מודל שונה של שתי כליות קליפ אחד של ויסות רנין בהיצרות עורק הכליה

Summary

מודל שונה של 2 כליות 1 קליפ (2K1C) עכבר גולדבלט פותח תוך שימוש בצינורות פוליאוריתן כדי ליזום היצרות של עורק הכליה, מה שגרם לעלייה בביטוי הרנין ובפגיעה בכליות. כאן אנו מתארים הליך מפורט של הכנה והנחת השרוול על עורק הכליה כדי ליצור מודל עכבר 2K1C הניתן לשחזור ועקבי.

Abstract

היצרות עורק הכליה היא מצב שכיח בחולים עם מחלת כלי דם כליליים או היקפיים שבה מערכת רנין אנגיוטנסין אלדוסטרון (RAAS) מופעלת יתר על המידה. בהקשר זה, יש היצרות של עורקי הכליה המעוררים עלייה בביטוי ושחרור של רנין, הפרוטאז המגביל את קצב ב- RAAS. העלייה בביטוי הרנין כתוצאה מכך היא גורם ידוע ליתר לחץ דם רנובסקולרי, הקשור לעתים קרובות לפגיעה בכליות ולפגיעה באיברי הקצה. לכן, יש עניין רב בפיתוח טיפולים חדשניים למצב זה. המנגנון המולקולרי והתאי של בקרת רנין בהיצרות עורק הכליה אינו מובן במלואו ומצדיק חקירה נוספת. כדי לגרום להיצרות עורק הכליה בעכברים, פותח מודל שונה של 2 כליות 1 קליפ (2K1C) עכבר גולדבלט. הכליה הימנית התקבעה בעכברים מסוג בר, ועכברים שהופעלו על ידי שומה שימשו כבקרה. לאחר היצרות עורק הכליה, קבענו ביטוי רנין ופגיעה בכליות. הכליות נקטפו, וקורטיקס טרי שימש לקביעת ביטוי חלבון ו-mRNA של רנין. מודל חייתי זה ניתן לשחזור וניתן להשתמש בו כדי לחקור תגובות פתופיזיולוגיות, מסלולים מולקולריים ותאיים המעורבים ביתר לחץ דם רנובסקולרי ופגיעה בכליות.

Introduction

היצרות עורק הכליה (RAStenosis) היא בעיה בלתי פתירה המשפיעה על כ -6% מהאנשים מעל גיל 65 ועל עד 40% מהאנשים עם מחלת כלי דם כליליים או היקפיים ^1,2. הטיפולים הקיימים כיום במחלה מוגבלים; לכן, קיים צורך קריטי לפתח טיפולים חדשים לטיפול ביתר לחץ דם רנובסקולרי או יתר לחץ דם עמיד המושרה על ידי RAStenosis. מערכת רנין אנגיוטנסין אלדוסטרון (RAAS) היא מסלול המפתח המעורב בפתוגנזה של יתר לחץ דם המושרה על ידי RAStenosis או יתר לחץ דם רנובסקולרי ^3,4. טיפולים ידועים המכוונים ל-RAAS, כגון מעכבי ACE או חוסמי קולטן אנגיוטנסין, מקלים על יתר לחץ דם, אך זקוקים לבדיקה מדוקדקת של אי ספיקת כליות והיפרקלמיה ^5,6,7. רנין מזרז את השלב המגביל את הקצב ב-RAAS; הוא ממיר אנגיוטנסינוגן לאנגיוטנסין I. בטרשת עורקים, היווצרות פלאק גורמת להיצרות של עורק הכליה המניע את הפרשת רנין, וכתוצאה מכך יתר לחץ דם רנובסקולרי ונזק לכליות⁸. מספר מחקרים דיווחו על רמות מוגברות של עקה חמצונית במהלך יתר לחץ דם רנובסקולרי בבני אדם, אשר אומתו עם מודל שני עכברי קליפ כליה אחת (2K1C) וכן מודלים אחרים של בעלי חיים עם יתר לחץ דם 2,9,10,11,12,13,14,15,16 . המנגנון המולקולרי של בקרת ביטוי רנין במהלך RAStenosis המושרה יתר לחץ דם renovascular אינו מובן היטב ומצדיק חקירה נוספת.

מודלים ניסיוניים של בעלי חיים המשחזרים באופן אמין ומשכפל RAStenosis חשובים בהבהרת המנגנונים התאיים והמולקולריים של בקרת ביטוי רנין לפיתוח טיפולים חדשניים. מודל העכבר 2K1C הוא מודל ניסיוני מבוסס היטב לחקר הפתוגנזה של יתר לחץ דם רנובסקולרי^17,18,19,20. מודל זה נוצר על ידי התכווצות עורק הכליה באמצעות קליפ 17,20,21, ולכן מייצר חסימה של עורק הכליה שמביאה לעלייה בביטוי רנין ויתר לחץ דם 17,19,20,21. עם זאת, אין דוחות טכניים זמינים, המתארים הליך צעד אחר צעד כדי ליצור היצרות עורק הכליה במודלים של בעלי חיים.

קליפסים כסופים קונבנציונליים בצורת U, צינורות פוליאוריתן ותופסנים אחרים שימשו כדי לכווץ את עורק הכליה כדי לגרום להיצרות עורק הכליה. מחקרים מסוימים הראו כי העיצוב והחומר של הקליפ הם קריטיים להשגת נתונים אמינים וניתנים לשחזור עם מודל החיות 2K1C. על פי Lorenz et al., השימוש בקליפסים כסופים קונבנציונליים בעיצוב U גורם לשיעור הצלחה נמוך של יתר לחץ דם (40-60%)²¹. בשל עיצוב הקליפ, עורק הכליה נלחץ לרוחב, מה שמפעיל כמה כיווצים והסתברות גדולה יותר להיעקר מעורק הכליה. גמישות כסף ומשיכות עשויות לאפשר שינויים ברוחב הקליפס; לכן, גרימת רמות שונות של יתר לחץ דם בקרב עכברים. דו תחמוצת הכסף על התפס עלולה לגרום לדלקת פריווסקולרית, התפשטות אינטימית וגרגירי רקמות, מה שמשנה את קוטר עורק הכליה²². בשל השונות ברמות יתר לחץ הדם המתקבלות עם קליפס הכסף הקונבנציונלי של U-design, Warner et al. ו- Lorenz et al. השתמשו בהצלחה בצינורות פוליאוריתן בעיצוב עגול יותר כדי ליזום היצרות עורק הכליה בעכברים, ויצרו אינדוקציה אמינה ועקבית יותר של שתי הכליות מודל^20,21.

בדו"ח זה אנו מתארים פרוטוקול כירורגי ליצירת RAStenosis ניסיוני בעכברים, תוך שימוש בצינורות הפוליאוריתן כדי לכווץ את עורק הכליה. השרוול בעל העיצוב העגול מפוליאוריתן הוא קליפס שניתן לשחזור, אמין ובעלות נמוכה יותר ליצירת היצרות בעכבר. מטרתו של מודל ניסיוני זה היא לחקור ולהגדיר את המנגנון המולקולרי והתאי של בקרת ביטוי רנין במהלך היצרות עורק הכליה. אישרנו את ההצלחה של מודל עכברי RAStenosis על ידי מדידת ביטוי רנין וסמן פגיעה בכליות נויטרופילים הקשורים לג'לטינאז (N-GAL).

Protocol

עכברים שוכנו וטופלו במחלקה לטיפול בבעלי חיים במרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט (VUMC) בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) והמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, משרד הבריאות ושירותי האנוש של ארה"ב. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של VUMC לפני תחילת הניסויים.

1. הכנת בעלי חיים ודיסקציה

1. הפעל את הנבט ואת משאבת המים של כרית החימום כ -30 דקות לפני תחילת הניתוח.
2. חותכים צינורות פוליאוריתן באורך 0.5 מ"מ עם אזמל חד. הסר 0.2 מ"מ מההיקף על ידי ביצוע חתך לאורך כדי ליצור שרוול.
   הערה: זהו חלק קריטי בהליך היצרות עורק הכליה הדורש דיוק רב, תשומת לב לפרטים וסבלנות. נסו לחתוך כמה חתיכות של צינורות פוליאוריתן בכל פעם. בצע את כל ההליך הזה תחת מיקרוסקופ.
3. לפני שתמשיך הלאה, לבש כפפות סטריליות כירורגיות ומסכה כירורגית.
4. השתמש בעכברי C57BL/6 מסוג בר (WT) במשך 6-8 שבועות. השתמש במספר שווה של עכברים זכרים ונקבות כדי למנוע הטיה מינית.
5. רשום את משקל העכברים לפני ביצוע הניתוח. המשקל האידיאלי לביצוע היצרות עורק הכליה עם צינור פוליאוריתן הוא 18-22 גרם. טפלו בעכברים בעדינות ואל תתסיסו בזמן הזרקת ההרדמה. יש לתת משכך כאבים טרום ניתוחי (קטופגן, 5 מ"ג/ק"ג גוף).
   הערה: בעת העברת העכברים מחדר המגורים שלהם לחדר הניתוח, נשא אותם בעדינות רבה ובזהירות רבה כדי למנוע תסיסה. מומלץ מאוד לשאת כלובי עכברים בידיים במקום בעגלה.
6. הרדימו את העכברים בתערובת של קטמין (100 מ"ג/ק"ג BW) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג BW) באמצעות זריקות תוך-צפקיות (I.P.).
7. החזירו את העכבר לתוך הכלוב עד להרדמה מלאה. זה לוקח בערך 4-5 דקות לפני העכבר הוא מחוסר הכרה מלאה. צבוט את הזנב או הבוהן עם מלקחיים כדי לבדוק אם העכבר מחוסר הכרה לחלוטין ומוכן לניתוח.
8. הניחו את העכבר על גבו על מגבת נייר. הסר את שיער הבטן הצדדית באמצעות קוצץ שיער חשמלי בעקבות הכיוון ההפוך של צמיחת השיער. לאחר גילוח האתר הכירורגי, נקו את האזור עם קרצוף כירורגי המכיל יוד (או כלורהקסידין) ואחריו שטיפה עם 70% אתנול (או מלח סטרילי).  חזור על 3 פעמים.
   הערה: יש לבצע את הליך הסרת השיער במרחק מה או עדיף בספסל שונה מספסל הניתוח כדי למנוע הפרעות שיער וזיהום שיער במהלך הליך הניתוח.
9. מכסים את כרית החימום בסדין סטרילי. מביאים את העכבר לספסל הניתוח ומניחים על היריעה הסטרילית, הפונה לצד הימני הצדדי של העכבר לכיוון המיקרוסקופ. לשמור על טמפרטורת כרית קבועה של 37 מעלות צלזיוס עם מים במחזור.
10. פתח את השקית המעוקרת המכילה את כל הציוד הכירורגי. באמצעות מיקרוסקופ מנתח ומספריים חדים סטריליים, מבצעים חתך קטן באגף (קרוב לצלע החזה^ה-13 , הצלע האחרונה בעכבר) ובמרחק של כ-0.5 ס"מ מהחוליות. ממשיכים לאורך החוליות המותניות ומבצעים חתך של 1 אינץ '.
11. למשוך בחזרה את העור ואת השרירים כדי לחשוף את הכליה.
12. נקו והסירו את השומן שמסביב באמצעות צמר גפן סטרילי כדי לבודד את עורק הכליה. לבודד את עצב הכליה מעורק הכליה באמצעות מלקחיים מעוקלים.
13. בעת ביצוע ניתוח הבושה, החל תפרים כדי לסגור את העור ולהחיל אנטיביוטיקה על הפצע הסגור, ולאחר מכן להמשיך לטיפול לאחר הניתוח. אם לא, המשך עם הקטע הבא כדי stenose את העורק.
    הערה: כל ניסוי צריך לכלול חיות בושה כבקרה על ההליך הכירורגי. חיות שאם מורכבות מעכברים שעברו את ההליך הכירורגי של חשיפת עורק הכליה מבלי להניח עליו שרוול.

2. היצרות עורק הכליה הימני

1. מניחים שני תפרים מניילון מתחת לעורק הכליה הימני, יוצרים קשרים רופפים, ואז מניחים את השרוול סביב עורק הכליה הראשי בערך שווה בין הכליה לאבי העורקים
2. סגרו את השרוול באמצעות תפרים מניילון. הכינו ארבעה קשרים לכל תפר כדי למנוע את ההסתברות לאבד את התפרים לאחר הניתוח.
3. סגור את החתך בשריר על ידי החלת תפר רציף פשוט.
4. הכינו תפרים פשוטים שנקטעים כדי לסגור את העור.
5. מתן משככי כאבים מאושרים על ידי IACUC.
   הערה: כלי ניתוח אוטוקלאב לפני כל שימוש. אם מבוצע יותר מניתוח אחד בבת אחת, נגבו את כל הכלים המשומשים עם מד אלכוהול סטרילי והכניסו אותם לנביטה חמה למשך 15-30 שניות לאחר כל ניתוח. החלף כפפות סטריליות גם עבור כל עכבר.

