ואפופטוזיס השראה ואיתור בתרבות העיקרית של מלפפונים בתאי מעיים ים

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה קלה לאחיזה לתרבות תאי המעיים ממלפפון המים האפוסטיקוס והיא מתאימה למגוון של דגימות רקמה בהיקף נרחב מאורגניזמים ימיים, כולל קווקדרפה, מולסקה וסרטנים.

Abstract

תאים מתורבתים ראשוניים משמשים במגוון דיסציפלינות מדעיות ככלים חשובים במיוחד להערכה פונקציונלית של חומרים ביולוגיים או אפיון של פעילויות ביולוגיות ספציפיות. עם זאת, בשל היעדר התקשורת האוניברסלית הישימה של תרבות התא ופרוטוקולים, תיאר היטב שיטות התרבות תאים עבור אורגניזמים ימיים עדיין מוגבלים. בינתיים, הזיהום הנפוץ ביותר של חיידקים ותכונות פוליטרופי של התאים החסרי חוליות ימיים עוד לעכב את הקמת האסטרטגיה האפקטיבית תרבות התא עבור חסרי חוליות ימיים. כאן, אנו מתארים שיטה קלה לטפל לתאי מעיים culturing מלפפון ים האפוסטיקוס; בנוסף, אנו מספקים דוגמה האינדוקציה ואפופטוזיס מבחנה ואיתור בתאי המעי העיקריים תרבותי. כמו-כן, ניסוי זה מספק פרטים אודות השיטה המתאימה ביותר לאוסף התרבות ולאיסוף התאים. הפרוטוקול המתואר מתאים למגוון של דגימות רקמה בהיקף נרחב מאורגניזמים ימיים, כולל קווקדרפה, מוללוסקה וסרטנים, והוא יכול לספק תאים מספיקים עבור מספר יישומים ניסיוניים בעלי מבחנה. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לטפל ביעילות בתרבויות התאים הראשוניים מחסרי חוליות ימיים ולהקל על הערכה פונקציונלית של חומרים ביולוגיים ייעודיים על תאים.

Introduction

התאים המוגמרים בתנאים מלאכותיים, ולא בסביבתם הטבעית, מספקים חומרים ניסיוניים אחידים למחקרים ביולוגיים, במיוחד למינים שאינם יכולים להיות מתורבתים בקלות בסביבת מעבדה. בחשבון של יותר מ -30% מכלל המינים בעלי החיים הימיים,^{והם מספקים}חומרים ביולוגיים רבים למחקר התחייבות על מנגנוני הרגולציה של תהליכים ביולוגיים ספציפיים, כגון התחדשות^2,3, לחץ התגובה⁴, והסתגלות סביבתית^5,6.

מלפפון-ים האפוסטיקוס, הוא אחד מזני הקווצי הנלמדים ביותר הנמצאים במים ממוזגים לאורך החוף הצפוני של האוקיאנוס השקט. הוא ידוע גם כמינים חשובים מבחינה מסחרית ולחקלאות בקנה מידה גדול במזרח אסיה, בעיקר בסין⁷. שאלות מדעיות רבות לגבי היפנים, כולל מנגנוני הרגולציה שבבסיס התחדשות המעיים לאחר הוצאת המעיים⁸ וניוון בשנת⁹, בקרה מטבולית^10,11, התגובה החיסונית^12,13 תחת תרמי או פתוגניים מדגיש, משכו את תשומת לבם של חוקרים. עם זאת, בהשוואה לבעלי חיים מדגם היטב, מחקר בסיסי, בעיקר במישור הסלולר, מוגבל על-ידי צווארי בקבוק טכניים, כגון חוסר שיטות מתקדמות בתרבות התא.

החוקרים הקדישו מאמץ רב להקמת קווי תאים, אבל הם גם התמודד עם אתגרים רבים ולא קו התאים של כל חסרי חוליות ימיים הוקמה עדיין¹⁴. עם זאת, תרבויות התאים הראשוניים של חסרי חוליות ימיים מתקדמים בעשורים האחרונים^15,16, והם סיפקו הזדמנות לניסויים ברמה התאית. לדוגמה, האינטסינוס הניתן ליצירה מתוך מקור הפקוניקוס נוצל כמקור תאים לתרביות תאים לטווח ארוך שסיפקו שיטה מעשית לתרבות התא הראשונית של חסרי חוליות ימיים¹⁷. פרוטוקול זה משולב ואופטימיזציה חסרי חוליות התרבות התאים מתקרב ופיתח שיטת התרבות הראשית מתאים באופן נרחב עבור מלפפון ים או חסרי חוליות ימיים אחרים.

