, a área de medição da folha é quase a mesma que aquela da fibra.
5. Prenda uma guia de luz biforked feita das fibras de vidro à fonte luminosa do halogênio e irradie o estágio da amostra de ambos os sentidos em ângulos de aproximadamente 45 °.
   Nota: uma lâmpada do halogênio, que seja próxima à distribuição do comprimento de onda da luz solar natural, é usada como a luz acóica para induzir a fotossíntese. A fonte luminosa do halogênio foi adaptada com um filtro frio incorporado, que remova comprimentos de onda longos do infravermelho próximo, para impedir aumentos na temperatura de superfície da folha (λ = 400 a 800 nanômetro).
6. Ajuste a fonte luminosa de modo que a luz ilumina uniformemente o estágio da amostra sem sombras da carcaça.

3. Configurando medições simultâneas de reflectância foliar e fluorescência de clorofila

Nota: todas as etapas são executadas no quarto escuro para evitar a deteção da luz à excepção da luz acóica. Uma luz verde-fraca (por exemplo, luz verde-cellophaned) deve ser desligada antes das medições reais.

1. Medindo a distância entre a amostra foliar e as sondas na fase de amostragem.
   1. Coloque uma folha de teste no porta-folhas do estágio da amostra no escuro. Pressione a folha contra uma chapa de aço no palco (quadrado preto na Figura 1).
   2. Gire sobre o PAM e irradie a amostra da folha com uma luz de medição. Os valores das intensidades de fluorescência da clorofila são confirmados por meio do software de controle do PAM (vide tabela de materiais).
   3. Mova o ajustador de modo que a intensidade da fluorescência mede aproximadamente 100. Meça a distância entre a sonda e a folha. Fixe o ajustador e registre o valor da distância no ajustador.
   4. Desligue a luz de medição. Retire a folha de teste.
2. Medindo as intensidades de irradiância da luz acóica
   Nota: para observar os comportamentos fotossintéticos dependentes da luz, a luz acóica de intensidade variável é utilizada para irradiar a amostra foliar.
   1. Defina um medidor quântico leve na posição onde a folha de amostra seria colocada.
   2. Irradiar a luz da fonte luminosa do halogênio e medir a intensidade.
   3. Determine quais posições do mostrador da fonte luminosa gerariam intensidades de 30, 60, 120, 240 e 480 μmol fótons m^{– 2} s^{– 1}.
      Nota: as plantas de Arabidopsis são cultivadas 120 μmol fótons m^{– 2} s^{– 1}; Conseqüentemente, as intensidades da irradiância da luz acóica são selecionadas para fornecer uma escala de intensidades pequenas e grandes.
   4. Marque cada intensidade de irradiância no mostrador.
3. Medir um padrão de reflexão.
   Nota: é necessário um padrão de reflexão para calcular a razão de reflectância foliar em cada intensidade de irradiância.
   1. Coloque uma placa branca como um padrão de reflectância na posição da amostra foliar.
   2. Ligue um radiômetro espectral. O sinal de refletância é mostrado pelo software de controle do radiômetro espectral. Neste momento, não há dados espectrais porque não há luz irradiante.
   3. Ligue a lâmpada de halogéneo para irradiar com 480 μmol fótons m^{– 2} s^{– 1}, a maior intensidade de irradiância neste teste.
   4. Ajuste a força de detecção do radiômetro para evitar a saturação.
   5. Grave a reflectância espectral entre 450 – 850 nm em intervalos de 1 nm iluminação com 30, 60, 120, 240 e 480 μmol fótons m^{– 2} s^{– 1}.
      Nota: um sinal eléctrico de linha de base (corrente escura) é corrigido e subtraído a cada medição espectral.

4. medições simultâneas de reflectância foliar e fluorescência de clorofila a , e cálculo de parâmetros fotossintéticos

1. Defina uma planta na posição da amostra da folha.
   1. Transfira a planta de Arabidopsis da câmara crescida à sala escura controlada com a mesma temperatura e umidade que aquela da câmara do crescimento.
   2. Incubar a planta por 1 h no escuro a 22 ° c para dissipar elétrons do centro de reação PSII e para relaxar de têmpera não fotoquímica.
   3. Coloque a planta inteira adaptada à escuridão em uma tomada de laboratório a etapa da amostra (Figura 1).
   4. Fixe a folha da amostra ao suporte da folha de modo que a superfície da folha seja perpendicular às pontas de prova da deteção.
2. Medição do rendimento quântico máximo de PSII.
   1. Ligue o PAM e comece a gravar a curva. Esse valor é chamado 0.
   2. Gire sobre a luz de medição, e espere aproximadamente 30 s para que a curva responda. Esse valor é chamado F₀.
   3. Dê um pulso saturado de 4000 μmol fótons m^{– 2} s^{– 1} para 0,8 s do Pam.
   4. Obter o maior valor do pico na curva com maior intensidade de fluorescência. Esse valor é chamado F_M.
   5. Calcule o rendimento quântico máximo de PSII no escuro (f_V/f_M), usando a seguinte equação.
      F_V/f_m = (f_m – f₀)/ f m
3. Mensuração de comportamentos fotossintéticos no estado estacionário.
   1. Gire sobre a lâmpada do halogênio como a fonte luminosa externa com a luz de medição sobre após a gravação F_M (Veja 4.2.4). Em primeiro lugar, irradiar a amostra foliar com a luz mais fraca (30 μmol fótons m^{– 2} s^{– 1}).
   2. Gire sobre o radiómetro espectral ao mesmo tempo para monitorar a reflectância da folha.
   3. Aguarde 20 min ou mais para que a reação fotossintética atinja o estado estacionário as condições de luz. A intensidade da fluorescência do estado estacionário é chamada FS.
   4. Forneça um pulso saturando em intervalos de 1 minuto durante a iluminação com a luz acóica. O valor máximo de fluorescência obtido a luz pulsada é chamado de F_M′.
   5. Registre os dados de F_M′ em 20 min depois de ligar a luz acóica.
   6. Tome dados da reflectância da folha com uma média de 10 varreduras em um tempo de integração otimizado, com uma subtração de corrente escura.
4. Cálculo de parâmetros fotossintéticos em estado estacionário.
   1. Calcule os rendimentos quânticos da fotoquímica PSII (Φ_PSII), que pode ser estimada irradiando-se com pulsos saturados luz acóica, utilizando a seguinte equação.
      Φ_PSII = (f_m′- f_S)/ f_m′
   2. Estimar o fluxo de elétrons lineares (LEF) do centro de reação PSII como segue ⁴.
      LEF = a intensidade da irradiância da luz acóica × Φ_PSII × 0,5 × 0,84
   3. Calcule o NPQ, que pode ser expressado a dissipação térmica, usando a seguinte equação.
      npq = (f m- fm ′)/ f_m′
      Nota: a energia luminosa é principalmente consumida por reações de fotossíntese. No entanto, quando as plantas absorvem mais energia luminosa do que a energia consumida pela fotossíntese, os mecanismos para a dissipação térmica são induzidos para evitar o excesso de energia.
   4. Utilizando os dados espectrais adquiridos com o radiômetro as mesmas condições de luz, calcular a razão de reflectância foliar da seguinte forma.
      Relação da reflectância = R_Leaf /r_padrão
   5. Calcule PRI de 531 nm e 570 nm da seguinte forma. Estes dois comprimentos de onda são extraídos da relação da reflectância.
      PRI = (R₅₃₁– r₅₇₀)/(r₅₃₁+ r₅₇₀)
      Nota: R é uma reflectância.
5. Medição da cinética de relaxamento da têmpera não fotoquímica.
   1. Desligue a luz acóica depois de adquirir o FS e a reflectância foliar.
   2. Monitore a fluorescência da clorofila por PAM por 10 minutos depois de desligar a luz.
   3. Forneça um pulso saturando em intervalos de 1 minuto durante o abrandamento escuro. O valor máximo de fluorescência induzido pelo pulso de saturação o escuro é chamado de F_M′ ′. Obter dez de F_M′ ′ em um teste.
   4. Salve os dados de F_M′ ′ em 2 min e 10 min depois de desligar a luz acóica.
   5. Gire a luz acóica no conjunto para a próxima intensidade de irradiância, 60 μ mol fótons m^{– 2} s^{– 1}.
   6. Repita uma adaptação leve por 20 min e um relaxamento escuro por 10 min com luz de saturação pulsante em intervalos de 1 min. grave todos os dados conforme descrito acima. Repita todas as etapas e medições usando a irradiação em 120, 240 e 480 μ mol fótons m^{– 2} s^{– 1}.
6. Cálculo dos parâmetros da têmpera não fotoquímica da cinética de relaxamento.
   Nota: a indução Light-dependent de NPQ é relaxada desligando a fonte luminosa¹³. É possível fraccionar cada função NPQ ajustando os prazos de relaxamento.
   1. Estimar a fração qE (têmpera dependente de energia) usando F_M′ ′ após 2-min adaptação escura.
      qE = (f_M2m′ ′ –f_m′)/ f_m′
      Nota: a fração qE é rapidamente invertida dentro de 1 – 2 min. Esta fração inclui principalmente a protonação de PSBS e parte da conversão da xantofilo, que dependem do δph induzido pela luz através da membrana tilacóides¹³. Ambos são reversíveis na repartição do gradiente.
   2. Calcule a fração qZ (zeaxantina dependente de têmpera) usando F_M′ ′ após adaptação escura de 10 min.
      QZ = (f_M10m′ ′ –f_m′)/ f_m′
      Nota: uma cinética de relaxamento de NPQ a aproximadamente 10 min após a luz acóica fora reflete um ciclo de xantofilo¹⁴. A maior parte da conversão da xantofilo é revertida em escalas temporais mais longas de aproximadamente 10 min (qZ) porque a conversão requer uma reação enzimática de VDE (violaxantina de-epoxidase). A fração é relaxada igualmente pela avaria do δph através da membrana do tilacóides.
   3. Calcule o qI (estado fotoinibitório) da seguinte forma.
      qI = (f_m–f_M10m′ ′)/ f_m′
      Nota: a recuperação mais lenta entre frações NPQ é pensado para ser Fotodano de PSII (indicando o volume de negócios D1). Esta fração do estado fotoinibitório (qI), que não se recupera por 10 min¹⁵.