3. טיפול לאחר הניתוח

1. החזירו עכברים לכלוב שלהם והשאירו את הכלוב חצי דולק, חצי כבוי, כרית חימום מים במחזור למשך 2 - 3 שעות. הוסיפו מזון ג'ל להתאוששות דיאטת בתוך הכלוב.
2. יש לתת משכך כאבים (קטופרופן) דרך הצפק (מינון: 5 מ"ג/ק"ג BW) למחרת.
3. שקלו את העכברים ביומיים הקרובים; אם חלק מהעכברים מאבדים יותר מ-20% ממשקלם, התייעצו עם הווטרינר והחליטו אם יש צורך להרדים את בעל החיים לאחר ההליך המתאים המאושר על ידי IACUC.
4. עקוב אחר העכברים מדי יום כדי להעריך אדמומיות, נפיחות, כאב או זיהום.
5. יש לפנות לייעוץ וטרינרי לסיבוכים לאחר הניתוח בהתאם למדיניות IACUC המוסדית..

4. קציר רקמות

1. קציר רקמות 3 שבועות לאחר הליך כירורגי. רשום את המשקל של כל עכבר.
2. להרדים את העכבר בהליך שאושר על ידי IACUC.
3. הנח את העכבר על פלטפורמה סטרילית במצב שכיבה כדי לנתח.
4. אבטח והרחב את הגפיים כדי להגביל את התנועה.
5. רססו היטב את העכברים ב-70% אתנול.
6. בצע חתך בקו האמצע כדי לפתוח את אזור הבטן והחזה באמצעות מספריים חדים.
7. משכו לאחור את העור ואת דופן הצפק.
8. בזהירות לחשוף את הלב ולנקב את החדר הימני exsanguinate העכבר.
9. הסר את שתי הכליות באמצעות מלקחיים. הכליות ממוקמות על גב העכברים.
   הערה: אין לערבב את שתי הכליות. היו מודעים לכליות היצרניות, הבושה והקונטרלטרליות.
10. הסר את כמוסת הכליות, נקה אותם מכל שומן ורשום את המשקל של כל כליה בנפרד.
11. חותכים חתך אורך של שתי הכליות ומקובעים ב-4% PFA למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס כדי שיעובדו מאוחר יותר להטמעת פרפין, כדי לבצע הכלאה באתרה (ISH) ואימונוהיסטוכימיה (IHC). עקוב אחר פרוטוקולי ISH ו- IHC כפי שדווחו^23,24.
12. לבודד את קליפת המוח של הכליה הנותרת ולהקפיא הבזק בחנקן נוזלי כדי לבצע כתם מערבי. יש לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח.
13. כימות ביטויי רנין, ו-N-GAL עם כתם מערבי כמתואר בספרות^23,24.

5. סטטיסטיקה

1. השתמש ב- ANOVA חד-כיווני או דו-כיווני לניסויים עם שלושה תנאים או יותר ולאחר מכן מבחני בונפרוני לאחר הוק לצורך השוואה בין קבוצות בודדות. שקול ערך p שווה או קטן מ- 0.05 משמעותי. השתמש בתוכנה (לדוגמה, GraphPad Prism 8.2) כדי לבצע את כל הניתוחים הסטטיסטיים.

תוצאות

התכווצות עורק הכליה מגבירה את ביטוי הרנין בכליה היציבה תוך דיכוי הביטוי בכליה הנגדית. הקטיף של שתי הכליות (2K1C) או מודל ההיצרות של גולדבלט גורם לביטוי מוגבר של רנין ולפגיעה בכליות. זה מוכר כמודל הייצוגי הטוב ביותר של היצרות עורק הכליה חד צדדית בבני אדם.

ביטוי של רנין ופרורנין...

Discussion

היצרות עורק הכליה היא גורם חשוב ליתר לחץ דם משני או עמיד, ולפגיעה בכליות ^1,29. מודל גולדבלט בעל שתי הכליות (2K1C) שימש לחקר יתר לחץ דם רנובסקולרי המושרה על ידי RAStenosis 1,17,18,19. מספר מחקרים קודמים ש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diet Gel	Clear H2O	Diet-Gel 76A	Surgery recovery diet
EMC Heated Hard pad	Hallowell	000A2788B	Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	662G	4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815 G	8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500	Braintree Scientific Inc.	GER 5287	Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen	Zoetis	Ketofen	Painkiller
Polyurethane	Braintree Scientific Inc.	MRE-025	This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks	Medline	MDS093901	It was applied after hair removal and surgery on the skin
Reflex 7 Clip Applier	Roboz Surgical Instrument Co	204-1000	This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off
Sterile towel drapes	Dynarex	4410	It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment	Medi-First	22312
Water pump	Stryker	T/pump Professionals	Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery