신장 동맥 협착증에서 레닌 조절의 수정 된 두 신장 하나의 클립 마우스 모델

요약

변형된 2 신장 1 클립(2K1C) Goldblatt 마우스 모델은 폴리우레탄 튜브를 사용하여 신장 동맥 협착을 개시하여 레닌 발현 및 신장 손상의 증가를 유도하여 개발되었다. 여기에서는 재현 가능하고 일관된 2K1C 마우스 모델을 생성하기 위해 커프를 준비하고 신장 동맥 상에 배치하는 자세한 절차를 설명합니다.

초록

신장 동맥 협착증은 레닌 안지오텐신 알도스테론 시스템 (RAAS)이 과도하게 활성화되는 관상 동맥 또는 말초 혈관 질환 환자에서 흔한 상태입니다. 이러한 맥락에서, RAAS에서 속도 제한 프로테아제인 레닌의 발현 및 방출의 증가를 자극하는 신장 동맥의 협착이 존재한다. 레닌 발현의 결과적인 상승은 신장 손상 및 말단 장기 손상과 자주 관련된 망혈관 고혈압의 알려진 동인이다. 따라서이 상태에 대한 새로운 치료법을 개발하는 데 큰 관심이 있습니다. 신장 동맥 협착증에서 레닌 조절의 분자 및 세포 메커니즘은 완전히 이해되지 않았으며 추가 조사를 보증합니다. 마우스에서 신장 동맥 협착을 유도하기 위해, 변형된 2개의 신장 1 클립(2K1C) Goldblatt 마우스 모델이 개발되었다. 오른쪽 신장을 야생형 마우스에서 스테노스화하였고, 가짜 조작 마우스를 대조군으로 사용하였다. 신장 동맥 협착 후, 우리는 레닌 발현과 신장 손상을 결정했습니다. 신장을 수확하고 신선한 피질을 사용하여 레닌의 단백질 및 mRNA 발현을 확인했습니다. 이 동물 모델은 재현 가능하며 혈관 고혈압 및 신장 손상에 관련된 병리 생리학 반응, 분자 및 세포 경로를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

신장 동맥 협착증 (RAStenosis)은 65 세 이상의 사람들의 약 6 %와 관상 동맥 또는 말초 혈관 질환 ^1,2 환자의 최대 40 %에 영향을 미치는 난치성 문제입니다. 질병에 대한 현재 치료법은 제한적입니다. 따라서 RAStenosis에 의해 유발 된 망막 혈관 고혈압 또는 내성 고혈압을 치료하기위한 새로운 치료법을 개발할 필요가 있습니다. 레닌 안지오텐신 알도스테론 시스템(RAAS)은 RAStenosis 유도성 고혈압 또는 망혈관 고혈압 ^3,4의 발병기전에 관여하는 주요 경로이다. ACE 억제제 또는 안지오텐신 수용체 차단제와 같은 RAAS를 표적으로 하는 알려진 치료법은 고혈압을 완화시키지만, 신부전 및 고칼륨혈 증^5,6,7에 대한 면밀한 검사가 필요하다. 레닌은 RAAS에서 속도 제한 단계를 촉매한다; 그것은 안지오텐시노겐을 안지오텐신 I로 변환시킨다. 죽상 동맥 경화증에서 플라크 형성은 레닌 분비를 유도하는 신장 동맥의 협착을 일으켜 망상 혈관 고혈압 및 신장 손상을 초래합니다⁸. 다수의 연구들이 인간에서 망혈관 고혈압 동안 산화적 스트레스의 증가된 수준을 보고하였으며, 이는 두 개의 신장 1클립(2K1C) 마우스 모델 및 다른 고혈압 동물 모델 2,9,10,11,12,13,14,15,16으로 확증되었다. . RAStenosis 유도 망혈관 고혈압 동안 레닌 발현 조절의 분자 메카니즘은 잘 이해되지 않으며 추가 조사를 보증한다.

RAStenosis를 안정적이고 재현 가능하게 재해석하는 실험 동물 모델은 새로운 치료법의 개발을 위해 레닌 발현 조절의 세포 및 분자 메커니즘을 밝히는 데 중요합니다. 2K1C 마우스 모델은 망혈관 고혈압^17,18,19,20의 발병기전을 연구하기 위해 잘 확립된 실험 모델이다. 이 모델은 클립 17,20,21을 사용하는 신장 동맥의 수축에 의해 생성되며, 따라서 레닌 발현 및 고혈압 ^17,19,20,21의 증가를 초래하는 신장 동맥 폐색을 생성한다. 그러나 동물 모델에서 신장 동맥 협착증을 발생시키는 단계별 절차를 설명하는 기술 보고서는 없습니다.

종래의 U자형 실버 클립, 폴리우레탄 튜브 및 기타 클립은 신장 동맥 협착을 유도하기 위해 신장 동맥을 수축시키기 위해 사용되어 왔다. 일부 연구에 따르면 클립의 디자인과 재질은 2K1C 동물 모델로 신뢰할 수 있고 재현 가능한 데이터를 얻는 데 중요합니다. Lorenz et al.에 따르면, 기존의 U-designed silver clips의 사용은 고혈압의 낮은 성공률 (40-60 %)을 유도합니다.²¹. 클립 디자인으로 인해 신장 동맥은 옆으로 눌러 약간의 수축을 유발하고 신장 동맥에서 빠져 나올 확률이 높아집니다. 실버 가단성과 연성은 클립 폭의 변화를 허용 할 수 있습니다; 따라서 생쥐들 사이에서 다른 고혈압 수준을 유발합니다. 클립상의 이산화은은 혈관주위 염증, 내막 증식 및 조직 과립화를 일으켜 신장 동맥 직경(²²)을 변화시킬 수 있다. 종래의 U-design 실버 클립으로 수득된 고혈압 수준의 가변성으로 인해, Warner et al. 및 Lorenz 등은 마우스에서 신장 동맥 협착을 개시하기 위해 라운더-디자인 폴리우레탄 튜빙을 성공적으로 사용하여, 두 개의 신장 하나의 클립 동물 모델^20,21의 보다 안정적이고 일관된 유도를 생성하였다.

이 보고서에서는 폴리 우레탄 튜브를 사용하여 신장 동맥을 수축시키는 마우스에서 실험적 RAStenosis를 생성하는 수술 프로토콜을 설명합니다. 폴리 우레탄 라운드 디자인 커프는 마우스에서 협착을 발생시키는보다 재현 가능하고 신뢰할 수 있으며 저렴한 클립입니다. 이 실험 모델의 목표는 신장 동맥 협착 동안 레닌 발현 조절의 분자 및 세포 메커니즘을 연구하고 정의하는 것입니다. 레닌 발현 및 신장 손상 마커인 호중구 젤라틴아제-관련 리포칼린(N-GAL)을 측정함으로써 RAStenosis 마우스 모델의 성공을 확인하였다.

프로토콜

마우스는 밴더빌트 대학 의료 센터 (VUMC) 동물 관리 부서 국립 보건원 (NIH) 지침과 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 가이드, 미국 보건 복지부에 따라 보관되고 보살핌을 받았다. 모든 동물 절차는 실험을 시작하기 전에 VUMC 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 동물 준비 및 해부

1. 수술을 시작하기 약 30 분 전에 가열 패드의 발아기와 워터 펌프를 켭니다.
2. 날카로운 메스로 0.5mm 길이의 폴리 우레탄 튜브를 자릅니다. 커프를 만들기 위해 길이 방향으로 절단하여 둘레의 0.2mm를 제거하십시오.
   참고 : 이것은 극도의 정밀도, 세부 사항 및 인내심에 대한 관심을 필요로하는 신장 동맥 협착 절차의 중요한 부분입니다. 한 번에 여러 조각의 폴리 우레탄 튜브를 자르십시오. 이 모든 절차를 현미경으로 수행하십시오.
3. 더 이상 진행하기 전에 외과 용 멸균 장갑과 외과 용 마스크를 착용하십시오.
4. 6-8 주간의 C57BL / 6 야생형 (WT) 마우스를 사용하십시오. 성별 편견을 피하기 위해 동일한 수의 수컷과 암컷 마우스를 사용하십시오.
5. 수술을 수행하기 전에 마우스의 무게를 기록하십시오. 폴리 우레탄 튜브로 신장 동맥 협착을 수행하는 이상적인 무게는 18-22g입니다. 마우스를 부드럽게 처리하고 마취를 주입하는 동안 교반하지 마십시오. 수술 전 진통을 투여하십시오 (Ketofgen, 5 mg / kg body wieght).
   참고 : 생쥐를 숙소실에서 수술실로 옮기는 동안 동요를 피하기 위해 매우 온화하고 조심스럽게 운반하십시오. 트롤리 대신 쥐 케이지를 손에 들고 다니는 것이 좋습니다.
6. 복강 내 주사를 통해 케타민 (100 mg / kg BW)과 자일라진 (10 mg / kg BW)의 혼합물로 마우스를 마취하십시오.
7. 완전히 마취 될 때까지 마우스를 케이지 안에 다시 넣으십시오. 마우스가 완전히 의식을 잃기까지 약 4-5 분이 걸립니다. 꼬리 또는 발가락을 포셉으로 집어 넣어 마우스가 완전히 의식이없고 수술 준비가되었는지 확인하십시오.
8. 마우스를 종이 타월에 등을 대고 눕히십시오. 모발 성장의 반대 방향에 따라 전기 헤어 클리퍼를 사용하여 측면 복부의 머리카락을 제거하십시오. 수술 부위를 면도 한 후 요오드 (또는 클로르헥시딘)를 함유 한 수술 용 스크럽으로 부위를 닦은 다음 70 % 에탄올 (또는 멸균 식염수)으로 헹구십시오.  3 번 반복하십시오.
   참고 : 제모 절차는 수술 절차 중 모발 간섭 및 모발 오염을 피하기 위해 수술 절차 벤치와 다른 벤치에서 어느 정도 거리 또는 바람직하게는 수행해야합니다.
9. 가열 패드를 멸균 시트로 덮으십시오. 마우스를 수술 벤치로 가져 와서 멸균 시트에 올려 놓고 마우스의 오른쪽 측면을 현미경쪽으로 향하게하십시오. 순환수로 패드 온도를 37°C로 일정하게 유지하십시오.
10. 모든 수술 장비가 들어있는 멸균 된 가방을 엽니 다. 해부 현미경과 멸균 된 날카로운 가위를 사용하여 작은 측면 절개 (13^번째 흉부 갈비뼈, 마우스의 마지막 갈비뼈에 가까운)를 만들고 척추에서 약 0.5cm 떨어진 곳에 만듭니다. 요추를 따라 진행하고 1 인치 절개를하십시오.
11. 피부와 근육을 뒤로 당겨 신장을 노출시킵니다.
12. 멸균 면봉을 사용하여 주변 지방을 청소하고 제거하여 신장 동맥을 분리하십시오. 구부러진 포셉을 사용하여 신장 동맥에서 신장 신경을 분리하십시오.
13. 가짜 수술을 수행 할 때 봉합사를 적용하여 피부를 닫고 닫힌 상처에 항생제를 바르고 수술 후 치료를 진행하십시오. 그렇지 않은 경우 다음 섹션을 진행하여 동맥을 스테노스하십시오.
    참고 : 모든 실험에는 수술 절차의 통제로 가짜 동물이 있어야합니다. 샴 동물은 커프를 올려 놓지 않고 신장 동맥을 노출시키는 외과 적 절차를 거친 마우스로 구성됩니다.

2. 우측 신장 동맥 협착증

1. 오른쪽 신장 동맥 아래에 두 개의 나일론 봉합사를 놓고 느슨한 매듭을 만든 다음 신장과 대동맥 분기 사이의 약 등거리에있는 주요 신장 동맥 주위에 커프를 놓습니다.
2. 나일론 봉합사를 사용하여 커프를 닫습니다. 수술 후 봉합사가 손실 될 가능성을 피하기 위해 각 봉합사에 대해 네 개의 매듭을 만드십시오.
3. 간단한 연속 봉합사를 적용하여 근육의 절개를 닫습니다.
4. 피부를 닫기 위해 간단한 중단 봉합사를 만드십시오.
5. IACUC 승인 진통제를 관리하십시오.
   참고 : 모든 사용 전에 Autoclave 수술 도구. 한 번에 두 개 이상의 수술을 수행하는 경우 멸균 알코올 게이지로 사용 된 모든 도구를 닦아 모든 수술 후 15-30 초 동안 뜨거운 발아기에 두십시오. 각 마우스에 대해서도 멸균 장갑을 교체하십시오.

