Induction et détection d'apoptosis dans une culture primaire des cellules intestinales de concombre de mer

Résumé

Ce protocole fournit une méthode facile à manipuler pour la culture des cellules intestinales du concombre de mer Apostichopus japonicus et est compatible avec une variété d'échantillons de tissus largement disponibles provenant d'organismes marins, y compris Echinodermata, Mollusca et Crustacea.

Résumé

Les cellules cultivées primaires sont utilisées dans une variété de disciplines scientifiques comme outils exceptionnellement importants pour l'évaluation fonctionnelle des substances biologiques ou la caractérisation d'activités biologiques spécifiques. Cependant, en raison de l'absence de médias et de protocoles de culture cellulaire universellement applicables, les méthodes de culture cellulaire bien décrites pour les organismes marins sont encore limitées. Pendant ce temps, la contamination microbienne et les propriétés polytropes des cellules d'invertébrés marins entravent davantage l'établissement d'une stratégie efficace de culture cellulaire pour les invertébrés marins. Ici, nous décrivons une méthode facile à manipuler pour cultiver les cellules intestinales du concombre de mer Apostichopus japonicus; en outre, nous fournissons un exemple d'induction et de détection in vitro d'apoptose dans les cellules intestinales cultivées primaires. En outre, cette expérience fournit des détails sur le milieu de culture approprié et la méthode de collecte cellulaire. Le protocole décrit est compatible avec une variété d'échantillons de tissus largement disponibles provenant d'organismes marins, y compris Echinodermata, Mollusca et Crustacea, et il peut fournir des cellules suffisantes pour de multiples applications expérimentales in vitro. Cette technique permettrait aux chercheurs de manipuler efficacement les cultures cellulaires primaires des invertébrés marins et de faciliter l'évaluation fonctionnelle des matériaux biologiques ciblés sur les cellules.

Introduction

La culture des cellules dans des conditions artificiellement contrôlées, et non dans leur environnement naturel, fournit des matériaux expérimentaux uniformes pour les études biologiques, en particulier pour les espèces qui ne peuvent pas être facilement cultivées dans un environnement de laboratoire. Les invertébrés marins représentent plus de 30% de toutes les espèces animales¹, et ils fournissent de nombreux matériaux biologiques pour entreprendre des recherches sur les mécanismes de régulation de processus biologiques spécifiques, tels que la régénération^2,3, la réponse au stress⁴, et l'adaptation environnementale^5,6.

Le concombre de mer, Apostichopus japonicus, est l'une des espèces d'échinodermes les plus étudiées qui habitent les eaux tempérées le long de la côte du Pacifique Nord. Il est bien connu comme une espèce commercialement importante et maricultured sur une grande échelle en Asie de l'Est, en particulier en Chine⁷. De nombreuses questions scientifiques concernant A. japonicus, y compris les mécanismes de régulation sous-jacents à la régénération intestinale après l'éviscération⁸ et la dégénérescence dans l'estivation⁹, le contrôle métabolique^10,11, et la réponse immunitaire^12,13 sous des contraintes thermiques ou pathogènes, ont attiré l'attention des chercheurs. Cependant, par rapport aux animaux modèles bien étudiés, la recherche fondamentale, en particulier au niveau cellulaire, est limitée par des goulots d'étranglement techniques, tels que l'absence de méthodes avancées de culture cellulaire.

Les chercheurs ont consacré beaucoup d'efforts à l'établissement de lignées cellulaires, mais ils ont également fait face à de nombreux défis et aucune lignée cellulaire d'aucun invertébré marin n'a été établie encore¹⁴. Cependant, les cultures cellulaires primaires des invertébrés marins ont progressé au cours des dernières décennies^15,16, et ils ont fourni une occasion d'expérimentation au niveau cellulaire. Par exemple, l'intesine régénératrice de A. japonicus a été utilisée comme source de cellules pour les cultures cellulaires à long terme qui ont fourni une méthode pratique pour la culture cellulaire primaire des invertébrés marins¹⁷. Ce protocole a combiné et optimisé les approches de culture cellulaire des invertébrés et a mis au point une méthode de culture primaire largement appropriée pour le concombre de mer ou d'autres invertébrés marins.

L'apoptose est un programme intrinsèque de suicide cellulaire déclenché par divers stimuli exogènes et endogènes. L'apoptose coordonnée est cruciale pour de nombreux systèmes biologiques^18,19, et il a été impliqué dans la régression intestinale du concombre de mer lors de l'aestivation⁹. Pour étudier le processus apoptotique dans les organismes d'intérêt, une série de méthodes, y compris la coloration Hoechst et des essais de microscopie, ont été établis et appliqués avec succès²⁰. Ici, nous avons effectué l'induction et la détection d'apoptose dans les cellules intestinales cultivées primaires du concombre de mer pour évaluer la facilité d'utilisation des cellules primaires dans les études biologiques des invertébrés marins. Dexamethasone, l'un des glucocorticostéroïdes synthétiques couramment utilisés²¹, a été utilisé pour induire l'apoptose dans les cellules intestinales cultivées de concombre de mer, et le signal significatif Hoechst 33258 a été détecté avec succès dans les cellules tachées par microscopie fluorescente.

Protocole

1. Préparation moyenne de culture cellulaire

1. Préparation coelomic fluide
   1. Collection de fluides coelomic : Dans des conditions stériles, disséquer un concombre de mer sain (poids humide de 85-105 g), recueillir du liquide coelomique et le stocker dans un flacon de verre stérile.
   2. Enlèvement coelomic de cellules : Centrifuger le liquide coelomique dans des tubes de centrifugeuse de 50 ml à 1 700 x g pendant 5 min et transférer le supernatant dans un nouveau flacon de verre stérile; ensuite, recueillir le liquide coelomic sans cellules du concombre de mer.
   3. Compléter l'inactivation des composants : Incuber le flacon de verre stérile, contenant le liquide coelomic de concombre de mer, dans un bain d'eau de 40 à 50 oC pendant 20 à 40 min pour obtenir du liquide coelomique inactivé par les composants complémentaires.
   4. Suppression de microbe : Enlever les bactéries et la chlamydia par filtration à travers des filtres à membrane de 0,22 m. Ensuite, retirez le mycoplasme et d'autres particules fines en les filtrationant à l'aide de filtres à membrane de 0,1 m pour obtenir une solution de prétraitement coelomic liquide.
   5. Ajustement de la salinité : Ajustez la salinité de la solution de prétraitement coelomic de fluide à 30 (mesurée par salinomètre) en ajoutant la solution presterilized et filtrée de 20% de presterilized et filtrée de NaCl (diluée par le fluide coelomic prétraité) ou DDW (eau distillée double). Transférer le liquide coelomique du concombre de mer dans une bouteille stérile, sceller la bouteille et entreposer le liquide à 4 oC pour d'autres expériences.
2. Optimisation moyenne de la culture cellulaire L-15 de Leibovitz
   1. Peser 5,05 g de NaCl, 0,135 g de KCl, 0,15 g de CaCl₂, 0,25 g de Na₂SO₄, 0,975 g de MgCl₂, 0,25 g de glucose, et 6,25 mg de taurine et de les diluer dans 40 mL de Leibovitz L-15 milieu dans un 50 mL de tuberif sterile centrif. Agiter le tube sur un shaker pendant 1 h pour s'assurer que les sels se sont dissous complètement.
   2. Ajouter 2,5 ml de L-glutamine (100 mg/ml) et 500 l de solution VE (1,75 mg/L) dans le milieu L-15 de Leibovitz préalablement préparé et filtrer davantage le milieu à travers des filtres à membrane de 0,22 m.
   3. Ajuster le volume moyen total à 500 ml avec le milieu L-15 frais de Leibovitz et avec 100 ml de liquide coelomic préalablement préparé; ensuite, ajuster le pH à 7,6 à l'aide de la solution NaOH. Gardez le processus d'opération dans un environnement stérile. Le rapport composé de fluide coelomic peut être 10%-50%, et 20% est suffisant pour la culture de cellules intestinales de A. japonicus.

2. Préparation des cellules intestinales

1. Traitement de l'intestin de concombre de mer
   1. Anesthésiez les concombres de mer sains dans une glacière. Disséquer et recueillir les intestins antérieurs, puis sectionner les échantillons de tissu verticalement et enlever le contenu intérieur.
   2. Laver les échantillons de tissus dans du phosphate tamponné saline (PBS) deux fois et les désinfecter par immersion dans une solution d'éthanol aqueux (75% en volume) pour pas plus de 2 s.
   3. Laver les échantillons de tissus dans pbS trois fois pour enlever l'éthanol et transférer environ 100 mg d'échantillon de tissu dans un tube microcentrifuge stérile de 2,0 ml.
2. Collection de cellules
   1. Ajouter 1,5 ml du milieu de culture pré-optimisé au bloc de tissu intestinal du concombre de mer et hacher le bloc avec des ciseaux chirurgicaux stérilisés jusqu'à ce que la solution soit trouble.
      REMARQUE : Pour un protocole simplifié facultatif, ajouter 0,5 ml de milieu de culture pré-optimisé au bloc de tissu intestinal du concombre de mer et couper le bloc avec des ciseaux chirurgicaux stérilisés en 1 mm^3. Transférez directement les échantillons vers des plats de culture suivis d'étapes d'incubation ultérieures.
   2. Ajouter 400 ll de trypsine (0,25%), mélanger la solution par inversion, et l'incuber pendant 5 min à température ambiante; puis filtrer la solution à l'aide d'une passoire à cellules de 100 m.
      REMARQUE : Il est facultatif d'ajouter la trypsine pour la dispersion cellulaire lors du traitement de différents échantillons de tissus. L'acide éthylediaminetetraacetic (EDTA) devrait être contenu dans la solution de trypsine pour réduire l'activité inhibitrice de Ca^{2 et} Mg 2 dans le milieu^de culture.
   3. Recueillir le filtrate dans un nouveau tube stérile de 2,0 mL de microcentrifuge, centrifugeuse à 1 700 x g pendant 3 min, jeter le supernatant, puis resuspendre le granule dans un milieu de culture (complété d'antibiotiques) et le laver deux fois.
      REMARQUE : Préparer un milieu de culture frais pré-optimisé complété par une solution de pénicilline-streptomycine de 2 % (10 000 U/mL de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine) et 1 % de gentamicine (4 mg/mL) avant le début de l'expérience.

3. Culture cellulaire

1. Préréglage de l'incubateur : Prérégler l'incubateur pour la culture cellulaire et l'exécuter à l'avance pendant au moins 24 h avec une température de 18 oC et une humidité saturée.
   REMARQUE : Nourrir le CO₂ dans l'incubateur en fonction des propriétés moyennes de la culture cellulaire; aucun CO₂ n'a besoin d'être fourni lors de l'utilisation du support de base du L-15 de Leibovitz.
2. Culture cellulaire de première étape
   1. Pour inhiber la croissance des microbes et favoriser la prolifération au cours de la phase initiale de la culture cellulaire, ajouter 10 ml de solution de pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL de pénicilline et 10 mg/mL de streptomycine) et 0,5 ml de gentamicine (40 mg/mL) dans chaque 500 mL de milieu de culture pré-optimisé. De plus, compléter chaque milieu de culture de 500 ml par 0,6 ml d'insuline (10 mg/mL), 100 l de facteur de croissance de l'insuline (0,1 g/L) et 25 l de facteur de croissance du fibroblaste (0,1 g/L).
   2. Recueillir les cellules dans des tubes de 1,5 ml, les suspendre à l'aide de 200 l de milieu indiqué, et les épisser dans des plats de 4 cm.
   3. Culture des cellules dans un incubateur et ajouter 2,0 ml de milieu indiqué à la cellule de culture des plats après 6 h. Changer la moitié du milieu toutes les 12 h jusqu'à atteindre l'étape suivante.
      REMARQUE: Manipuler le changement moyen doucement, parce que les cellules ne sont pas attachés à la vaisselle étroitement. Les plats enrobés de poly-D-lysine peuvent être utilisés pour s'attacher librement aux cellules de plat.
3. Culture cellulaire de deuxième étape
   1. Pour réduire de moitié les effets néfastes des antibiotiques sur les cellules cultivées, réduire de moitié la concentration d'antibiotiques indiqués (pénicilline, streptomycine et gentamicine).
      REMARQUE : L'utilisation de l'insuline et des facteurs de croissance dépend des conditions de culture cellulaire et est facultative.
   2. Remplacer le milieu de culture cellulaire; effectuer des changements moyens tous les deux à trois jours en fonction de la densité cellulaire.
      REMARQUE : Observez les cellules cultivées quotidiennement au microscope et enregistrez les conditions de croissance.
4. Passaging cellulaire
   REMARQUE : Passage et sous-culture des cellules, lorsque la densité cellulaire primaire atteint 60 %.
   1. Laver les cellules cultivées deux fois à l'aide de PBS à température ambiante. Ajouter 200 ll de solution trypsine (0,25%) à chaque plat et agiter manuellement le plat en veillant à ce que le fond entier est couvert. Jeter la solution de trypsine et incuber les cellules pendant 5 min à température ambiante.
   2. Laver les cellules avec 1,0 ml de milieu de culture frais par pipetting et resuspendre les cellules. Transférer 0,5 ml de suspension cellulaire dans un nouveau plat, ajouter 1,5 ml de milieu frais et incuber les cellules à 18 oC.
      REMARQUE : Les grattoirs cellulaires peuvent être utilisés pour la collecte cellulaire lorsque la solution de trypsine ne digère pas et ne détache pas les cellules de la vaisselle (certaines lignées cellulaires sont trop adhésives). Cependant, ne conduisez pas les deux méthodes simultanément.
   3. Changer le milieu après 12 h et observer les cellules au microscope pour évaluer les conditions. Culture des cellules pour d'autres essais expérimentaux.

4. Induction et détection d'apoptose dans les cellules intestinales de A. japonicus

1. Culture cellulaire et traitement de la dexaméthasone
   1. Préparer les cellules intestinales suivant le protocole précédemment introduit et ajouter les cellules goutte à une plaque de 12 puits à un volume cellulaire de 2 x 10⁶ par puits.
   2. Après trois jours de culture, suivant les étapes de la « culture cellulaire de première étape », lavez les cellules trois fois avec du PBS et remplacez le milieu par un milieu optimisé (sans antibiotiques et facteurs de croissance).
   3. Diluer la dexaméthasone (DXMS) dans le milieu de culture pour préparer des solutions diluées fraîches de 2 et 200 M DXMS avant de commencer les expériences.
   4. Ajouter des solutions DXMS en différentes concentrations aux cellules cultivées cultivées avec le même volume de milieu de culture; trois groupes expérimentaux, dont le contrôle (CTL), 1 M et 100 M DXMS.
2. Coloration Hoechst
   1. Laver les cellules avec du PBS trois fois après l'incubation avec/sans DXMS pour les périodes indiquées (0 h, 24 h et 48 h).
   2. Ajouter 300 oL de solution Hoechst 33258 par puits à une plaque de 12 puits et incuber à 18 oC pendant 30 min. Agiter doucement la plaque pour couvrir toutes les cellules assurant leur coloration.
   3. Retirez la solution de coloration Hoechst et fixez les cellules en ajoutant 300 L d'une solution de paraformaldéhyde de 4 % (en PBS) à chaque puits. Agiter doucement pendant 15 min.
      MISE EN GARDE: Le paraformaldéhyde est modérément toxique par contact cutané ou par inhalation, et il est désigné comme cancérogène probable pour l'homme. Les hottes chimiques de fumée, les enceintes d'équilibre ventilées, ou d'autres mesures protectrices devraient être employées pendant le poids et la manipulation du paraformaldéhyde.
   4. Laver les cellules fixes trois fois en PBS. Ne jetez pas le PBS après le lavage pour garder les cellules couvertes.
3. Analyse de microscopie fluorescente
   1. Allumez le matériel fluorescent de microscope comprenant la puissance de lampe de mercure, la puissance fluorescente de lumière, et le PC. Connectez-vous au compte du système d'exploitation, lancez le logiciel et vérifiez sa configuration.
   2. Placer la plaque préparée sur la scène du microscope. Placez l'échantillon au-dessus de l'objectif à l'aide du contrôleur d'étape.
   3. Trouvez les cellules d'intérêt sous le microscope léger, passez à la microscopie fluorescente et capturez les images en parant les paramètres.
      REMARQUE : Pour observer le signal fluorescent Hoechst 33258 lié à l'ADN des noyaux, la microscopie à fluorescence doit être effectuée avec excitation et émission à environ 352 nm et 461 nm, respectivement.

Résultats

Ici, nous avons établi la culture intestinale primaire de cellules de A. japonicus et avons passages les cellules. La figure 1 montre les cellules rondes à différents stades de la culture. Et les tests de coloration EdU fournissent des preuves directes pour révéler l'activité proliférante de ces cellules rondes à un stade ultérieur (Figure 2). Nous avons également légèrement ajusté le protocole, crepandant des blocs de tissu hachés au lieu...

Discussion

Des efforts de recherche approfondis ont été consacrés à l'établissement de lignées cellulaires au cours des dernières décennies, cependant, il est encore difficile de faire des progrès sur la culture à long terme des cellules des invertébrés marins^14,22. Il a été rapporté que les cellules cultivées des tissus holothuriens régénérants étaient viables pendant une longue période de temps et l'activité élevée de la prolifération peut être d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 μm filter	Millipore	SLVV033RS
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
0.25% Trypsin	Genom	GNM25200
100 μm filter	Falcon	352360
4 cm dishes	ExCell Bio	CS016-0124
4% paraformaldehyde solution	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	in PBS
Benchtop Centrifuges	Beckman	Allegra X-30R
BeyoClick EdU-488 kit	Beyotime	C0071S
CaCl2	Sinopharm Chemical Reagent	10005817
Constant temperature incubator	Lucky Riptile	HN-3
Dexamethasone	Sinopharm Chemical Reagent	XW00500221
Electric thermostatic water bath	senxin17	DK-S28
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	80176961	75%
Fibroblast Growth Factor(FGF)	PEPROTECH	100-18B
Fluorescent microscope	Leica DMI3000B	DMI3000B
Garamycin	Sinopharm Chemical Reagent	XW14054101
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent	63005518
Hoechst33258 Staining solution	Beyotime	C1017
Insulin	Sinopharm Chemical Reagent	XW1106168001
Insulin like Growth Factor(IGF)	PEPROTECH	100-11
KCl	Sinopharm Chemical Reagent	10016308
Leibovitz's L-15	Genom	GNM41300
L-glutamine (100 mg/mL)	Genom	GNM-21051
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent	XW77863031
Na2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10020518
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent	10019718
PBS	Solarbio	P1020	pH7.2-7.4
Penicillin-Streptomycin	Genom	GNM15140
PH meter	Bante	A120
Taurine	SIGMA	T0625
VE	Seebio	185791