Inducción y detección de apoptosis en un cultivo primario de células intestinales de pepino marino

Resumen

Este protocolo proporciona un método fácil de manejar para cultivar las células intestinales del pepino de mar Apostichopus japonicus y es compatible con una variedad de muestras de tejido ampliamente disponibles de organismos marinos, incluyendo Echinodermata, Mollusca y Crustacea.

Resumen

Las células cultivadas primarias se utilizan en una variedad de disciplinas científicas como herramientas excepcionalmente importantes para la evaluación funcional de sustancias biológicas o la caracterización de actividades biológicas específicas. Sin embargo, debido a la falta de medios y protocolos de cultivo celular universalmente aplicables, los métodos de cultivo celular bien descritos para los organismos marinos siguen siendo limitados. Mientras tanto, la contaminación microbiana y las propiedades politrópicas de las células invertebradas marinas impiden aún más el establecimiento de una estrategia de cultivo celular eficaz para los invertebrados marinos. Aquí, describimos un método fácil de manejar para el cultivo de células intestinales de pepino de mar Apostichopus japonicus; además, proporcionamos un ejemplo de inducción y detección de apoptosis in vitro en células intestinales cultivadas primarias. Además, este experimento proporciona detalles sobre el medio de cultivo adecuado y el método de colección de células. El protocolo descrito es compatible con una variedad de muestras de tejido ampliamente disponibles de organismos marinos, incluyendo Echinodermata, Mollusca y Crustacea, y puede proporcionar suficientes células para múltiples aplicaciones experimentales in vitro. Esta técnica permitiría a los investigadores manipular eficientemente los cultivos celulares primarios de los invertebrados marinos y facilitar la evaluación funcional de materiales biológicos específicos en las células.

Introducción

El cultivo de células en condiciones controladas artificialmente, y no en su entorno natural, proporciona materiales experimentales uniformes para estudios biológicos, especialmente para especies que no se pueden cultivar fácilmente en un entorno de laboratorio. Los invertebrados marinos representan más del 30% de todas las especies animales¹y proporcionan numerosos materiales biológicos para llevar a cabo investigaciones sobre los mecanismos reguladores de procesos biológicos específicos, como la regeneración^2,3, la respuesta al estrés^4,y la adaptación ambiental^5,6.

El pepino de mar, Apostichopus japonicus,es una de las especies de equinodermos más estudiadas que habita en aguas templadas a lo largo de la costa del Pacífico Norte. Es bien conocido como una especie comercialmente importante y maricultura a gran escala en Asia oriental, especialmente en China⁷. Numerosas preguntas científicas sobre A. japonicus,incluyendo los mecanismos reguladores subyacentes a la regeneración intestinal después de la evisceración⁸ y la degeneración en la estivación⁹, el control metabólico^10,11,y la respuesta inmune^12,13 bajo tensiones térmicas o patógenas, han atraído la atención de los investigadores. Sin embargo, en comparación con los animales modelo bien estudiados, la investigación básica, especialmente a nivel celular, está limitada por cuellos de botella técnicos, como la falta de métodos avanzados de cultivo celular.

Los investigadores han dedicado mucho esfuerzo al establecimiento de líneas celulares, pero también se han enfrentado a muchos desafíos y no se ha establecido ninguna línea celular de ningún invertebrado marino todavía¹⁴. Sin embargo, los cultivos celulares primarios de los invertebrados marinos han avanzado en las últimas décadas^15,16,y han proporcionado una oportunidad para la experimentación a nivel celular. Por ejemplo, la intesina regeneradora de A. japonicus se ha utilizado como una fuente de células para cultivos celulares a largo plazo que proporcionó un método práctico para el cultivo celular primario de invertebrados marinos¹⁷. Este protocolo combina y optimizó el cultivo celular de invertebrados y desarrolló un método de cultivo primario ampliamente adecuado para pepino de mar u otros invertebrados marinos.

La apoptosis es un programa de suicidio celular intrínseco desencadenado por varios estímulos exógenos y endógenos. La apoptosis coordinada es crucial para muchos sistemas biológicos^18,19,y se ha implicado en la regresión intestinal del pepino de mar durante la estivación^9. Para investigar el proceso apoptotico en organismos de interés, se han establecido y aplicado con éxito una serie de métodos, incluidos ensayos de tinción y microscopía Hoechst, que se han aplicado con éxito²⁰. Aquí, llevamos a cabo la inducción y detección de apoptosis en células intestinales cultivadas primarias de pepino de mar para evaluar la usabilidad de las células primarias en estudios biológicos de invertebrados marinos. La dexametasona, uno de los glucocorticosteroides sintéticos de uso común^21,se utilizó para inducir apoptosis en células intestinales cultivadas a partir de pepino de mar, y la señal significativa Hoechst 33258 se detectó con éxito en las células manchadas mediante microscopía fluorescente.

Protocolo

1. Preparación media de cultivo celular

1. Preparación de líquido sinmica
   1. Recogida de fluidos coelómicos: En condiciones estériles, diseccione un pepino de mar sano (peso húmedo de 85-105 g), recoja el líquido celómico y guárdelo en un matraz de vidrio estéril.
   2. Extirpación de células coelómicas: Centrifugar el líquido celómico en tubos centrífugos de 50 ml a 1.700 x g durante 5 min y transferir el sobrenadante a un nuevo matraz de vidrio estéril; a continuación, recoger el líquido celómico libre de células del pepino de mar.
   3. Inactivación de componentes de complemento: Incubar el matraz de vidrio estéril, que contiene el líquido celómico de pepino de mar, en un baño de agua de 40-50 oC durante 20-40 min para obtener el complemento de líquido celómico inactivado por componentes.
   4. Eliminación de microbios: Eliminar las bacterias y la clamidia por filtración a través de filtros de membrana de 0,22 m. A continuación, retire el micoplasma y otras partículas finas mediante filtración utilizando filtros de membrana de 0,1 m para obtener una solución de pretratamiento de líquido coelómico.
   5. Ajuste de salinidad: Ajustar la salinidad de la solución de pretratamiento de líquido celómico a 30o (medido por salinometro) añadiendo un 20% de alta concentración de solución de NaCl presterilizada y filtrada (diluida por líquido celómico pretratado) o DDW (agua destilada doble). Transfiera el líquido celómico de pepino de mar a una botella estéril, selle la botella y almacene el líquido a 4 oC para más experimentos.
2. Optimización del medio de cultivo celular L-15 de Leibovitz
   1. Pesar 5,05 g de NaCl, 0,135 g de KCl, 0,15 g de CaCl₂, 0,25 g de Na₂SO₄, 0,975 g de MgCl₂, 0,25 g de glucosa, y 6,25 mg de taurina y diluirlos en 40 ml de medio L-15 de Leibovitz en un tubo estéril de 50 ml. Agitar el tubo de una coctelera durante 1 h para asegurarse de que las sales se han disuelto por completo.
   2. Añadir 2,5 ml de L-glutamina (100 mg/ml) y 500 ml de solución VE (1,75 mg/L) en el medio L-15 de Leibovitz previamente preparado y filtrar aún más el medio a través de filtros de membrana de 0,22 m.
   3. Ajustar el volumen medio total a 500 ml con el medio L-15 fresco de Leibovitz y con 100 ml de líquido celómico previamente preparado; a continuación, ajuste el pH a 7.6 utilizando la solución NaOH. Mantenga el proceso de operación en un entorno estéril. La proporción de compuestos de líquido celómico puede ser de 10%–50%, y 20% es suficiente para A. cultivo de células intestinales japonesas.

2. Preparación de células intestinales

1. Procesamiento del intestino de pepino de mar
   1. Anestesia los pepinos de mar sanos en una caja de hielo. Diseccionar y recoger los intestinos anteriores, luego seccionar las muestras de tejido verticalmente y eliminar el contenido interno.
   2. Lavar dos veces las muestras de tejido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y desinfectarlas por inmersión en una solución acuosa de etanol (75% en volumen) durante no más de 2 s.
   3. Lave las muestras de tejido en PBS tres veces para eliminar el etanol y transferir alrededor de 100 mg de muestra de tejido en un tubo de microcentrífuga estéril de 2,0 ml.
2. Colección de células
   1. Añadir 1,5 ml del medio de cultivo preoptimizado al bloque de tejido intestinal del pepino de mar y picar el bloque con tijeras quirúrgicas esterilizadas hasta que la solución esté turbia.
      NOTA: Para un protocolo simplificado opcional, añada 0,5 ml de medio de cultivo preoptimizado al bloque de tejido intestinal de pepino de mar y corte el bloque con tijeras quirúrgicas esterilizadas en 1 mm³. Transfiera directamente las muestras a platos de cultivo seguidos de pasos de incubación posteriores.
   2. Añadir 400 l de trippsina (0,25%), mezclar la solución por inversión e incubarla durante 5 minutos a temperatura ambiente; luego, filtrar la solución con un colador de células de 100 m.
      NOTA: Es opcional agregar trippsina para la dispersión celular al tratar diferentes muestras de tejido. El ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) debe estar contenido en la solución de trippsina para reducir la actividad inhibitoria de Ca²⁺ y Mg²⁺ en medio de cultivo.
   3. Recoger el filtrado en un nuevo tubo estéril de 2,0 ml de microcentrífuga, centrífuga a 1.700 x g durante 3 min, desechar el sobrenadante, luego resuspender el pellet en medio de cultivo (complementado con antibióticos) y lavarlo dos veces.
      NOTA: Preparar un nuevo medio de cultivo preoptimizado complementado con una solución de penicilina-estreptomicina al 2% (10.000 U/ml de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina) y un 1% de gentamicina (4 mg/ml) antes del inicio del experimento.

3. Cultivo celular

1. Preajuste de incubadora: Preestablecer la incubadora para el cultivo celular y ejecutarla con antelación durante al menos 24 h con una temperatura de 18oC y humedad saturada.
   NOTA: Alimentar CO₂ en la incubadora dependiendo de las propiedades del medio de cultivo celular; no es necesario suministrar_CO2 cuando se utiliza el medio básico del L-15 de Leibovitz.
2. Cultivo celular de primera etapa
   1. Para inhibir el crecimiento de microbios y promover la proliferación durante la etapa inicial del cultivo celular, añadir 10 ml de solución de penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina) y 0,5 ml de gentamicina (40 mg/ml) en cada 500 ml de cultivo de cultivo preoptimizado. Además, suplementar cada medio de cultivo de 500 ml con 0,6 ml de insulina (10 mg/ml), 100 ml de factor de crecimiento similar a la insulina (0,1 g/L) y 25 ml de factor de crecimiento de fibroblastos (0,1 g/L).
   2. Recoger las células en tubos de 1,5 ml, resuspenderlas con 200 ml de medio indicado y canalizarlas en platos de 4 cm.
   3. Cultivar las células en una incubadora y añadir 2,0 ml de medio indicado a los platos de cultivo de células después de 6 h. Cambiar la mitad del medio cada 12 h hasta llegar a la siguiente etapa.
      NOTA: Manipule el cambio medio suavemente, ya que las células no están unidas firmemente a los platos. Platos recubiertos de poli-d-lisina se pueden utilizar para unir libremente a las células del plato.
3. Cultivo celular en segunda etapa
   1. Para reducir los efectos adversos de los antibióticos en las células cultivadas, reducir la concentración de antibióticos indicados (penicilina, estreptomicina y gentamicina) en el medio de cultivo a la mitad.
      NOTA: El uso de insulina y factores de crecimiento depende de las condiciones de cultivo celular y es opcional.
   2. Reemplace el medio de cultivo celular; realizar cambios medios cada dos o tres días dependiendo de la densidad celular.
      NOTA: Observe las células cultivadas diariamente bajo un microscopio y registre las condiciones de crecimiento.
4. Paso celular
   NOTA: Pasaje y subcultura de las células, cuando la densidad de celda primaria alcanza el 60%.
   1. Lave las células cultivadas dos veces con PBS a temperatura ambiente. Añadir 200 l de solución de trippsina (0,25%) a cada plato y agitar manualmente el plato asegurando que todo el fondo esté cubierto. Deseche la solución de trippsina e incubar las células durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   2. Lavar las células con 1,0 ml de medio de cultivo fresco pipeteando y resuponiendo las células. Transfiera 0,5 ml de suspensión celular a un plato nuevo, agregue 1,5 ml de medio fresco e incubar las células a 18 oC.
      NOTA: Los rascadores celulares se pueden utilizar para la recolección de células cuando la solución de trippsina no digiere y separa las células de los platos (algunas líneas celulares son demasiado adhesivas). Sin embargo, no lleve a cabo ambos métodos simultáneamente.
   3. Cambie el medio después de 12 h y observe las células bajo un microscopio para evaluar las condiciones. Cultivo de las células para ensayos experimentales adicionales.

4. Inducción y detección de apoptosis en A. células intestinales noventa

1. Cultivo celular y tratamiento de dexametasona
   1. Preparar las células intestinales siguiendo el protocolo introducido anteriormente y agregar las células gotas a una placa de 12 pocillos en un volumen celular de 2 x 10⁶ por pozo.
   2. Después de tres días en cultivo, siguiendo los pasos del "cultivo celular de la primera etapa", lavar las células tres veces con PBS y reemplazar el medio con un medio optimizado (sin antibióticos y factores de crecimiento).
   3. Diluir la dexametasona (DXMS) en un medio de cultivo para preparar soluciones DXMS frescas de 2 m y 200 M antes de comenzar los experimentos.
   4. Añadir soluciones DXMS en diferentes concentraciones a células cultivadas cultivadas con el mismo volumen de medio de cultivo; establecer tres grupos experimentales, incluyendo control (CTL), 1 M y 100 m DXMS.
2. Tinción de Hoechst
   1. Lave las células con PBS tres veces después de la incubación con/sin DXMS durante los períodos de tiempo indicados (0 h, 24 h y 48 h).
   2. Añadir 300 sl de solución Hoechst 33258 por pozo a una placa de 12 pocillos e incubar a 18 oC durante 30 minutos.
   3. Retire la solución de tinción Hoechst y fije las células agregando 300 sL de una solución de paraformaldehído al 4% (en PBS) a cada pocche. Agitar suavemente durante 15 min.
      PRECAUCION: Paraformaldehído es moderadamente tóxico por contacto con la piel o inhalación, y se designa como un carcinógeno humano probable. Durante el pesaje y el manejo del paraformaldehído se deben utilizar campanas de humos químicos, cerramientos de balanza ventilado u otras medidas de protección.
   4. Lave las células fijas tres veces en PBS. No deseche el PBS después del lavado para mantener las celdas cubiertas.
3. Análisis de microscopía fluorescente
   1. Encienda el hardware del microscopio fluorescente, incluida la potencia de la lámpara de mercurio, la potencia de luz fluorescente y el PC. Inicie sesión en la cuenta del sistema operativo, inicie el software y compruebe su configuración.
   2. Coloque la placa preparada en la etapa del microscopio. Coloque la muestra sobre la lente objetivo utilizando el controlador de etapa.
   3. Encuentre las células de interés bajo el microscopio de luz, cambie a la microscopía fluorescente y capture las imágenes ajustando los parámetros.
      NOTA: Para observar la señal fluorescente Hoechst 33258 unida al ADN de los núcleos, la microscopía de fluorescencia debe realizarse con excitación y emisión a aproximadamente 352 nm y 461 nm, respectivamente.

Resultados

Aquí, establecimos el cultivo celular intestinal primario de A. japonicus y pasamos las células. La Figura 1 muestra celdas redondas en diferentes etapas de cultivo. Y los ensayos de tinción EdU proporcionan evidencias directas para revelar la actividad proliferativa de estas células redondas en etapas posteriores(Figura 2). También ajustamos ligeramente el protocolo, el cultivo de bloques de tejido picado en lugar de células filtradas; además, u...

Discusión

En las últimas décadas se han dedicado amplios esfuerzos de investigación a establecer líneas celulares en las últimas décadas, sin embargo, sigue siendo difícil avanzar en el cultivo a largo plazo de células a partir de invertebrados marinos^14,22. Se ha informado de que las células cultivadas de la regeneración de los tejidos holothurianos eran viables durante un largo período de tiempo y se puede detectar una alta actividad de proliferación en célu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 μm filter	Millipore	SLVV033RS
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
0.25% Trypsin	Genom	GNM25200
100 μm filter	Falcon	352360
4 cm dishes	ExCell Bio	CS016-0124
4% paraformaldehyde solution	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	in PBS
Benchtop Centrifuges	Beckman	Allegra X-30R
BeyoClick EdU-488 kit	Beyotime	C0071S
CaCl2	Sinopharm Chemical Reagent	10005817
Constant temperature incubator	Lucky Riptile	HN-3
Dexamethasone	Sinopharm Chemical Reagent	XW00500221
Electric thermostatic water bath	senxin17	DK-S28
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	80176961	75%
Fibroblast Growth Factor(FGF)	PEPROTECH	100-18B
Fluorescent microscope	Leica DMI3000B	DMI3000B
Garamycin	Sinopharm Chemical Reagent	XW14054101
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent	63005518
Hoechst33258 Staining solution	Beyotime	C1017
Insulin	Sinopharm Chemical Reagent	XW1106168001
Insulin like Growth Factor(IGF)	PEPROTECH	100-11
KCl	Sinopharm Chemical Reagent	10016308
Leibovitz's L-15	Genom	GNM41300
L-glutamine (100 mg/mL)	Genom	GNM-21051
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent	XW77863031
Na2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10020518
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent	10019718
PBS	Solarbio	P1020	pH7.2-7.4
Penicillin-Streptomycin	Genom	GNM15140
PH meter	Bante	A120
Taurine	SIGMA	T0625
VE	Seebio	185791