אפופטוזיס היא תוכנית התאבדות התא הפנימי המופעל על ידי שונים הגירויים אנסוגני ואנדוגניים. אפופטוזיס מתואמת הוא חיוני למערכות ביולוגיות רבות^18,19, וזה היה מעורב רגרסיה המעי של מלפפון ים במהלך הזמן הנכון⁹. כדי לחקור את תהליך האפוטוטיק באורגניזמים של עניין, סדרה של שיטות, כולל כתמים הוקוסט ומיקרוסקופיה, הוקמו והוחלו בהצלחה²⁰. כאן, אנו מתנהל ואפופטוזיס השראה ואיתור בתאי המעי העיקרי תרבותי של מלפפון ים כדי להעריך את השימושיות של תאים ראשוניים במחקרים ביולוגיים של חסרי חוליות ימיים. Dexamethasone, אחד הנפוצים בשימוש גלוקוקורטיקוסטרואידים²¹, שימש כדי לגרום אפופטוזיס בתאי מעיים מתורבת מלפפון ים, ואות הופסט משמעותי 33258 התגלתה בהצלחה בתאי הכתמים על ידי מיקרוסקופ פלורסנט.

Protocol

1. הכנה לתרבות התא בינונית

1. הכנת נוזלים קומטומית
   1. אוסף הנוזלים קואוממית: בתנאים סטריליים, בנתח מלפפון ים בריא (משקל רטוב של 85-105 גרם), לאסוף נוזל קולאומית, ולאחסן אותו בבקבוקון זכוכית סטרילית.
   2. הסרת תא קואוממית: צנטריפוגה את הנוזל קולאומית ב 50 mL צנטריפוגה צינורות ב 1,700 x g עבור 5 דקות ולהעביר את supernatant לתוך הבקבוקון זכוכית סטרילית חדשה; בשלב הבא, לאסוף את נוזל קולאומית ללא תא של מלפפון הים.
   3. הפעלת רכיבים משלימים: דגירה הבקבוקון זכוכית סטרילי, המכיל את הנוזל מלפפון קואומית ים, ב 40-50 ° c באמבט מים עבור 20 – 40 דקות כדי להשיג רכיבים משלימים-נוזל קולאומית מופעל.
   4. הסרת חיידק: הסרת חיידקים וכלמידיה על ידי סינון דרך מסנני קרום 0.22 יקרומטר. הבא, להסיר mycoplasma וחלקיקים עדינים אחרים על ידי סינון באמצעות 0.1 יקרומטר מסננים קרום להשיג פתרון מראש נוזל הטיפול הקדם.
   5. כוונון מליחות: להתאים את המליחות של הפתרון הטיפול מראש הנוזל קולוממית ל 30‰ (נמדד על ידי salinometer) על ידי הוספת 20% ריכוז גבוה טרום מעוקר ומסונן פתרון (מדולל על ידי נוזל קולאומית מראש) או DDW (מים מזוקקים כפול). העבר את נוזל מלפפון קואוממית ים לתוך בקבוק סטרילי, לאטום את הבקבוק, ולאחסן את הנוזל ב 4 ° c עבור ניסויים נוספים.
2. ליבוביץ ' של L-15 תרבות התא אופטימיזציה בינונית
   1. שוקלים 5.05 g של הנרוג, 0.135 g של KCl, 0.15 g של CaCl₂, 0.25 g של Na₂SO₄, 0.975 g של mgcl₂, 0.25 g של גלוקוז, ו 6.25 mg של טאורין ולדלל אותם ב 40 מ ל של ליבוביץ ' s-15 בינוני של לייבוביץ ' מדיום צנטריפוגה סטרילית. מתפרעים את הצינור על שייקר עבור 1 h כדי להבטיח את המלחים יש מומס לחלוטין.
   2. הוסף 2.5 mL של l-גלוטמין (100 mg/ml) ו 500 μl של פתרון VE (1.75 mg/L) לתוך הבינוני l-15 מוכן ליבוביץ ' s-בינוני ועוד לסנן את המדיום דרך מסנני ממברנה יקרומטר ב0.22.
   3. כוונן את הנפח הבינוני הכולל ל-500 mL עם מדיום לייבוביץ ' L-15 טרי עם 100 מ ל של נוזל קולאומית שהוכן בעבר; הבא, להתאים את ה-pH כדי 7.6 באמצעות NaOH פתרון. שמור את תהליך הפעולה בסביבה סטרילית. יחס הרכבה של נוזל קולוממית יכול להיות 10% – 50%, ו -20% מספיקה לתרבות של תאי מעיים .

2. הכנה לתאי המעיים

1. עיבוד המעי מלפפון ים
   1. מלפפונים הרדים ים בריאים בקופסת קרח. לנתח ולאסוף את המעיים הקדמי, ואז לחלק את דגימות הרקמה אנכית ולהסיר את התוכן הפנימי.
   2. רוחצים את דגימות הרקמה בתמיסת מלח מלוחים (PBS) פעמיים ולחטא אותם על ידי הטבילה בפתרון אתנול מימית (75% על ידי נפח) עבור לא יותר מ 2 s.
   3. לשטוף את דגימות רקמות ב-PBS שלוש פעמים כדי להסיר אתנול ולהעביר על 100 מ"ג של דגימת רקמות לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה סטרילית של 2.0 mL.
2. אוסף תאים
   1. הוסף 1.5 mL של בינונית התרבות טרום אופטימיזציה לחסום את מלפפון הים רקמת מעיים לחסום את הבלוק עם מספריים כירורגי מעוקר עד הפתרון מעונן.
      הערה: עבור פרוטוקול מפושטת, הוסף 0.5 mL של בינוני התרבות ממוטבת מראש לחסום מלפפון מעיים של הים וחותכים את הבלוק עם מספריים כירורגיים מעוקר לתוך 1 מ"מ³. העבירו במישרין את הדגימות למנות תרבות ואחריו שלבי הדגירה הבאים.
   2. הוסף 400 μl של טריפסין (0.25%), ערבב את הפתרון על-ידי היפוך, ומארג אותו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר; לאחר מכן, סנן את הפתרון באמצעות מסננת תאים מבית 100 יקרומטר.
      הערה: היא אופציונלית להוסיף טריפסין לפיזור תאים בעת טיפול בדגימות רקמה שונות. את חומצת החומץ (EDTA) יש לכלול ב טריפסין פתרון כדי לצמצם את פעילות המעעכבות מ-Ca^{2 +} ו-Mg^{2 +} במדיום התרבותי.
   3. לאסוף את פילטרט חדש סטרילי 2.0 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה, צנטריפוגה ב 1,700 x g עבור 3 דקות, להיפטר supernatant, לאחר מכן להשעות את הגלולה במדיום התרבות (שיושלם עם אנטיביוטיקה) ולשטוף אותו פעמיים.
      הערה: הכינו בינונית חדשה ממוטבת לתרבות מראש שיושלם עם 2% פניצילין-סטרפטומיצין פתרון (10,000 U/mL פניצילין 10 מ"ג/mL סטרפטומיצין) ו 1% gentamicin (4 מ"ג/mL) לפני תחילת הניסוי.

