Apoptose-Induktion und Detektion in einer primärer Kultur von Seegurken-Darmzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine einfach zu handhabende Methode zur Kultur der Darmzellen der Seegurke Apostichopus japonicus und ist mit einer Vielzahl von weit verbreiteten Gewebeproben von Meeresorganismen wie Echinodermata, Mollusca und Crustacea kompatibel.

Zusammenfassung

Primärkultivierte Zellen werden in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Disziplinen als außerordentlich wichtige Instrumente zur funktionellen Bewertung biologischer Substanzen oder zur Charakterisierung spezifischer biologischer Aktivitäten eingesetzt. Aufgrund des Mangels an universell anwendbaren Zellkulturmedien und -protokollen sind gut beschriebene Zellkulturmethoden für Meeresorganismen jedoch nach wie vor begrenzt. Unterdessen behindern die häufig auftretende mikrobielle Kontamination und die polytropen Eigenschaften von wirbellosen Meereszellen die Etablierung einer wirksamen Zellkulturstrategie für marine Wirbellose weiter. Hier beschreiben wir eine einfach zu handhabende Methode zur Kultivierung von Darmzellen aus der Seegurke Apostichopus japonicus; Darüber hinaus stellen wir ein Beispiel für In-vitro-Apoptose-Induktion und Nachweis in primär kultivierten Darmzellen bereit. Darüber hinaus liefert dieses Experiment Details über die geeignete Kulturmedium- und Zellsammlungsmethode. Das beschriebene Protokoll ist mit einer Vielzahl von weit verbreiteten Gewebeproben von Meeresorganismen wie Echinodermata, Mollusca und Crustacea kompatibel und kann ausreichend Zellen für mehrere In-vitro-Experimente bereitstellen. Diese Technik würde es Forschern ermöglichen, primäre Zellkulturen von wirbellosen Meerestieren effizient zu manipulieren und die funktionelle Bewertung gezielter biologischer Materialien an Zellen zu erleichtern.

Einleitung

Das Kultivieren von Zellen unter künstlich kontrollierten Bedingungen und nicht in ihrer natürlichen Umgebung liefert einheitliche versuchsweise Materialien für biologische Studien, insbesondere für Arten, die in einer Laborumgebung nicht leicht kultiviert werden können. Meereswirbellose machen mehr als 30% aller Tierarten¹aus und liefern zahlreiche biologische Materialien für die Durchführung von Forschungsarbeiten über die Regulierungsmechanismen spezifischer biologischer Prozesse, wie Regeneration^2,3, Stressreaktion⁴und Umweltanpassung^5,6.

Die Seegurke Apostichopus japonicusist eine der am meisten untersuchten Stachelhäuleiterarten, die gemäßigte Gewässer entlang der Nordpazifikküste bewohnen. Es ist bekannt als eine kommerziell wichtige Art und marikultiviert in großem Maßstab in Ostasien, vor allem in China⁷. Zahlreiche wissenschaftliche Fragen zu A. japonicus, einschließlich der regulatorischen Mechanismen, die der Darmregeneration nach der Ausweidung⁸ und Degeneration in der Aestivation⁹, Metabolische Kontrolle^10,11und Immunantwort^12,13 unter thermischen oder pathogenen Belastungen zugrunde liegen, haben die Aufmerksamkeit der Forscher auf sich gezogen. Im Vergleich zu gut untersuchten Modelltieren ist die Grundlagenforschung, insbesondere auf zellulärer Ebene, jedoch durch technische Engpässe, wie z. B. das Fehlen fortgeschrittener Zellkulturmethoden, begrenzt.

Die Forscher haben sich viel Mühe gegeben, Zelllinien zu etablieren, aber sie haben auch viele Herausforderungen und keine Zelllinie von einem marinen Wirbellosen hat noch¹⁴etabliert. Jedoch, primäre Zellkulturen von marinen wirbellosen Tieren haben in den letzten Jahrzehnten^15,16, und sie haben eine Gelegenheit für Experimente auf zellulärer Ebene zur Verfügung gestellt. Zum Beispiel wurde das regenerierende Intesin von A. japonicus als Quelle von Zellen für langfristige Zellkulturen verwendet, die eine praktische Methode für die primäre Zellkultur von marinen Wirbellosen¹⁷zur Verfügung stellten. Dieses Protokoll kombinierte und optimierte wirbellose Zellkultur Ansätze und entwickelte eine weit geeignete Primärkulturmethode für Seegurken oder andere marine Wirbellose.

Apoptose ist ein intrinsisches Zellselbstmordprogramm, das durch verschiedene exogene und endogene Reize ausgelöst wird. Koordinierte Apoptose ist entscheidend für viele biologische Systeme^18,19, und es wurde in die Darmregression der Seegurke während der Aestivation^{beteiligt 9}. Zur Untersuchung des apoptotischen Prozesses bei Organismen von Interesse wurden eine Reihe von Methoden, einschließlich Hoechst-Färbungs- und Mikroskopie-Assays, etabliert und erfolgreich angewendet²⁰. Hier führten wir Apoptose-Induktion und -Nachweis in primär kultivierten Darmzellen von Seegurken durch, um die Verwendbarkeit von Primärzellen in biologischen Studien von wirbellosen Meerestieren zu bewerten. Dexamethason, eines der häufig verwendeten synthetischen Glukokortikosteroide²¹, wurde verwendet, um Apoptose in kultivierten Darmzellen aus Seegurken zu induzieren, und signifikante Shoechst 33258 Signal wurde erfolgreich in den gefärbten Zellen durch fluoreszierende Mikroskopie nachgewiesen.

Protokoll

1. Zellkultur Mittlere Vorbereitung

1. Coelomische Flüssigkeitszubereitung
   1. Coelomische Flüssigkeitssammlung: Unter sterilen Bedingungen eine gesunde Seegurke (Nassgewicht 85-105 g) sezieren, coelomische Flüssigkeit sammeln und in einem sterilen Glaskolben aufbewahren.
   2. Coelomische Zellentfernung: Zentrifugieren Sie die koelomische Flüssigkeit in 50 ml Zentrifugenrohren bei 1.700 x g für 5 min und übertragen Sie den Überstand in einen neuen sterilen Glaskolben; als nächstes die zellfreie koelomische Flüssigkeit der Seegurke zu sammeln.
   3. Komplementkomponenten inaktivierung: Inkubieren Sie den sterilen Glaskolben, der die coelomische Flüssigkeit der Seegurken enthält, in einem 40–50 °C-Wasserbad für 20–40 min, um Komplementkomponenten-inaktivierte coelomische Flüssigkeit zu erhalten.
   4. Mikrobenentfernung: Entfernen Sie Bakterien und Chlamydien durch Filtration durch 0,22 m Membranfilter. Als nächstes entfernen Sie Mykoplasmen und andere feine Partikel durch Filtration mit 0,1 m Membranfiltern, um eine koelomische Flüssigkeitsvorbehandlungslösung zu erhalten.
   5. Salinitätsanpassung: Stellen Sie den Salzgehalt der koelomischen Flüssigkeitsvorbehandlungslösung auf 30 % (gemessen per Salinometer) ein, indem Sie 20 % hochkonzentrierte vorsterilisierte und gefilterte NaCl-Lösung (verdünnt durch vorbehandelte coelomische Flüssigkeit) oder DDW (doppeldestilliertes Wasser) hinzufügen. Die coelomische Flüssigkeit der Seegurken in eine sterile Flasche geben, die Flasche versiegeln und bei 4 °C für weitere Experimente lagern.
2. Leibovitz es L-15 Zellkultur-Medium-Optimierung
   1. Wiegen Sie 5,05 g NaCl, 0,135 g KCl, 0,15 g CaCl₂, 0,25 g Na₂SO₄, 0,975 g MgCl₂, 0,25 g Glukose und 6,25 mg Taurin und verdünnen sie in 40 ml Leibovitz' L-15 Medium in einem 50 ml sterilen Zentrifugenrohr. Rühren Sie das Rohr auf einem Shaker für 1 h, um sicherzustellen, dass sich die Salze vollständig gelöst haben.
   2. 2,5 ml L-Glutamin (100 mg/ml) und 500 l VE-Lösung (1,75 mg/L) in zuvor hergestellte Leibovitz-Medium L-15-Mittel geben und das Medium weiter durch 0,22 m Membranfilter filtern.
   3. Das gesamte mittlere Volumen auf 500 ml mit frischem Leibovitz-Medium L-15 und mit 100 ml zuvor hergestellter koelomischer Flüssigkeit einstellen; stellen Sie den pH-Wert mit der NaOH-Lösung auf 7,6 ein. Halten Sie den Betriebsprozess in einer sterilen Umgebung. Das Compoundierungsverhältnis von coelomischer Flüssigkeit kann 10%–50% betragen, und 20% ist ausreichend für die Kultur der A. japonicus Darmzellen.

2. Darmzellvorbereitung

1. Seegurken-Darmverarbeitung
   1. Anästhetisieren Sie gesunde Seegurken in einer Eisbox. Sezieren und sammeln Sie den vorderen Darm, dann schneiden Sie die Gewebeproben vertikal und entfernen Sie den inneren Inhalt.
   2. Waschen Sie die Gewebeproben zweimal in phosphatgepufferter Saline (PBS) und desinfizieren Sie sie durch Eintauchen in eine wässrige Ethanollösung (75 Volumenprozent) nicht länger als 2 s.
   3. Waschen Sie die Gewebeproben in PBS dreimal, um Ethanol zu entfernen und übertragen Sie etwa 100 mg Gewebeprobe in ein 2,0 ml steriles Mikrozentrifugenrohr.
2. Zellsammlung
   1. 1,5 ml des voroptimierten Kulturmediums in den Darmgewebeblock der Seegurken geben und den Block mit einer sterilisierten chirurgischen Schere zerkleinern, bis die Lösung trüb ist.
      HINWEIS: Für optionalvereinfachtes Protokoll 0,5 ml voroptimiertes Kulturmedium in den Darmgewebeblock der Seegurken geben und den Block mit sterilisierter chirurgischer Schere in 1 mm³schneiden. Übertragen Sie die Proben direkt auf Kulturgerichte, gefolgt von nachfolgenden Inkubationsschritten.
   2. Fügen Sie 400 l Trypsin (0,25 %) hinzu, mischen Sie die Lösung durch Inversion und inkubieren Sie sie 5 min bei Raumtemperatur; filtern Sie dann die Lösung mit einem 100-m-Zellsieb.
      HINWEIS: Es ist optional, Trypsin für die Zelldispersion bei der Behandlung verschiedener Gewebeproben hinzuzufügen. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) sollte in Trypsin-Lösung enthalten sein, um die hemmende Aktivität von Ca²⁺ und Mg²⁺ im Kulturmedium zu reduzieren.
   3. Das Filtrat zu einem neuen sterilen 2,0 ml Mikrozentrifugenrohr, Zentrifuge bei 1.700 x g für 3 min sammeln, den Überstand entsorgen, dann das Pellet im Kulturmedium (ergänzt mit Antibiotika) wieder aufhängen und zweimal waschen.
      HINWEIS: Bereiten Sie frische spräziertes Vor-optimiertes Kulturmedium vor, ergänzt durch 2% Penicillin-Streptomycin-Lösung (10.000 U/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin) und 1% Gentamicin (4 mg/ml) vor Beginn des Experiments.

3. Zellkultur

1. Inkubator-Voreinstellung: Den Inkubator für die Zellkultur voreinstellen und im Voraus mindestens 24 h bei einer Temperatur von 18 °C und gesättigter Luftfeuchtigkeit betreiben.
   HINWEIS: Füttern Sie CO₂ in den Inkubator in Abhängigkeit von den Eigenschaften der Zellkultur medium; Bei Verwendung des Basismediums von Leibovitz es L-15 muss kein CO₂ bereitgestellt werden.
2. Zellenkultur der ersten Stufe
   1. Um das Wachstum von Mikroben zu hemmen und die Proliferation während der Anfangsphase der Zellkultur zu fördern, fügen Sie 10 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung (10.000 U/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin) und 0,5 ml Gentamicin (40 mg/ml) in alle 500 ml voroptimierter Mediumkultur ein. Darüber hinaus ergänzen Sie alle 500 ml Kulturmedium mit 0,6 ml Insulin (10 mg/ml), 100 l Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor (0,1 g/l) und 25 l Fibroblasten-Wachstumsfaktor (0,1 g/l).
   2. Sammeln Sie die Zellen in 1,5 ml-Röhren, setzen Sie sie mit 200 l des angegebenen Mediums wieder ab und pfeifen Sie sie in 4 cm große Gerichte.
   3. Die Zellen in einem Inkubator kulturieren und 2,0 ml indiziertes Medium nach 6 h in die Zellkultivierungsschalen geben. Wechseln Sie die Hälfte des Mediums alle 12 h bis zum Erreichen der nächsten Stufe.
      HINWEIS: Behandeln Sie das Medium sanft ändern, da die Zellen nicht fest an den Gerichten befestigt sind. Poly-D-Lysin-beschichtete Gerichte können zur lockeren Befestigung an den Schalenzellen verwendet werden.
3. Zellkultur der zweiten Stufe
   1. Um die Nebenwirkungen von Antibiotika auf die kultivierten Zellen zu reduzieren, reduzieren Sie die Konzentration der angezeigten Antibiotika (Penicillin, Streptomycin, und Gentamicin) im Kulturmedium um die Hälfte.
      HINWEIS: Die Verwendung von Insulin und Wachstumsfaktoren hängt von den Zellkulturbedingungen ab und ist optional.
   2. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium; je nach Zelldichte alle zwei bis drei Tage.
      HINWEIS: Beobachten Sie die kultivierten Zellen täglich unter dem Mikroskop und zeichnen Sie die Wachstumsbedingungen auf.
4. Zellpassaging
   HINWEIS: Passage und Subkultur der Zellen, wenn die primäre Zelldichte 60% erreicht.
   1. Waschen Sie die kultivierten Zellen zweimal mit PBS bei Raumtemperatur. Fügen Sie 200 L Trypsin-Lösung hinzu (0,25%) zu jedem Gericht und manuell die Schale zu agitieren, um sicherzustellen, dass der gesamte Boden bedeckt ist. Entsorgen Sie die Trypsin-Lösung und inkubieren Sie die Zellen 5 min bei Raumtemperatur.
   2. Waschen Sie die Zellen mit 1,0 ml frischem Kulturmedium, indem Sie die Zellen pipetieren und wieder aufhängen. 0,5 ml Zellsuspension auf eine neue Schale geben, 1,5 ml frisches Medium hinzufügen und die Zellen bei 18 °C bebrüten.
      HINWEIS: Zellschaber können für die Zellsammlung verwendet werden, wenn die Trypsin-Lösung Zellen nicht verdaut und von den Tellern abtrennt (einige Zelllinien sind zu klebend). Führen Sie jedoch nicht beide Methoden gleichzeitig durch.
   3. Ändern Sie das Medium nach 12 h und beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Bedingungen zu bewerten. Kultur die Zellen für weitere experimentelle Assays.

4. Apoptose-Induktion und Detektion in A. japonicus Darmzellen

1. Zellkultur und Dexamethason-Behandlung
   1. Bereiten Sie Darmzellen nach dem zuvor eingeführten Protokoll vor und fügen Sie die Zellen tropfenweise zu einer 12-Well-Platte bei einem Zellvolumen von 2 x 10⁶ pro Bohrkörper hinzu.
   2. Nach drei Tagen in der Kultur, nach den Schritten der "ersten Stufe Zellkultur", waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und ersetzen Sie das Medium durch optimiertes Medium (ohne Antibiotika und Wachstumsfaktoren).
   3. Verdünnung von Dexamethason (DXMS) im Kulturmedium, um vor Beginn der Experimente frische DXMS-Lösungen von 2 m und 200 M vorzubereiten.
   4. Fügen Sie DXMS-Lösungen in verschiedenen Konzentrationen zu kultivierten Zellen hinzu, die mit dem gleichen Volumen an Kultivierungsmedium samten werden; drei experimentelle Gruppen, einschließlich Steuerung (CTL), 1 M und 100 M DXMS.
2. Hoechst Färbung
   1. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation mit/ohne DXMS dreimal mit PBS für die angegebenen Zeiträume (0 h, 24 h und 48 h).
   2. Fügen Sie 300 L Hoechst 33258 Lösung pro Brunnen zu einer 12-Well-Platte und inkubieren bei 18 °C für 30 min. Rühren Sie die Platte sanft, um alle Zellen zu decken, die ihre Färbung gewährleisten.
   3. Entfernen Sie die Hoechst-Färbelösung und fixieren Sie die Zellen, indem Sie jedem Brunnen 300 L einer 4%igen Paraformaldehydlösung (in PBS) hinzufügen. Sanft rühren für 15 min.
      ACHTUNG: Paraformaldehyd ist mäßig giftig durch Hautkontakt oder Inhalation und wird als wahrscheinliches menschliches Karzinogen bezeichnet. Chemische Dunstabzugshauben, belüftete Waagengehäuse oder andere Schutzmaßnahmen sollten beim Wiegen und Behandeln von Paraformaldehyd verwendet werden.
   4. Waschen Sie die festen Zellen dreimal in PBS. Entsorgen Sie die PBS nicht nach dem Waschen, um die Zellen bedeckt zu halten.
3. Fluoreszierende Mikroskopie-Analyse
   1. Schalten Sie die Fluoreszenzmikroskop-Hardware ein, einschließlich quecksilberlampenleistung, Fluoreszenzlichtleistung und PC. Melden Sie sich beim Betriebssystemkonto an, starten Sie die Software, und überprüfen Sie deren Konfiguration.
   2. Legen Sie die vorbereitete Platte auf die Mikroskopstufe. Positionieren Sie die Probe mit dem Stufenregler über der Objektivlinse.
   3. Finden Sie die von Interesse befindlichen Zellen unter dem Lichtmikroskop, wechseln Sie zur Fluoreszenzmikroskopie und erfassen Sie die Bilder, indem Sie die Parameter optimieren.
      HINWEIS: Um das an die Kerne DNA gebundene Fluoreszenzsignal Hoechst 33258 zu beobachten, sollte die Fluoreszenzmikroskopie mit Anregung und Emission bei etwa 352 nm bzw. 461 nm durchgeführt werden.

Ergebnisse

Hier etablierten wir die primäre Darmzellkultur von A. japonicus und durchgängen die Zellen. Abbildung 1 zeigt runde Zellen in verschiedenen Stadien der Kultivierung. Und die EdU-Färbe-Assays liefern direkte Beweise, um die proliferative Aktivität dieser runden Zellen im späteren Stadium zu offenbaren (Abbildung 2). Wir haben auch das Protokoll leicht angepasst, wodurch Zerkleinerung von Hackfleischblöcken anstelle von filtrierten Zellen; Darüber...

Diskussion

Umfangreiche Forschungsanstrengungen wurden in den letzten Jahrzehnten zur Etablierung von Zelllinien unternommen, es ist jedoch immer noch schwierig, Fortschritte bei der langfristigen Kultur von Zellen von marinen Wirbellosen zu machen^14,22. Es wurde berichtet, dass kultivierte Zellen aus regenerierenden holothurischen Geweben über einen langen Zeitraum lebensfähig waren und eine hohe Proliferationsaktivität in bestimmten Zellen nachgewiesen werden kann

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 μm filter	Millipore	SLVV033RS
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
0.25% Trypsin	Genom	GNM25200
100 μm filter	Falcon	352360
4 cm dishes	ExCell Bio	CS016-0124
4% paraformaldehyde solution	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	in PBS
Benchtop Centrifuges	Beckman	Allegra X-30R
BeyoClick EdU-488 kit	Beyotime	C0071S
CaCl2	Sinopharm Chemical Reagent	10005817
Constant temperature incubator	Lucky Riptile	HN-3
Dexamethasone	Sinopharm Chemical Reagent	XW00500221
Electric thermostatic water bath	senxin17	DK-S28
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	80176961	75%
Fibroblast Growth Factor(FGF)	PEPROTECH	100-18B
Fluorescent microscope	Leica DMI3000B	DMI3000B
Garamycin	Sinopharm Chemical Reagent	XW14054101
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent	63005518
Hoechst33258 Staining solution	Beyotime	C1017
Insulin	Sinopharm Chemical Reagent	XW1106168001
Insulin like Growth Factor(IGF)	PEPROTECH	100-11
KCl	Sinopharm Chemical Reagent	10016308
Leibovitz's L-15	Genom	GNM41300
L-glutamine (100 mg/mL)	Genom	GNM-21051
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent	XW77863031
Na2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10020518
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent	10019718
PBS	Solarbio	P1020	pH7.2-7.4
Penicillin-Streptomycin	Genom	GNM15140
PH meter	Bante	A120
Taurine	SIGMA	T0625
VE	Seebio	185791