Resultados

A Figura 1 apresenta um diagrama esquemático do conjunto experimental para medir simultaneamente a fluorescência da clorofila e a reflectância foliar. As sondas de fibra do PAM e do radiômetro espectral foram ajustadas perpendicularmente à superfície foliar no suporte foliar no estágio de amostra feito medida, e uma lâmpada halógena foi usada para irradiação acóica de luz de direções esquerda e direita sem fundição Sombras. Os sinais PAM e ref...

Discussão

Neste estudo, nós obtivemos a evidência adicional para mostrar que o PRI representa pigmentos do xantofila medindo simultaneamente a fluorescência da clorofila e a reflectância da folha.

Uma luz do halogênio, que tenha comprimentos de onda similares à luz solar, foi adaptada para o uso como uma fonte luminosa acóica para ativar a fotossíntese. Inicialmente, utilizamos uma fonte de luz LED branca para evitar danos térmicos da superfície foliar, mas isso produziu cinética lenta de rel...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halogen light source	OptoSigma	SHLA-150
Light quantum meter	LI-COR	LI-1000
PAM chlorophyll fluorometer	Walz	JUNIOR-PAM
PAM controliing software	Walz	WinControl-3.27
Reflectance standard	Labsphere, Inc.	SRT-99-050
Spectral radiometer	ADS Inc.	Field Spec3
Spectral radiometer controlling software	ADS Inc.	RS3