3. 수술 후 치료

1. 생쥐를 새장으로 돌려 놓고 케이지를 반쯤 켜고, 반쯤 떼어 내고, 순환수 가열 패드를 2 - 3 시간 동안 두십시오. 케이지 안에 젤 다이어트 회복 음식을 추가하십시오.
2. 다음날 진통제(케토프로펜)를 복강내 투여(용량: 5mg/kg BW)한다.
3. 다음 이틀 동안 마우스의 무게를 재는 단계; 일부 마우스가 체중의 20 % 이상을 잃은 경우 수의사와상의하고 적절한 IACUC 승인 절차에 따라 동물을 안락사시켜야하는지 결정하십시오.
4. 매일 마우스를 모니터링하여 발적, 붓기, 통증 또는 감염을 평가하십시오.
5. 제도적 IACUC 정책에 따라 수술 후 합병증에 대한 수의학 상담을 받으십시오.

4. 조직 수확

1. 수술 후 3 주 후에 조직을 수확하십시오. 각 마우스의 무게를 기록합니다.
2. IACUC가 승인한 절차로 마우스를 안락사시킨다.
3. 마우스를 수핀 위치의 멸균 플랫폼에 올려 놓고 해부하십시오.
4. 움직임을 제한하기 위해 팔다리를 고정하고 확장하십시오.
5. 마우스에 70 % 에탄올을 철저히 뿌리십시오.
6. 날카로운 가위를 사용하여 복부와 가슴 부위를 열기 위해 중간 선 절개를하십시오.
7. 피부와 복막 벽을 뒤로 당깁니다.
8. 조심스럽게 심장을 노출시키고 우심실에 구멍을 뚫고 마우스를 exsanguinate하십시오.
9. 포셉을 사용하여 두 신장을 모두 제거하십시오. 신장은 생쥐의 뒤쪽에 있습니다.
   참고: 두 신장을 모두 섞지 마십시오. 협착, 가짜 및 대측성 신장에 유의하십시오.
10. 신장 캡슐을 제거하고 지방에서 닦아내고 각 신장의 무게를 별도로 기록하십시오.
11. 양쪽 신장의 종방향 절편을 절단하고, 파라핀 포매를 위해 나중에 처리되도록 4°C에서 하룻밤 동안 4% PFA에 고정시키고, 계내 혼성화 (ISH) 및 면역조직화학(IHC)을 수행한다. 보고된^23,24대로 ISH 및 IHC 프로토콜을 따르십시오.
12. 남아있는 신장의 피질을 분리하고 액체 질소에서 플래시 동결하여 웨스턴 블롯을 수행하십시오. 분석될 때까지 샘플을 -80°C에서 보관한다.
13. 레닌을 정량화하고, N-GAL 발현을 문헌^23,24에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯으로 정량화한다.

5. 통계

1. 세 가지 이상의 조건을 가진 실험에는 단방향 또는 양방향 ANOVA를 사용한 다음 개별 그룹 간의 비교를 위해 Bonferroni 사후 테스트를 사용하십시오. p-값이 0.05보다 작거나 같다고 가정하십시오. 소프트웨어(예: GraphPad Prism 8.2)를 사용하여 모든 통계 분석을 수행합니다.

결과

신장 동맥 수축은 협착 된 신장에서 레닌 발현을 증가시키고 대측성 신장에서의 발현을 억제합니다. 협착증의 두 신장 1 클립 (2K1C) 또는 Goldblatt 모델은 레닌 발현 증가 및 신장 손상을 유도한다. 이것은 인간에서 일방적 인 신장 동맥 협착증의 가장 대표적인 모델로 인식됩니다.

레닌과 프로레닌(레닌의 전구체)의 발현은 면역블롯팅을 이용하여 측정하였다. 데이터는 대측성 ...

토론

신장 동맥 협착증은 이차 또는 내성 고혈압 및 신장 손상 ^1,29의 중요한 원인이다. 두 개의 신장 1 클립 (2K1C) Goldblatt 모델은 RAStenosis 유도 망막 혈관 고혈압^1,17,18,19를 연구하기 위해 채택되었다. 다양한 동물 모델을 사용한 다수의 이전 연구들은 신장 동맥의 ...

자료

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EMC Heated Hard pad	Hallowell	000A2788B	Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	662G	4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815 G	8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500	Braintree Scientific Inc.	GER 5287	Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen	Zoetis	Ketofen	Painkiller
Polyurethane	Braintree Scientific Inc.	MRE-025	This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks	Medline	MDS093901	It was applied after hair removal and surgery on the skin
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Sterile towel drapes	Dynarex	4410	It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment	Medi-First	22312
Water pump	Stryker	T/pump Professionals	Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery