Induzione e rilevamento dell'apoptosi in una cultura primaria delle cellule intestinali del cetriolo marino

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un metodo facile da gestire per la coltura delle cellule intestinali dal cetriolo di mare Apostichopus japonicus japonicus ed è compatibile con una varietà di campioni di tessuto ampiamente disponibili da organismi marini tra cui Echinodermata, Mollusca e Crustacea.

Abstract

Le cellule coltivate primarie sono utilizzate in una varietà di discipline scientifiche come strumenti eccezionalmente importanti per la valutazione funzionale di sostanze biologiche o la caratterizzazione di specifiche attività biologiche. Tuttavia, a causa della mancanza di mezzi e protocolli di coltura cellulare universalmente applicabili, i metodi di coltura cellulare ben descritti per gli organismi marini sono ancora limitati. Nel frattempo, la contaminazione microbica e le proprietà politropiche comunemente presenti delle cellule invertebrate marine ostacolano ulteriormente l'istituzione di una strategia di coltura cellulare efficace per gli invertebrati marini. Qui, descriviamo un metodo facile da gestire per la coltura di cellule intestinali dal cetriolo di mare Apostichopus japonicus; inoltre, forniamo un esempio di induzione e rilevamento di apoptosi in vitro nelle cellule intestinali coltivate primarie. Inoltre, questo esperimento fornisce dettagli sul metodo di raccolta delle cellule e del mezzo di coltura appropriato. Il protocollo descritto è compatibile con una varietà di campioni di tessuto ampiamente disponibili da organismi marini, tra cui Echinodermata, Mollusca e Crustacea, e può fornire cellule sufficienti per molteplici applicazioni sperimentali in vitro. Questa tecnica consentirebbe ai ricercatori di manipolare in modo efficiente le colture cellulari primarie dagli invertebrati marini e di facilitare la valutazione funzionale di materiali biologici mirati sulle cellule.

Introduzione

Le cellule di coltura in condizioni controllate artificialmente, e non nel loro ambiente naturale, forniscono materiali sperimentali uniformi per studi biologici, in particolare per specie che non possono essere facilmente coltivate in un ambiente di laboratorio. Gli invertebrati marini rappresentano oltre il 30% di tutte le specie animali¹e forniscono numerosi materiali biologici per intraprendere ricerche sui meccanismi normativi di processi biologici specifici, come la rigenerazione^2,3, la risposta allo stress⁴e l'adattamento ambientale^5,6.

Il cetriolo di mare, Apostichopus japonicus, è una delle specie di echinoderm più studiate che abitano acque temperate lungo la costa del Pacifico settentrionale. E 'ben noto come una specie commercialmente importante e maricultured su larga scala in Asia orientale, soprattutto in Cina⁷. Numerose domande scientifiche riguardanti A. japonicus, tra cui i meccanismi regolatori alla base della rigenerazione intestinale dopo l'eviscerazione⁸ e la degenerazione in un'aestivazione⁹, controllo metabolico^10,11, e risposta immunitaria^12,13 sotto stress termico o patogeno, hanno attirato l'attenzione dei ricercatori. Tuttavia, rispetto agli animali modello ben studiati, la ricerca di base, soprattutto a livello cellulare, è limitata da colli di bottiglia tecnici, come la mancanza di metodi avanzati di coltura cellulare.

I ricercatori hanno dedicato molti sforzi per stabilire le linee cellulari, ma hanno anche affrontato molte sfide e nessuna linea cellulare da qualsiasi invertebrato marino è stata stabilita ancora¹⁴. Tuttavia, le colture cellulari primarie da invertebrati marini sono progredite negli ultimi decenni^15,16, e hanno fornito un'opportunità per la sperimentazione a livello cellulare. Ad esempio, l'intesina rigenerante da A. japonicus è stata utilizzata come fonte di cellule per colture cellulari a lungo termine che ha fornito un metodo pratico per la coltura cellulare primaria degli invertebrati marini¹⁷. Questo protocollo combinava e ottimizzato gli approcci di coltura delle cellule invertebrate e sviluppava un metodo di coltura primaria ampiamente adatto per cetrioli di mare o altri invertebrati marini.

L'apoptosi è un programma di suicidio cellulare intrinseco innescato da vari stimoli esogeni ed endogeni. L'apoptosi coordinata è fondamentale per molti sistemi biologici^18,19, ed è stata implicata nella regressione intestinale del cetriolo di mare durante l'acentratura⁹. Per studiare il processo apoptotico negli organismi di interesse, sono stati stabiliti e applicati con successo²⁰metodi, tra cui la colorazione di Hoechst e i saggi di microscopia. Qui, abbiamo condotto l'induzione e il rilevamento dell'apoptosi nelle cellule intestinali coltivate primarie del cetriolo marino per valutare l'usabilità delle cellule primarie negli studi biologici degli invertebrati marini. Dexamethasone, uno dei glucocorticosteroidi sintetici comunemente usati²¹, è stato utilizzato per indurre l'apoptosi nelle cellule intestinali coltivate dal cetriolo marino, e significativo segnale Hoechst 33258 è stato rilevato con successo nelle cellule colorate dalla microscopia fluorescente.

Protocollo

1. Preparazione media coltura cellulare

1. Preparazione dei fluidi coelomici
   1. Raccolta di fluidi coelomici: In condizioni sterili, sezionare un cetriolo di mare sano (peso umido di 85-105 g), raccogliere il liquido coelomico e conservarlo in un pallone di vetro sterile.
   2. Rimozione delle cellule coelomiche: Centrifugare il fluido coelomico in tubi di centrifuga 50 mL a 1.700 x g per 5 min e trasferire il supernatante in un nuovo flacone di vetro sterile; successivamente, raccogliere il fluido coelomico senza cellule del cetriolo di mare.
   3. Inattivazione dei componenti del complemento: Incubare il pallone di vetro sterile, contenente il liquido coelomico del cetriolo di mare, in un bagno d'acqua di 40-50 gradi centigradi per 20-40 min per ottenere il liquido coelomico inattivato dai componenti di complemento.
   4. Rimozione del microbo: Rimuovere batteri e clamidia filtrando attraverso filtri di membrana 0,22 m. Successivamente, rimuovere il micoplasma e altre particelle fini mediante filtrazione utilizzando filtri di membrana di 0,1 m per ottenere una soluzione di pretrattamento dei fluidi coelomici.
   5. Regolazione della Salinità: Regolare la salinità della soluzione di pretrattamento del fluido coelomico a 30 o più (misurato per salinometro) aggiungendo il 20% di soluzione NaCl presterilizzata e filtrata ad alta concentrazione (diluita da liquido coelomico pretrattato) o DDW (acqua doppia distillata). Trasferire il liquido coelomico cetriolo di mare in una bottiglia sterile, sigillare la bottiglia e conservare il fluido a 4 gradi centigradi per ulteriori esperimenti.
2. Ottimizzazione media di coltura cellulare L-15 di Leibovitz
   1. Pesare 5,05 g di NaCl, 0,135 g di KCl, 0,15 g di CaCl₂, 0,25 g di Na₂SO₄, 0,975 g di MgCl₂, 0,25 g di glucosio e 6,25 mg di taurina e diluirli in 40 mL del mezzo L-15 di Leibovitz in un tubo sterile da 50 mL. Agitare il tubo su uno shaker per 1 h per assicurarsi che i sali si siano sciolti completamente.
   2. Aggiungere 2,5 mL di L-glutamina (100 mg/mL) e 500 l di soluzione VE (1,75 mg/L) nel mezzo L-15 di Leibovitz precedentemente preparato e filtrare ulteriormente il mezzo attraverso filtri a membrana da 0,22 m.
   3. Regolare il volume medio totale a 500 mL con il fresco mezzo L-15 di Leibovitz e con 100 mL di liquido coelomico precedentemente preparato; quindi, regolare il pH a 7.6 utilizzando la soluzione NaOH. Mantenere il processo operativo in un ambiente sterile. Il rapporto di compounding del fluido coelomico può essere del 10%–50% e il 20% è sufficiente per la coltura di cellule intestinali ajaponicus.

2. Preparazione delle cellule intestinali

1. Lavorazione dell'intestino del cetriolo di mare
   1. Anatescize cetrioli di mare sani in una scatola di ghiaccio. Dissezionare e raccogliere l'intestino anteriore, quindi sezionare i campioni di tessuto verticalmente e rimuovere il contenuto interno.
   2. Lavare due volte i campioni di tessuto in fosfato con buffer salina (PBS) e disinfettarli per immersione in una soluzione di etanolo acquosa (75% in volume) per non più di 2 s.
   3. Lavare i campioni di tessuto in PBS tre volte per rimuovere l'etanolo e trasferire circa 100 mg di campione di tessuto in un tubo di microcentrifuga sterile da 2,0 mL.
2. Raccolta di celle
   1. Aggiungere 1,5 mL del mezzo di coltura pre-ottimizzato al blocco di tessuto intestinale cetriolo di mare e tritare il blocco con forbici chirurgiche sterilizzate fino a quando la soluzione è torbida.
      NOTA: Per un protocollo semplificato opzionale, aggiungere 0,5 mL di mezzo di coltura pre-ottimizzato al blocco di tessuto intestinale cetriolo marino e tagliare il blocco con forbici chirurgiche sterilizzate in 1 mm³. Trasferire direttamente i campioni ai piatti di coltura seguiti da successive fasi di incubazione.
   2. Aggiungere 400 l di orpina (0,25%), mescolare la soluzione per inversione e incubarla per 5 min a temperatura ambiente; quindi filtrare la soluzione utilizzando un colino cellulare di 100 m.
      NOTA: È facoltativo aggiungere la trypsina per la dispersione cellulare durante il trattamento di diversi campioni di tessuto. L'acido etilenediaminetraace (EDTA) deve essere contenuto in soluzione di trypsin per ridurre l'attività inibitoria da Ca² e Mg² in mezzo di coltura.
   3. Raccogliere il filtrato in un nuovo tubo sterile di microcentrifuga da 2,0 mL, centrifugare a 1.700 x g per 3 min, scartare il supernatante, quindi risospendere il pellet in mezzo di coltura (integrato con antibiotici) e lavarlo due volte.
      NOTA: Preparare un nuovo mezzo di coltura pre-ottimizzato integrato con una soluzione penicillina-streptomica del 2% (10.000 U/mL penicillina e 10 mg/mL streptomycin) e 1% gentamicin (4 mg/mL) prima dell'inizio dell'esperimento.

3. Cultura cellulare

1. Preimpostazione dell'incubatore: Preimpostare l'incubatrice per la coltura cellulare e farla funzionare in anticipo per almeno 24 h con una temperatura di 18 gradi centigradi e umidità satura.
   NOTA: Alimentare CO₂ nell'incubatrice a seconda delle proprietà medie di coltura cellulare; non deve essere fornito alcun CO₂ quando si utilizza il mezzo di base dell'L-15 di Leibovitz.
2. Prima fase della coltura cellulare
   1. Per inibire la crescita dei microbi e promuovere la proliferazione durante la fase iniziale della coltura cellulare, aggiungere 10 mL di soluzione penicillina-streptomicina (10.000 U/mL penicillina e 10 mg/mL streptomycin) e 0,5 mL di gentamicina (40 mg/mL) in ogni 500 mL di coltura pre-ottimizzata. Inoltre, integrare ogni 500 mL di coltura media con 0,6 mL di insulina (10 mg/mL), 100 l di fattore di crescita simile all'insulina (0,1 g/l) e 25 -L di fattore di crescita fibroblasta (0,1 g/l).
   2. Raccogliere le cellule in tubi da 1,5 mL, risospenderle usando 200 gradi l di mezzo indicato e inserirle in piatti da 4 cm.
   3. Coltivare le cellule in un'incubatrice e aggiungere 2,0 mL di mezzo indicato alla cellula coltiva piatti dopo 6 h. Cambiare la metà del mezzo ogni 12 h fino a raggiungere la fase successiva.
      NOTA: Gestire il mezzo cambiare delicatamente, perché le celle non sono attaccate ai piatti strettamente. I piatti rivestiti in polisisina possono essere utilizzati per attaccare liberamente alle celle del piatto.
3. Seconda fase della coltura cellulare
   1. Per ridurre gli effetti negativi degli antibiotici alle cellule coltivate, ridurre di mezza la concentrazione di antibiotici indicati (penicillina, streptomicina e gentamicina).
      NOTA: L'utilizzo di insulina e fattori di crescita dipende dalle condizioni di coltura cellulare ed è facoltativo.
   2. Sostituire il mezzo di coltura cellulare; effettuare variazioni medie ogni due o tre giorni a seconda della densità cellulare.
      NOTA: Osservare quotidianamente le cellule coltivate al microscopio e registrare le condizioni di crescita.
4. Passaggio cellulare
   NOTA: Passaggio e sottocoltura delle cellule, quando la densità cellulare primaria raggiunge il 60%.
   1. Lavare le cellule coltivate due volte utilizzando PBS a temperatura ambiente. Aggiungere 200 l di soluzione di prova (0,25%) ad ogni piatto e agitare manualmente il piatto assicurandosi che l'intero fondo sia coperto. Eliminare la soluzione di riapina e incubare le cellule per 5 min a temperatura ambiente.
   2. Lavare le cellule con 1,0 mL di mezzo di coltura fresca pipettando e rimettendo le cellule. Trasferire 0,5 mL di sospensione cellulare in un nuovo piatto, aggiungere 1,5 mL di mezzo fresco e incubare le cellule a 18 gradi centigradi.
      NOTA: i raschiatori cellulari possono essere utilizzati per la raccolta delle celle quando la soluzione trypsin non riesce a digerire e staccare le cellule dai piatti (alcune linee cellulari sono troppo adesive). Tuttavia, non eseguire entrambi i metodi contemporaneamente.
   3. Cambiare il mezzo dopo 12 h e osservare le cellule al microscopio per valutare le condizioni. Coltura le cellule per ulteriori saggi sperimentali.

4. Induzione e rilevamento di apoptosi nelle cellule intestinali japonicus

1. Coltura cellulare e trattamento dexamethasone
   1. Preparare le cellule intestinali seguendo il protocollo introdotto in precedenza e aggiungere le cellule dropwise a una piastra di 12 pozzetti ad un volume cellulare di 2 x 10⁶ per bene.
   2. Dopo tre giorni di coltura, seguendo le fasi della "coltura cellulare del primo stadio", lavare le cellule tre volte con PBS e sostituire il mezzo con un mezzo ottimizzato (senza antibiotici e fattori di crescita).
   3. Dilute dexamethasone (DXMS) nel mezzo di coltura per preparare soluzioni fresche da 2 e 200 M DXMS prima di iniziare gli esperimenti.
   4. Aggiungere soluzioni DXMS in concentrazioni diverse alle cellule coltivate con lo stesso volume di mezzo di coltura; impostare tre gruppi sperimentali, tra cui il controllo (CTL), 1 M e 100 DXMS.
2. Colorazione Hoechst
   1. Lavare le cellule con PBS tre volte dopo l'incubazione con/senza DXMS per i periodi di tempo indicati (0 h, 24 h e 48 h).
   2. Aggiungere 300 luna di Hoechst 33258 soluzione per pozzo a una piastra di 12 pozzetti e incubare a 18 gradi centigradi per 30 m. Agitare delicatamente la piastra per coprire tutte le cellule garantendo la loro colorazione.
   3. Rimuovere la soluzione di colorazione Hoechst e fissare le cellule aggiungendo 300 l di una soluzione di paraformaldeide del 4% (in PBS) a ogni pozzo. Agitare delicatamente per 15 min.
      ATTENZIONE: La paraformaldeide è moderatamente tossica per contatto della pelle o inalazione, ed è designata come probabile cancerogeno umano. Cappe di fumi chimici, recinti di bilanciamento ventilato, o altre misure protettive devono essere utilizzati durante la pesata e la manipolazione della paraformaldeide.
   4. Lavare le celle fisse tre volte in PBS. Non scartare il PBS dopo il lavaggio per mantenere le cellule coperte.
3. Analisi microscopia fluorescente
   1. Accendere l'hardware del microscopio fluorescente, tra cui la potenza della lampada a mercurio, la potenza della luce fluorescente e il PC. Accedere all'account del sistema operativo, avviare il software e verificarne la configurazione.
   2. Posizionare la piastra preparata sullo stadio del microscopio. Posizionare il campione sull'obiettivo utilizzando il controller dello stage.
   3. Trova le cellule di interesse al microscopio luminoso, passa alla microscopia fluorescente e cattura le immagini sintonizzando i parametri.
      NOTA: Per osservare il segnale fluorescente di Hoechst 33258 legato al DNA dei nuclei, la microscopia a fluorescenza deve essere condotta con eccitazione ed emissione rispettivamente a circa 352 nm e 461 nm.

Risultati

Qui, abbiamo stabilito la coltura primaria delle cellule intestinali di A. japonicus e abbiamo fatto passare le cellule. La figura 1 mostra le celle rotonde in diverse fasi di coltura. E i saggi di colorazione EdU forniscono prove dirette per rivelare l'attività proliferaria di queste cellule rotonde nella fase successiva (Figura 2). Abbiamo anche leggermente regolato il protocollo, coltivando i blocchi di tessuto macinato invece delle cellule filtrate...

Discussione

Negli ultimi decenni sono stati dedicati ampi sforzi di ricerca per stabilire le linee cellulari, tuttavia, è ancora difficile fare un progresso sulla coltura a lungo termine delle cellule da invertebrati marini^14,22. È stato riferito che le cellule coltivate provenienti da tessuti olothuriani rigeneranti erano vitali per un lungo periodo di tempo e un'elevata attività di proliferazione può essere rilevata in cellule specifiche^17,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 μm filter	Millipore	SLVV033RS
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
0.25% Trypsin	Genom	GNM25200
100 μm filter	Falcon	352360
4 cm dishes	ExCell Bio	CS016-0124
4% paraformaldehyde solution	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	in PBS
Benchtop Centrifuges	Beckman	Allegra X-30R
BeyoClick EdU-488 kit	Beyotime	C0071S
CaCl2	Sinopharm Chemical Reagent	10005817
Constant temperature incubator	Lucky Riptile	HN-3
Dexamethasone	Sinopharm Chemical Reagent	XW00500221
Electric thermostatic water bath	senxin17	DK-S28
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	80176961	75%
Fibroblast Growth Factor(FGF)	PEPROTECH	100-18B
Fluorescent microscope	Leica DMI3000B	DMI3000B
Garamycin	Sinopharm Chemical Reagent	XW14054101
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent	63005518
Hoechst33258 Staining solution	Beyotime	C1017
Insulin	Sinopharm Chemical Reagent	XW1106168001
Insulin like Growth Factor(IGF)	PEPROTECH	100-11
KCl	Sinopharm Chemical Reagent	10016308
Leibovitz's L-15	Genom	GNM41300
L-glutamine (100 mg/mL)	Genom	GNM-21051
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent	XW77863031
Na2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10020518
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent	10019718
PBS	Solarbio	P1020	pH7.2-7.4
Penicillin-Streptomycin	Genom	GNM15140
PH meter	Bante	A120
Taurine	SIGMA	T0625
VE	Seebio	185791