3. תרבית תאים

1. הגדרת החממה: יש לקבוע מראש את החממה לתרבות התא ולהריץ אותה מראש לפחות 24 שעות בטמפרטורה של 18 ° c ולחות רוויה.
   הערה: הזנה CO₂ לתוך החממה בהתאם למאפיינים המדיום של תרבות התא; אין שיתוף₂ צריך להיות מסופק בעת שימוש במדיום הבסיסי של ליבוביץ ' של L-15.
2. תרבות תא הבמה הראשונה
   1. כדי לעכב את התפתחותם של חיידקים ולקדם את התפשטות במהלך השלב הראשוני של תרבות התא, להוסיף 10 מ ל של הפתרון פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL פניצילין 10 מ"ג/mL סטרפטומיצין) ו 0.5 mL של gentamicin (40 mg/mL) לתוך כל 500 mL של מיטוב התרבות מראש. יתר על כן, תוספת כל 500 mL בינוני בתרבות עם 0.6 מ ל של אינסולין (10 מ"ג/mL), 100 μL של מקדם הצמיחה אינסולין כמו (0.1 μg/μL), ו -25 μL של הצמיחה פיברוהפיצוץ פקטור (0.1 μg/μL).
   2. לאסוף את התאים לתוך צינורות 1.5 mL, להשעות אותם באמצעות 200 μL של בינוני מצוין, ו ללטף אותם לתוך φ 4 ס מ מנות.
   3. תרבות התאים בחממה ולהוסיף 2.0 mL של מדיום המצוין כדי מנות התא culturing לאחר 6 h. לשנות את חצי המדיום כל 12 h עד להגיע לשלב הבא.
      הערה: טפל בשינוי הבינוני בעדינות, מכיוון שהתאים אינם מחוברים לכלים הדוקים. ניתן להשתמש במנות פולי-D-ליזין מצופות לחיבור באופן רופף לתאי הכלים.
3. תרבות תא הבמה השנייה
   1. כדי להפחית את ההשפעות השליליות של אנטיביוטיקה לתאים התרבותיים, להפחית את הריכוז של אנטיביוטיקה המצוין (פניצילין, סטרפטומיצין, ו gentamicin) ב התרבות בינונית על ידי חצי.
      הערה: השימוש באינסולין ובגורמי גדילה תלוי בתנאי תרבות התא והוא אופציונלי.
   2. החלף את המדיום של תרבות התא; לנהל שינויים בינוניים כל שנתיים עד שלושה ימים בהתאם לצפיפות התא.
      הערה: שימו לב לתאים המתורבית מדי יום מתחת למיקרוסקופ והקליטו את תנאי הגדילה.
4. הפסיית תא
   הערה: המעבר ותת-תרבות התאים, כאשר צפיפות התא הראשית מגיעה ל-60%.
   1. שטוף את התאים המתורבתיים פעמיים באמצעות ה-PBS בטמפרטורת החדר. הוסף 200 μL של טריפסין תמיסה (0.25%) לכל מנה ומתפרעים באופן ידני את המנה המבטיחה שכל התחתון מכוסה. להשליך את התמיסה טריפסין ואת התאים הדגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. שטוף את התאים עם 1.0 mL של מדיום התרבות הטרייה על ידי ליטוף והשעיית התאים מחדש. העברת 0.5 mL של השעיית התא למנה חדשה, להוסיף 1.5 mL של בינוני טרי, ו מודחת התאים ב 18 ° c.
      הערה: ניתן להשתמש בתאי מגרדים לאיסוף תאים כאשר פתרון טריפסין נכשל בעיכול וניתוק תאים מהמנות (קווי תא מסוימים הם דביקים מדי). עם זאת, אל תערוך את שתי השיטות בו.
   3. לשנות את המדיום לאחר 12 h ולהתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את התנאים. תרבות התאים עבור ניסיוני נוסף.

4. ואפופטוזיס השראה וזיהוי בתאי מעיים של הפקוניקוס

1. תרבית תאים וטיפול דקאמת1
   1. הכן תאי מעיים בעקבות הפרוטוקול שהוצג קודם לכן והוסף את התאים המדרוכים לצלחת של 12-היטב בנפח תא של 2 x 10⁶ לכל טוב.
   2. לאחר שלושה ימים בתרבות, בעקבות השלבים של "תרבות תא הבמה הראשונה", לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ולהחליף את המדיום עם בינונית אופטימיזציה (ללא אנטיביוטיקה וגורמי צמיחה).
   3. לדלל dexamethone (DXMS) בתווך התרבות כדי להכין טרי 2 μM ו-200 μM הפתרונות DXMS לפני תחילת הניסויים.
   4. הוסף פתרונות DXMS בריכוזים שונים לתאים מתורבתים גדל עם אותו נפח של בינונית culturing; הגדיר שלוש קבוצות נסיוניות כולל בקרה (CTL), 1 μM ו-100 μM DXMS.
2. צביעת הופסט
   1. שטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים לאחר הדגירה עם/ללא DXMS עבור תקופות הזמן המצוין (0 h, 24 h, ו 48 h).
   2. הוסף 300 μL של Hoechst 33258 פתרון לכל טוב לצלחת 12-באר ו דגירה ב 18 ° c עבור 30 דקות. בעדינות מתפרעים את הצלחת לכסות את כל התאים להבטיח את ההכתמים שלהם.
   3. הסר את הפתרון כתמים ולתקן את התאים על ידי הוספת 300 μL של 4% הפתרון פאראפורמלדהיד (ב PBS) לכל טוב. . מתפרעים בעדינות במשך 15 דקות
      זהירות: פאראפורמלדהיד הוא רעיל בינוני על ידי מגע העור או אינהלציה, והוא מיועד כנראה מסרטן אנושי סביר. מנדפים כימיים, מארזים במאזן פרקו, או אמצעי הגנה אחרים יש להשתמש במהלך שקילה וטיפול של פאראפורמלדהיד.
   4. שטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים ב-PBS. אל תמחק את ה-PBS לאחר כביסה כדי לשמור על תאים מכוסים.
3. אנליזה מיקרוסקופית פלורסנט
   1. הפעל את חומרת מיקרוסקופ הפלורסנט כולל כוח המנורה הכספית, כוח הפלורסנט, והמחשב. היכנס לחשבון מערכת ההפעלה, הפעל את התוכנה ובדוק את תצורתה.
   2. הניחו את הצלחת המוכנה על מיקרוסקופ הבמה. הצב את המדגם מעל העדשה האובייקטיבית באמצעות בקר הבמה.
   3. מצא את תאי העניין מתחת למיקרוסקופ האור, עבור למיקרוסקופ פלורסנט, ולכוד את התמונות על-ידי כוונון הפרמטרים.
      הערה: כדי להתבונן באות פלורסנט 33258 מאוגד ל-DNA גרעינים, מיקרוסקופ ניאון צריך להתבצע עם עירור ופליטה ב כ 352 ננומטר ו 461 nm, בהתאמה.

תוצאות

כאן, הקמנו את התרבות הראשית של תאי המעי . איור 1 מראה תאים עגולים בשלבים שונים של culturing. ו-EdU מכתים לספק ראיות ישירות כדי לחשוף את הפעילות ההתרבות של התאים העגולים האלה בשלב מאוחר יותר (איור 2). אנחנו גם קצת להתאים את הפרוטוקול, culturing בלוקים הרקמה הקצוצה במק?...

Discussion

מאמצי מחקר נרחבים הקדישו להקמת קווי תאים בעשורים האחרונים, עם זאת, עדיין קשה לבצע התקדמות בתרבות ארוכת טווח של תאים מחסרי חוליות ימיים^14,22. דווח כי תאים מתורבתים מליצור מתחדשות רקמות הולותאנית היו קיימא לתקופה ארוכה של זמן ופעילות גבוהה של התפשטות ניתן לזהו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 μm filter	Millipore	SLVV033RS
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
0.25% Trypsin	Genom	GNM25200
100 μm filter	Falcon	352360
4 cm dishes	ExCell Bio	CS016-0124
4% paraformaldehyde solution	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	in PBS
Benchtop Centrifuges	Beckman	Allegra X-30R
BeyoClick EdU-488 kit	Beyotime	C0071S
CaCl2	Sinopharm Chemical Reagent	10005817
Constant temperature incubator	Lucky Riptile	HN-3
Dexamethasone	Sinopharm Chemical Reagent	XW00500221
Electric thermostatic water bath	senxin17	DK-S28
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	80176961	75%
Fibroblast Growth Factor(FGF)	PEPROTECH	100-18B
Fluorescent microscope	Leica DMI3000B	DMI3000B
Garamycin	Sinopharm Chemical Reagent	XW14054101
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent	63005518
Hoechst33258 Staining solution	Beyotime	C1017
Insulin	Sinopharm Chemical Reagent	XW1106168001
Insulin like Growth Factor(IGF)	PEPROTECH	100-11
KCl	Sinopharm Chemical Reagent	10016308
Leibovitz's L-15	Genom	GNM41300
L-glutamine (100 mg/mL)	Genom	GNM-21051
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent	XW77863031
Na2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10020518
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent	10019718
PBS	Solarbio	P1020	pH7.2-7.4
Penicillin-Streptomycin	Genom	GNM15140
PH meter	Bante	A120
Taurine	SIGMA	T0625
VE	Seebio	185791