JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол обеспечивает простой в обращении метод культуры кишечных клеток из морского огурца Apostichopus japonicus и совместим с различными широко доступными образцами тканей морских организмов, включая Эхинодермата, Моллюскуску и Раккусею.

Аннотация

Первичные культивированные клетки используются в различных научных дисциплинах в качестве исключительно важных инструментов для функциональной оценки биологических веществ или характеристики конкретных биологических видов деятельности. Однако из-за отсутствия универсально применимых средств массовой информации и протоколов клеточной культуры хорошо описанные методы клеточной культуры для морских организмов по-прежнему ограничены. Между тем, часто происходящее микробное загрязнение и политропные свойства морских беспозвоночных клеток еще больше препятствуют выработке эффективной стратегии клеточной культуры для морских беспозвоночных. Здесь мы описываем простой в обращении метод культивирования кишечных клеток из морского огурца Apostichopus japonicus; кроме того, мы предоставляем пример индукции in vitro apoptosis и обнаружения в первичных культивированных кишечных клетках. Кроме того, этот эксперимент содержит подробную информацию о соответствующем методе культуры и собираемости клеток. Описанный протокол совместим с различными широко доступными образцами тканей морских организмов, включая Эхинодермата, Моллюскусу и Раккуза, и может обеспечить достаточное количество клеток для нескольких экспериментальных применений in vitro. Этот метод позволит исследователям эффективно манипулировать первичными культурами клеток из морских беспозвоночных и облегчить функциональную оценку целевых биологических материалов на клетках.

Введение

Культивирование клеток в искусственно контролируемых условиях, а не в их естественной среде, обеспечивает единые экспериментальные материалы для биологических исследований, особенно для видов, которые не могут быть легко культивированы в лабораторных условиях. Морские беспозвоночные составляют более 30% всех видов животных1,и они обеспечивают многочисленные биологические материалы для проведенияисследований по регулирующим механизмам конкретных биологических процессов, таких как регенерация2,3,стресс ответ 4 , и экологическая адаптация5,6.

Морской огурец, Apostichopus japonicus, является одним из наиболее изученных видов эхинодерм, населяющих умеренные воды вдоль побережья Северной Части Тихого океана. Он хорошо известен как коммерчески важные виды и maricultured в больших масштабах в Восточной Азии, особенно в Китае7. Многочисленные научные вопросы, касающиеся A. japonicus, в том числе регулятивных механизмов, лежащих в основе кишечной регенерации после потрошивания8 и дегенерации в эстивации9,метаболический контроль10,11, и иммунный ответ12,13 под тепловой или патогенных стрессов, привлекли внимание исследователей. Однако, по сравнению с хорошо изученными модельными животными, фундаментальные исследования, особенно на клеточном уровне, ограничены техническими узкими местами, такими как отсутствие передовых методов клеточной культуры.

Исследователи посвятили много усилий для установления клеточных линий, но они также столкнулись со многими проблемами, и ни одна клеточная линия от любого морского беспозвоночного была создана еще14. Тем не менее, первичные клеточные культуры морских беспозвоночных продвинулись в последние десятилетия15,16, и они предоставили возможность для экспериментов на клеточном уровне. Например, регенерирующий интезин от A. japonicus был использован в качестве источника клеток для долгосрочных клеточных культур, которые предоставили практический метод для первичной клеточной культуры морских беспозвоночных17. Этот протокол объединил и оптимизировал культуру беспозвоночных клеток и разработал широко подходящий метод первичной культуры для морских огурцов или других морских беспозвоночных.

Апоптоз является внутренней программы самоубийства клетки вызваны различными экзогенными и эндогенными стимулами. Скоординированный апоптоз имеет решающее значение для многих биологических систем18,19, и он был вовлечен в кишечной регрессии морского огурца во время aestivation9. Для исследования апоптотический процесс в организмах, представляющих интерес, ряд методов, в том числе Hoechst окрашивания и микроскопических анализов, были созданы и успешно применяются20. Здесь мы провели индукцию апоптоза и выявление в первичных культивированных кишечных клетках морского огурца для оценки удобства использования первичных клеток в биологических исследованиях морских беспозвоночных. Дексаметазон, один из широко используемых синтетических глюкокортикостероидов21, был использован для индуцирования апоптоза в культивированных кишечных клетках из морского огурца, и значительный сигнал Hoechst 33258 был успешно обнаружен в окрашенных клетках флуоресцентной микроскопией.

