해삼 장 세포의 1 차적인 배양에 있는 세포자멸 유도 그리고 탐지

요약

이 프로토콜은 해삼 Apostichopus japonicus에서 장 세포를 배양하는 다루기 쉬운 방법을 제공하며 에키노더마타, 연체 동물 및 갑각류를 포함한 해양 생물에서 널리 이용 가능한 다양한 조직 샘플과 호환됩니다.

초록

1 차 배양 세포는 생물학적 물질의 기능적 평가 또는 특정 생물학적 활동의 특성화를 위한 매우 중요한 도구로서 다양한 과학 분야에서 사용된다. 그러나, 보편적으로 적용 가능한 세포 배양 배지 및 프로토콜의 부족으로 인해, 해양 생물에 대한 잘 설명된 세포 배양 방법은 여전히 제한적이다. 한편, 해양 무척추 동물 세포의 일반적으로 발생하는 미생물 오염 및 다색 특성은 해양 무척추 동물에 대한 효과적인 세포 배양 전략의 수립을 더욱 방해합니다. 여기서, 우리는 해삼 Apostichopus japonicus에서장 세포를 배양하기위한 다루기 쉬운 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 1 차적인 배양된 장 세포에 있는 시험관 내 apoptosis 유도 그리고 탐지의 보기를 제공합니다. 더욱이, 본 실험은 적절한 배양 배지 및 세포 수집 방법에 대한 세부정보를 제공한다. 기재된 프로토콜은 에키노더마타, 연체루스카 및 갑각류를 포함한 해양 생물로부터 널리 이용 가능한 다양한 조직 샘플과 호환되며, 여러 체외 실험 응용 분야에 충분한 세포를 제공할 수 있다. 이 기술은 연구원이 해양 무척추 동물에서 1 차적인 세포 배양을 능률적으로 조작하고 세포에 표적으로 한 생물학 물질의 기능적인 평가를 촉진하기 위하여 가능하게 할 것입니다.

서문

인위적으로 통제된 조건하에서 세포를 배양하는 것은 자연 환경이 아니라 생물학적 연구를 위한 균일한 실험 물질을 제공하며, 특히 실험실 환경에서 쉽게 배양할 수 없는 종에 대해 균일한 실험 물질을 제공합니다. 해양 무척추 동물은 모든 동물 종의 30 % 이상을^{차지하며,}재생^2,3,스트레스 반응 4 및 환경 적응^5,6과같은 특정 생물학적 과정의 규제 메커니즘에 대한 연구를 수행하기위한 수많은 생물학적 물질을 제공합니다.

해삼, 아포스코푸스 japonicus,북태평양 해안을 따라 온대 바다를 서식하는 가장 연구 된 echinoderm 종 중 하나입니다. 그것은 잘 상업적으로 중요한 종으로 알려져 있으며, 특히 중국^7,동아시아에서 대규모로 마리 컬쳐. A. japonicus에관한 수많은 과학적 질문, 억제 후 장 재생 기본 규제^{메커니즘을} 포함 하 여 8 및 aestivation에서 변성^9,대사 제어^10,11,그리고 면역 반응^12,13 열 또는 병원 성 스트레스 에서, 연구원의 관심을 끌고 있다. 그러나, 잘 연구된 모형 동물과 비교해, 기초 연구, 특히 세포 수준에, 고급 세포 배양 방법의 부족과 같은 기술적인 병목 현상에 의해 제한됩니다.

연구원은 세포주 를 확립하기 위하여 많은 노력을 바쳤습니다, 그러나 또한 많은 도전을 직면하고 어떤 해양 무척추 동물에게서 세포주도 아직^{14설치되지}않았습니다. 그러나, 해양 무척추 동물에서 1 차적인 세포 배양은 지난 수십 년 동안^15,16에서진보하고, 그(것)들은 세포 수준에 실험을 위한 기회를 제공했습니다. 예를 들어, A. japonicus로부터의 재생 인테신은 해양 무척추^{동물(17)의}1차 세포 배양에 대한 실용적인 방법을 제공하는 장기 세포 배양용 세포의 공급원으로 활용되고 있다. 이 프로토콜은 결합및 최적화된 무척추동물 세포 배양 접근법과 해삼 또는 다른 해양 무척추동물에 대한 널리 적합한 1차 배양 방법을 개발하였다.

세포 사멸은 다양한 외인성 및 내인성 자극에 의해 유발되는 본질적인 세포 자살 프로그램입니다. 조율된 아포토시스는 많은 생물학적 계에^18,19,및 수거 9 시 동안 해삼의 장 회귀에 연루되어^있다. 관심있는 유기체에서 세포 사멸 과정을 조사하기 위해 Hoechst 염색 및 현미경 분석법을 포함한 일련의 방법이²⁰개 확립되고 성공적으로 적용되었습니다. 여기에서, 우리는 해양 무척추 동물의 생물학 연구결과에 있는 1 차적인 세포의 유용성을 평가하기 위하여 해삼의 1 차배양된 장세포에서 apoptosis 유도 그리고 탐지를 실시했습니다. 일반적으로 사용되는 합성 글루코코르티코스테로이드(21) 중하나인 덱사메타손은 해삼에서 배양된 장세포에서 세포사멸을 유도하는데 사용되었으며, 현저한 Hoechst 33258 신호는 형광 현미경검사법에 의해 염색된 세포에서 성공적으로 검출되었다.

프로토콜

1. 세포 배양 배지 준비

1. Coelomic 유체 준비
   1. Coelomic 유체 수집: 멸균 조건하에서 건강한 해삼 (85-105g의 젖은 무게)을 해부하고, coelomic 액체를 수집하고 멸균 유리 플라스크에 보관하십시오.
   2. Coelomic 세포 제거: 50 mL 원심분리기 튜브에서 50 mL 원심분리기 튜브에서 5 분 동안 1,700 x g의 coelomic 유체를 원심 분리하고 상구체를 새로운 멸균 유리 플라스크로 옮니다. 다음으로, 해삼의 무세포 액을 수집합니다.
   3. 구성 요소 불활성화 보완: 해삼 coelomic 유체를 포함하는 멸균 유리 플라스크를 20-40 분 동안 40-50 °C 수조에서 배양하여 성분 불활성화 된 coelomic 유체를 보완합니다.
   4. 미생물 제거: 0.22 μm 멤브레인 필터를 통해 여과하여 박테리아와 클라미디아를 제거합니다. 다음으로, 0.1 μm 멤브레인 필터를 사용하여 여과하여 마이코플라즈마 및 기타 미세 입자를 제거하여 coelomic 유체 전처리 용액을 얻습니다.
   5. 살린 조정: 20% 고농도 의 전멸 및 여과 NaCl 용액 (전처리 된 coelomic 유체에 의해 희석) 또는 DDW (이중 증류수)를 추가하여 coelomic 유체 전처리 용액의 염도를 30 °F (살리노미터로 측정)로 조정하십시오. 해삼 coelomic 유체를 멸균 병으로 옮기고 병을 밀봉하고 유체를 4 °C에서 저장하여 추가 실험을 하십시오.
2. 라이보비츠의 L-15 세포 배양 배지 최적화
   1. NaCl 의 5.05 g, KCl0.135 g, CaCl₂0.15 g, Na₂SO_4,MgCl₂0.975 g, 포도당 0.25 g, 타우린 6.25 mg을 50 mmmmmm에서 라이보비츠 의 L-15 배지 40 mL에서 희석합니다. 소금이 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 셰이커의 튜브를 1 시간 동안 교반하십시오.
   2. 이전에 준비된 Leibovitz의 L-15 배지에 2.5 mL의 L-글루타민(100 mg/mL)과 500 μL의 VE 용액(1.75 mg/L)을 넣고 0.22 μm 멤브레인 필터를 통해 배지를 추가로 걸으세요.
   3. 신선한 Leibovitz의 L-15 배지와 이전에 준비된 100 mL의 coelomic 유체로 총 중간 부피를 500 mL로 조정하십시오. 다음으로 NaOH 용액을 사용하여 pH를 7.6으로 조정합니다. 작동 프로세스를 멸균 환경에서 유지합니다. coelomic 액체의 배합 비율은 10%-50%일 수 있고, 20%는 A. japonicus 장 세포 배양에 충분합니다.

2. 장 세포 준비

1. 해삼 장 처리
   1. 얼음 상자에 건강한 해삼을 마취. 전방 창자를 해부하고 수집한 다음 조직 샘플을 수직으로 절제하고 내부 내용물제거합니다.
   2. 인산완충식염수(PBS)로 조직 샘플을 2회 세척하고 수성 에탄올 용액(75% 부피)에 침지하여 2s 이상소독합니다.
   3. 에탄올을 제거하고 2.0 mL 멸균 미세 원심 분리 튜브로 조직 샘플의 약 100 mg을 전송하기 위해 PBS에서 세 번 조직 샘플을 세척.
2. 셀 수집
   1. 해삼 장 조직 블록에 미리 최적화된 배양 배지 1.5 mL을 추가하고 용액이 흐릴 때까지 멸균 된 수술 용가로 블록을 다진다.
      참고 : 선택적 단순화 된 프로토콜의 경우, 해삼 장 조직 블록에 미리 최적화 된 배양 배지 0.5 mL를 추가하고 멸균 수술 가위로 블록을 1mm^3으로잘라냅니다. 직접 배양 접시에 샘플을 전송하고 후속 배양 단계.
   2. 트립신 400 μL (0.25%)을 추가하고, 반전으로 용액을 혼합하고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션한 다음 100 μm 셀 스트레이너를 사용하여 용액을 필터링합니다.
      참고: 다른 조직 샘플을 치료할 때 세포 분산을 위한 트립신을 추가하는 것은 선택 사항입니다. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)은 배양 배지에서^Ca2+ 및 Mg^{2+로부터의} 억제 활성을 감소시키기 위해 트립신 용액에 포함되어야 한다.
   3. 여과액을 새로운 멸균 2.0 mL 마이크로 원심분리기 튜브로 수집하고, 1,700 x g에서 3 분 동안 원심 분리기를 넣고 상구체를 버린 다음 배양 배지에서 펠릿을 다시 일시 중단 (항생제보충제)하고 두 번 씻으십시오.
      참고: 실험 시작 전에 2% 페니실린-스트렙토마이신 용액(10,000 U/mL 페니실린 및 10 mg/mL 스트렙토마이신)과 1% 젠타미신(4 mg/mL)으로 보충된 신선한 미리 최적화된 배양 배지를 준비합니다.

3. 세포 배양

1. 인큐베이터 사전 설정: 세포 배양을 위한 인큐베이터를 미리 설정하고 18°C 및 포화 습도의 온도로 적어도 24시간 동안 미리 실행한다.
   참고: 세포 배양 배지 특성에 따라_CO2를 인큐베이터내로 공급; Leibovitz의 L-15의 기본 매체를 사용할 때는_CO2를 공급할 필요가 없습니다.
2. 1단계 세포 배양
   1. 미생물의 성장을 억제하고 세포 배양의 초기 단계에서 증식을 촉진하기 위해 페니실린-스트렙토마이신 용액 10 mL(10,000 U/mL 페니실린 및 10 mg/mL 스트렙토마이신)과 0.5 mL의 젠타미신(40 mg/mL)을 모든 50 mL의 배양에 추가합니다. 또한, 인슐린 0.6 mL (10 mg/mL), 인슐린 과 같은 성장 인자 (0.1 μg / μL) 및 섬유 아세포 성장 인자 25 μL (0.1 μg / μL)으로 모든 500 mL 배양 매체를 보충하십시오.
   2. 1.5 mL 튜브로 세포를 수집, 표시된 매체의 200 μL을 사용하여 그들을 다시 중단하고, φ 4cm 접시로 피펫.
   3. 인큐베이터에서 세포를 배양하고 6h 후 세포 배양 접시에 표시된 배지의 2.0 mL를 추가합니다. 다음 단계에 도달할 때까지 매질의 절반을 매 12시간마다 변경한다.
      참고 : 세포가 접시에 단단히 부착되지 않았기 때문에 매질 교체를 부드럽게 처리하십시오. 폴리-D-리신 코팅 접시는 접시 세포에 느슨하게 부착하는 데 사용할 수 있습니다.
3. 2단계 세포 배양
   1. 배양 된 세포에 대한 항생제의 부작용을 줄이기 위해 배양 배지에서 표시된 항생제 (페니실린, 스트렙토 마이신 및 겐타미신)의 농도를 절반으로 줄입니다.
      참고: 인슐린과 성장 인자의 사용은 세포 배양 조건에 따라 달라 지 고 선택 사항.
   2. 세포 배양 배지를 대체; 세포 밀도에 따라 2~3일마다 배지 변경을 수행합니다.
      참고 : 현미경으로 매일 배양 된 세포를 관찰하고 성장 조건을 기록하십시오.
4. 셀 패시징
   참고: 1차 세포 밀도가 60%에 도달할 때 세포를 통로 및 배양한다.
   1. 실온에서 PBS를 사용하여 배양된 세포를 두 번 세척합니다. 트립신 용액 200 μL 추가 (0.25%) 각 접시에 수동으로 반기하여 바닥 전체가 덮여 있는지 확인합니다. 트립신 용액을 버리고 실온에서 5 분 동안 세포를 배양하십시오.
   2. 세포를 파이펫팅하고 다시 중단시킴으로써 신선한 배양 배지의 1.0 mL로 세포를 세척한다. 0.5 mL의 세포 현탁액을 새로운 접시에 옮기고 1.5 mL의 신선한 배지를 추가하고 18 °C에서 세포를 배양하십시오.
      참고 : 세포 스크레이퍼는 트립신 용액이 접시에서 세포를 소화하고 분리하지 못할 때 세포 수집에 사용할 수 있습니다 (일부 세포주가 너무 접착제입니다). 그러나 두 방법을 동시에 수행하지 마십시오.
   3. 12 시간 후에 배지를 변경하고 상태를 평가하기 위해 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 추가 실험 적인 실험 적인 실험에 대 한 세포를 배양.

4. A. japonicus 장 세포에서 세포 사멸 유도 및 검출

1. 세포 배양 및 덱사메타손 치료
   1. 이전에 도입된 프로토콜에 따라 장 세포를 준비하고 웰당 2 x 10^6의 세포 부피에서 12 웰 플레이트에 세포를 드롭와이즈로 추가합니다.
   2. 배양 3일 후, "1단계 세포 배양"의 단계를 따라, 세포를 PBS로 3회 세척하고 배지를 최적화된 배지로 대체한다(항생제 및 성장 인자 제외).
   3. 배양 배지에서 덱사메타손(DXMS)을 희석하여 실험을 시작하기 전에 신선한 2 μM 및 200 μM DXMS 솔루션을 준비하였다.
   4. 배양 배지의 동일한 부피로 성장 배양 된 세포에 다른 농도의 DXMS 솔루션을 추가; 대조군(CTL), 1 μM 및 100 μM DXMS를 포함한 3개의 실험군을 설정한다.
2. Hoechst 염색
   1. 표시된 기간 (0 h, 24 h 및 48 h)에 대한 DXMS없이 배양 후 PBS로 세포를 세 번 씻으하십시오.
   2. Hoechst 33258 용액의 300 μL을 잘 12 웰 플레이트에 넣고 18 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
   3. Hoechst 염색 용액을 제거하고 각 웰에 4% 파라포름알데히드 용액(PBS)의 300 μL을 추가하여 세포를 고정시다. 15분 동안 부드럽게 교반합니다.
      주의 사항: 파라포름알데히드는 피부 접촉 이나 흡입에 의해 적당히 독성, 그리고 그것은 가능한 인간의 발암 물질로 지정 됩니다. 화학 연기 후드, 환기 저울 인클로저 또는 기타 보호 조치는 파라 포름 알데히드의 계량 및 취급 중에 사용해야합니다.
   4. 고정 된 세포를 PBS에서 세 번 세척하십시오. 세포를 덮기 위해 세척 후 PBS를 버리지 마십시오.
3. 형광 현미경 분석
   1. 수은 램프 전원, 형광광 전력 및 PC를 포함한 형광 현미경 하드웨어를 켭니다. 운영 체제 계정에 로그인하고 소프트웨어를 실행하고 구성을 확인합니다.
   2. 준비된 플레이트를 현미경 단계에 놓습니다. 스테이지 컨트롤러를 사용하여 대물 렌즈 위에 샘플을 배치합니다.
   3. 광 현미경의 밑에 관심 있는 세포를 찾아내고, 형광 현미경 검사법으로 전환하고, 매개변수를 조정해서 심상을 붙잡습니다.
      참고: 핵 DNA에 결합된 Hoechst 33258 형광 신호를 관찰하기 위하여는, 형광 현미경 검사법은 대략 352 nm 및 461 nm에서 각각 여기와 방출로 실행되어야 합니다.

결과

여기에서, 우리는 A. japonicus의 1 차적인 장 세포 배양을 설치하고 세포를 통과했습니다. 그림 1은 배양의 상이한 단계에서 둥근 세포를 나타낸다. 그리고 EdU 염색 검정은 나중 단계에서 이들 둥근 세포의 증식 활성을 밝히기 위한 직접적인 증거를제공한다(도 2). 우리는 또한 약간 프로토콜을 조정, 대신 여과 된 세포의 다진 조직 블록을 배양; 또?...

토론

광범위한 연구 노력은 지난 수십 년 동안 세포주 확립에 전념해 왔지만, 해양 무척추 동물^{14,22로부터}세포의 장기 배양에 진전을 이루기는 여전히 어렵다. 홀로투리안 조직을 재생시키는 것으로부터 배양된 세포는 장기간 생존가능하고 증식의 높은 활성이 특이적^{세포(17,23)에서}검출될 수 있다고 보고되었다. ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 μm filter	Millipore	SLVV033RS
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
0.25% Trypsin	Genom	GNM25200
100 μm filter	Falcon	352360
4 cm dishes	ExCell Bio	CS016-0124
4% paraformaldehyde solution	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	in PBS
Benchtop Centrifuges	Beckman	Allegra X-30R
BeyoClick EdU-488 kit	Beyotime	C0071S
CaCl2	Sinopharm Chemical Reagent	10005817
Constant temperature incubator	Lucky Riptile	HN-3
Dexamethasone	Sinopharm Chemical Reagent	XW00500221
Electric thermostatic water bath	senxin17	DK-S28
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	80176961	75%
Fibroblast Growth Factor(FGF)	PEPROTECH	100-18B
Fluorescent microscope	Leica DMI3000B	DMI3000B
Garamycin	Sinopharm Chemical Reagent	XW14054101
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent	63005518
Hoechst33258 Staining solution	Beyotime	C1017
Insulin	Sinopharm Chemical Reagent	XW1106168001
Insulin like Growth Factor(IGF)	PEPROTECH	100-11
KCl	Sinopharm Chemical Reagent	10016308
Leibovitz's L-15	Genom	GNM41300
L-glutamine (100 mg/mL)	Genom	GNM-21051
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent	XW77863031
Na2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10020518
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent	10019718
PBS	Solarbio	P1020	pH7.2-7.4
Penicillin-Streptomycin	Genom	GNM15140
PH meter	Bante	A120
Taurine	SIGMA	T0625
VE	Seebio	185791