протокол

1. Средняя подготовка клеточной культуры

  1. Coelomic препарат жидкости
    1. Коллекция coelomic жидкости: В стерильных условиях вскрыть здоровый морской огурец (мокрый вес 85-105 г), собрать коеломную жидкость и хранить ее в стерильной стеклянной колбе.
    2. Удаление coelomic клетки: Центрифуга кельомной жидкости в 50 мл центрифуговых труб окни при 1700 х г в течение 5 мин и перенос супернатанта в новую стерильную стеклянную колбу; Далее, собирать клетки свободной кельомной жидкости морского огурца.
    3. Инактивация компонентов дополнения: Инкубировать стерильную стеклянную колбу, содержащую коеломную жидкость из морского огурца, в водяной бане 40-50 градусов по Цельсию в течение 20-40 мин для получения дополнительных компонентов, инактивированной коеломной жидкости.
    4. Удаление микробов: Удалить бактерии и хламидиоз путем фильтрации через 0,22 мембранных фильтров. Далее, удалить микоплазмы и других мелких частиц путем фильтрации с помощью 0,1 мембранных фильтров для получения coelomic жидкости предварительного решения.
    5. Корректировка чистоты: Отрегулируйте соленость coelomic жидкости предварительного решения для обработки до 30 "(измеряется салинометр) путем добавления 20% высокой концентрации престерилизованных и фильтрованных NaCl раствор (разбавленный предварительно обработанной келомной жидкости) или DDW (двойной дистиллированной воды). Перенесите морская огуречная келомичная жидкость в стерильную бутылку, запечатайте бутылку и храните жидкость при 4 градусах Цельсия для дальнейших экспериментов.
  2. Средняя оптимизация клеточной культуры L-15 Лейбовица
    1. Взвешивание 5,05 г NaCl, 0,135 г KCl, 0,15 г CaCl2, 0,25 г Na2SOSO 4, 0,975 г MgCl2, 0,25 г глюкозы, и 6,25 мг таурина и разбавляют их в 40 мл Лейбовица L-15. Агитировать трубку на шейкере в течение 1 ч, чтобы соли растворились полностью.
    2. Добавьте 2,5 мл L-глютамина (100 мг/мл) и 500 л раствора VE (1,75 мг/л) в ранее подготовленный средний Лейбовиц L-15 и далее процедите среду через мембранные фильтры 0,22 мм.
    3. Отрегулируйте общий средний объем до 500 мл со свежим ир-15-м средством Лейбовица и 100 мл ранее приготовленной келомической жидкости; затем отрегулируйте рН до 7.6 с помощью решения NaOH. Храните процесс работы в стерильной среде. Соединение соотношение кельомной жидкости может быть 10%-50%, и 20% достаточно для культуры A. japonicus кишечных клеток.

2. Подготовка клеток кишечника

  1. Обработка кишечника морского огурца
    1. Анестезируйте здоровые морские огурцы в ледяной коробке. Вскрыть и собрать передний кишечник, затем раздел образцы ткани вертикально и удалить внутреннее содержимое.
    2. Дважды вымойте образцы тканей в фосфатном буферном сольнике (PBS) и дезинфицируете их путем погружения в раствор водиного этанола (75% по объему) не более 2 с.
    3. Вымойте образцы тканей в PBS три раза, чтобы удалить этанол и передать около 100 мг образца ткани в 2,0 мл стерильной микроцентрифуговой трубки.
  2. Коллекция ячеек
    1. Добавьте 1,5 мл предварительно оптимизированной культуры среды к морскому огурец умышленной ткани блока и фарш блок со стерилизованные хирургические ножницы, пока раствор облачно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для дополнительного упрощенного протокола добавьте 0,5 мл предварительно оптимизированной культуры среды к блоку кишечной ткани огурец и разрежьте блок стерилизованные хирургические ножницы на 1 мм3. Непосредственно переносить образцы в культурные блюда с последующими шагами инкубации.
    2. Добавьте 400 кл/ с трипсин (0,25%), смешайте раствор путем инверсии и инкубируете его в течение 5 мин при комнатной температуре; затем процедите раствор с помощью 100-мкм клеточного ситечко.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно добавлять трипсин для дисперсии клеток при лечении различных образцов тканей. Этиленедиаминететраацетическая кислота (ЭДТА) должна содержаться в растворе трипсина, чтобы уменьшить ингибирующую активность от Ca2 и Mg2 "в среде культуры.
    3. Соберите фильтрата в новую стерильную микроцентрифуговую трубку размером 2,0 мл, центрифугу при 1700 х г в течение 3 мин, отбросьте супернатант, затем отбросите гранулы в культурной среде (дополненной антибиотиками) и дважды помойте его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка свежей предварительно оптимизированной культуры среды дополнен2% пенициллина-стрептомицина раствор (10000 U/mL пенициллина и 10 мг/мл стрептомицина) и 1% гентамицин (4 мг/мл) до начала эксперимента.

3. Культура клеток

  1. Предустановка инкубатора: Предустановите инкубатор для клеточной культуры и запустите его заранее, по крайней мере 24 ч с температурой 18 градусов по Цельсию и насыщенной влажностью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кормите CO2 в инкубатор в зависимости от средних свойств клеточной культуры; CO2 не должен поставляться при использовании базового носителя L-15 Лейбовица.
  2. Культура клеток первой стадии
    1. Для подавления роста микробов и содействия пролиферации на начальном этапе клеточной культуры, добавить 10 мл пенициллина-стрептомицина раствор (10000 U/mL пенициллин и 10 мг/мл стрептомицина) и 0,5 мл гентамицина (40 мг/мл) в каждые 50 м средний предоптимизированной культуры. Кроме того, дополнить каждые 500 мл культуры среды с 0,6 мл инсулина (10 мг /мл), 100 л инсулиноподобного фактора роста (0,1 мкг / Л), и 25 мл фактора роста фибробластов (0,1 мкг /Л).
    2. Соберите клетки в 1,5 мл труб, resuspend их с помощью 200 qL указанной среды, и пипотите их в 4 см блюд.
    3. Культура клеток в инкубаторе и добавить 2,0 мл указанной среды для клеточной культивирования блюд после 6 ч. Изменение половины среды каждые 12 ч до достижения следующего этапа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ручка среднего изменения мягко, потому что клетки не прикреплены к блюдам плотно. Поли-D-лизин покрытием блюда могут быть использованы для свободного присоединения к клеткам тарелки.
  3. Культура клеток второй стадии
    1. Чтобы уменьшить негативное воздействие антибиотиков на культивированные клетки, уменьшить концентрацию указанных антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и гентамицин) в среде культуры в два раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование инсулина и факторов роста зависит от условий клеточной культуры и является необязательным.
    2. Заменить среду культуры клеток; проводить средние изменения каждые два-три дня в зависимости от плотности клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за культурными клетками ежедневно под микроскопом и записывайте условия роста.
  4. Пропуск ячеек
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прохождение и субкультуры клеток, когда плотность первичной клетки достигает 60%.
    1. Вымойте культивированные клетки дважды с помощью PBS при комнатной температуре. Добавить 200 л раствора трипсина (0,25%) к каждому блюду и вручную агитировать блюдо обеспечения всего дна покрыта. Откажитесь от раствора трипсина и инкубировать клетки в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Вымойте клетки с 1,0 мл свежей среды культуры путем pipetting и повторной приостановки клеток. Перенесите 0,5 мл клеточной подвески в новое блюдо, добавьте 1,5 мл свежей среды и инкубируют клетки при 18 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовые скребки могут быть использованы для сбора клеток, когда раствор трипсина не усваивается и отсоединяет клетки от посуды (некоторые клеточные линии слишком клеевые). Однако не проводите оба метода одновременно.
    3. Изменение среды после 12 ч и наблюдать клетки под микроскопом, чтобы оценить условия. Культура клеток для дальнейших экспериментальных анализов.

4. Индукция и обнаружение апоптоза в кишечных клетках A. japonicus

  1. Клеточная культура и лечение дексаметазоном
    1. Подготовьте клетки кишечника после ранее введенного протокола и добавьте клетки dropwise к пластине 12-наилучшим образом на томклетке 2 x 106 в наилучшим образом.
    2. После трех дней в культуре, следуя шагам "первой стадии клеточной культуры", мыть клетки три раза с PBS и заменить среду с оптимизированной среде (без антибиотиков и факторов роста).
    3. Разбавлять дексаметазон (DXMS) в культурной среде для приготовления свежих растворов 2 мкм и 200 мкм DXMS перед началом экспериментов.
    4. Добавьте решения DXMS в разных концентрациях в культивированные клетки, выращенные с одинаковым объемом культивирования среды; установить три экспериментальные группы, включая контроль (CTL), 1 мкм и 100 ММ DXMS.
  2. Hoechst окрашивания
    1. Вымойте клетки с PBS три раза после инкубации с / без DXMS для указанных периодов времени (0 ч, 24 ч и 48 ч).
    2. Добавьте 300 кЛ раствора Hoechst 33258 на скважину в 12-хорошую пластину и насигните при 18 градусах По Цельсию в течение 30 мин. Аккуратно агитировать пластину, чтобы покрыть все клетки, обеспечивая их окрашивание.
    3. Удалите раствор hoechst окрашивания и исправить клетки, добавив 300 злител 4% параформальдегида (в PBS) к каждому колодцу. Аккуратно агитировать в течение 15 мин.
      ПРЕДЕКТО: Параформалдегид умеренно токсичен при контакте или вдыхании кожи, и он обозначен как вероятный канцероген человека. Химические вытяжки дыма, вентилируемые корпуса баланса, или другие защитные меры должны быть использованы во время взвешивания и обработки параформальдегида.
    4. Вымойте фиксированные клетки три раза в PBS. Не отбрасывайте PBS после мытья, чтобы держать клетки покрыты.
  3. Анализ флуоресцентной микроскопии
    1. Включите флуоресцентное оборудование микроскопа, включая силу ртутной лампы, флуоресцентную световую энергию и ПК. Войти в учетную запись операционной системы, запустить программное обеспечение, и проверить его конфигурацию.
    2. Поместите подготовленную пластину на сцену микроскопа. Расположите образец над объективом с помощью сценического контроллера.
    3. Найти клетки, представляющие интерес под световым микроскопом, переключиться на флуоресцентную микроскопию, и захватить изображения путем настройки параметров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для наблюдения Hoechst 33258 флуоресцентный сигнал, связанный с ДНК ядер, флуоресцентная микроскопия должна проводиться с возбуждением и выбросом примерно на 352 нм и 461 нм, соответственно.

Результаты

Здесь мы установили первичную кишечную клеточную культуру A. japonicus и прооцизировали клетки. На рисунке 1 показаны круглые клетки на разных стадиях культивирования. И EdU окрашивания анализы предоставляют прямые доказательства, чтобы выявить пролиферативной активно?...

Обсуждение

Обширные исследовательские усилия были посвящены созданию клеточных линий в последние десятилетия, однако, по-прежнему трудно добиться прогресса в долгосрочной культуре клеток из морских беспозвоночных14,22. Было сообщено, что культивированные клетки и?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить профессора Наиджина Чжоу из Университета Чжэцзян за его технические рекомендации и за то, что он сделал оборудование его лаборатории доступным для использования. Эта работа была финансово поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант номера 41876154, 41606150, и 41406137) и фундаментальных научно-исследовательских фондов для чжэцзян провинциальных университетов и научно-исследовательских институтов (грант номер 2019J'00007) ].

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 μm filterMilliporeSLVV033RS
0.22 μm filterMilliporeSLGP033RB
0.25% TrypsinGenomGNM25200
100 μm filterFalcon352360
4 cm dishesExCell BioCS016-0124
4% paraformaldehyde solutionSinopharm Chemical Reagent80096618in PBS
Benchtop CentrifugesBeckmanAllegra X-30R
BeyoClick EdU-488 kitBeyotimeC0071S
CaCl2Sinopharm Chemical Reagent10005817
Constant temperature incubatorLucky RiptileHN-3
DexamethasoneSinopharm Chemical ReagentXW00500221
Electric thermostatic water bathsenxin17DK-S28
EthanolSinopharm Chemical Reagent8017696175%
Fibroblast Growth Factor(FGF)PEPROTECH100-18B
Fluorescent microscopeLeica DMI3000BDMI3000B
GaramycinSinopharm Chemical ReagentXW14054101
GlucoseSinopharm Chemical Reagent63005518
Hoechst33258 Staining solutionBeyotimeC1017
InsulinSinopharm Chemical ReagentXW1106168001
Insulin like Growth Factor(IGF)PEPROTECH100-11
KClSinopharm Chemical Reagent10016308
Leibovitz's L-15GenomGNM41300
L-glutamine (100 mg/mL)GenomGNM-21051
MgCl2Sinopharm Chemical ReagentXW77863031
Na2SO4Sinopharm Chemical Reagent10020518
NaClSinopharm Chemical Reagent10019308
NaOHSinopharm Chemical Reagent10019718
PBSSolarbioP1020pH7.2-7.4
Penicillin-StreptomycinGenomGNM15140
PH meterBanteA120
TaurineSIGMAT0625
VESeebio185791

Ссылки

  1. Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
  2. Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
  3. Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
  4. Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
  5. Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
  6. Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
  7. Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
  8. Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
  9. Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
  10. Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
  11. Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
  12. Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
  13. Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
  14. Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
  15. Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
  16. Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
  17. Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
  18. Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
  19. Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
  20. Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
  21. Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
  22. Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
  23. Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
  24. Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

155

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены