Um modelo modificado de rato de dois rins um clipe de regulação de renin em estenose da artéria renal

Resumo

Um modelo modificado de 2 rim 1 (2K1C) O modelo de rato Goldblatt foi desenvolvido usando tubos de poliuretano para iniciar a estenose da artéria renal, induzindo um aumento na expressão de renin e lesão renal. Aqui, descrevemos um procedimento detalhado de preparação e colocação da braçadeira na artéria renal para gerar um modelo de mouse 2K1C reprodutível e consistente.

Resumo

A estenose da artéria renal é uma condição comum em pacientes com doença vascular coronariana ou periférica onde o sistema de aldosterona renin angiotensin (RAAS) é superativado. Nesse contexto, há um estreitamento das artérias renais que estimulam o aumento da expressão e liberação de renin, a protease que limita a taxa no RAAS. O aumento resultante da expressão de renin é um conhecido condutor da hipertensão renovascular, frequentemente associada a lesões renais e danos nos órgãos finais. Assim, há um grande interesse em desenvolver novos tratamentos para essa condição. O mecanismo molecular e celular do controle de renin na estenose da artéria renal não é totalmente compreendido e merece uma investigação mais aprofundada. Para induzir estenose da artéria renal em camundongos, foi desenvolvido um modelo de rato Goldblatt modificado de 2 rins 1 (2K1C). O rim direito foi estenoso em camundongos do tipo selvagem e camundongos operados por vergonha foram usados como controle. Após estenose da artéria renal, determinamos expressão de renin e lesão renal. Os rins foram colhidos, e cortices frescos foram usados para determinar a expressão proteica e mRNA de renin. Este modelo animal é reprodutível e pode ser usado para estudar respostas fiofoficológicas, vias moleculares e celulares envolvidas na hipertensão renovascular e lesão renal.

Introdução

A estenose da artéria renal (RAStenosis) é um problema intratável que afeta cerca de 6% das pessoas com mais de 65 anos e em até 40% das pessoas com doença vascular coronariana ou periférica ^1,2. Os tratamentos atuais para a doença são limitados; portanto, há uma necessidade crítica de desenvolver novas terapias para tratar hipertensão renovascular ou hipertensão resistente induzida por RAStenosis. O sistema de aldosterona de angiotensina renin (RAAS) é o caminho-chave envolvido na patogênese da hipertensão induzida por RAStenose ou hipertensão renovascular ^3,4. Terapias conhecidas voltadas para o RAAS, como inibidores de ACE ou bloqueadores de receptores de angiotensina, aliviam a hipertensão, mas precisam de um exame próximo para insuficiência renal e hipercalemia ^5,6,7. Renin catalisa o passo limitante de taxas no RAAS; converte angiotensinogênio em angiotensina I. Na aterosclerose, a formação da placa provoca o estreitamento da artéria renal que impulsiona a secreção de renin, resultando em hipertensão renovascular e danos nos rins⁸. Vários estudos relataram aumento dos níveis de estresse oxidativo durante a hipertensão renovascular em humanos, que foram corroborados com o modelo de dois camundongos de um rim (2K1C), bem como outros modelos animais hipertensos 2,9,10,11,12,13,14,15,16 . O mecanismo molecular de controle de expressão de renin durante a hipertensão renovascular induzida por RAStenosis não é bem compreendido e merece uma investigação mais aprofundada.

Modelos animais experimentais que recapitulam RAStenosis de forma confiável e reprodutiva são importantes na elucidação dos mecanismos celulares e moleculares do controle de expressão de renin para o desenvolvimento de novas terapias. O modelo de camundongo 2K1C é um modelo experimental bem estabelecido para estudar a patogênese da hipertensão renovascular 17,18,19,20. Este modelo é gerado pela constrição da artéria renal utilizando um clipe 17,20,21, produzindo assim oclusão da artéria renal que resulta em um aumento na expressão de renin e hipertensão 17,19,20,21. No entanto, não há relatórios técnicos disponíveis, que descrevam um procedimento passo a passo para gerar estenose da artéria renal em modelos animais.

Clipes de prata convencionais em forma de U, tubos de poliuretano e outros clipes têm sido usados para restringir a artéria renal para induzir estenose da artéria renal. Alguns estudos têm demonstrado que o design e o material do clipe são fundamentais para obter dados confiáveis e reprodutíveis com o modelo animal 2K1C. De acordo com Lorenz et al., o uso de clipes de prata convencionais projetados por U induz uma baixa taxa de sucesso de hipertensão (40-60%)²¹. Devido ao desenho do clipe, a artéria renal é pressionada lateralmente, desencadeando algumas constrições e maior probabilidade de ser desalojada da artéria renal. Maleabilidade prateada e ductilidade podem permitir alterações nas larguras do clipe; portanto, causando diferentes níveis de hipertensão entre camundongos. Os dióxidos de prata no clipe podem causar inflamação perivascular, proliferação intimal e granulação tecidual, alterando o diâmetro da artéria renal²². Devido à variabilidade nos níveis de hipertensão obtida com o clipe de prata u-design convencional, Warner et al. e Lorenz et al. usaram com sucesso um tubo de poliuretano de design arredondador para iniciar a estenose da artéria renal em camundongos, gerando uma indução mais confiável e consistente dos dois rins um clipe modelo animal^20,21.

Neste relatório, descrevemos um protocolo cirúrgico para gerar RAStenosis experimental em camundongos, usando a tubulação de poliuretano para restringir a artéria renal. O manguito de design redondo de poliuretano é um clipe mais reprodutível, confiável e de baixo custo para gerar estenose no mouse. O objetivo deste modelo experimental é estudar e definir o mecanismo molecular e celular do controle da expressão de renin durante a estenose da artéria renal. Confirmamos o sucesso do modelo de camundongos RAStenosis medindo a expressão de renin e o marcador de lesão renal neutrófilo gelatinase-associado lipocalina (N-GAL).

Protocolo

Os camundongos foram alojados e atendidos na Divisão de Cuidados com Animais do Centro Médico da Universidade Vanderbilt (VUMC) seguindo as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA. Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da VUMC antes do início dos experimentos.

1. Preparação e dissecção animal

1. Ligue o germinador e a bomba de água da almofada de aquecimento cerca de 30 minutos antes de iniciar a cirurgia.
2. Corte tubo de poliuretano de 0,5 mm de comprimento com um bisturi afiado. Remova 0,2 mm da circunferência fazendo um corte longitudinal para fazer uma braçadeira.
   NOTA: Esta é uma parte crítica do procedimento de estenose da artéria renal que requer extrema precisão, atenção aos detalhes e paciência. Tente cortar vários pedaços de tubos de poliuretano de cada vez. Realize todo este procedimento sob microscópio.
3. Antes de prosseguir, coloque luvas cirúrgicas estéreis e uma máscara cirúrgica.
4. Use ratos C57BL/6 (WT) de 6-8 semanas. Use um número igual de ratos machos e fêmeas para evitar qualquer viés sexual.
5. Grave o peso dos camundongos antes de realizar a cirurgia. O peso ideal para realizar estenose da artéria renal com tubo de poliuretano é de 18 a 22 g. Manuseie os ratos suavemente e não se agite ao injetar a anestesia. Administrar analgesia pré-operatória (Ketofgen, 5 mg/kg de musculação corporal).
   NOTA: Ao transferir os ratos de sua sala de alojamento para a sala de cirurgia, leve-os com grande gentileza e cuidado para evitar agitação. Carregar gaiolas de ratos nas mãos em vez de um carrinho é altamente recomendado.
6. Anestesiar os camundongos com uma mistura de cetamina (100 mg/kg BW) e xilazina (10 mg/kg BW) através de injeções intraperitoneais (I.P.).
7. Coloque o mouse de volta dentro da gaiola até anestesiar completamente. Leva cerca de 4-5 minutos antes que o rato esteja totalmente inconsciente. Aperte a cauda ou o dedo do pé com fórceps para verificar se o rato está totalmente inconsciente e pronto para a cirurgia.
8. Coloque o rato de costas em uma toalha de papel. Remova o cabelo do abdômen lateral usando um cortador de cabelo elétrico seguindo a direção oposta do crescimento capilar. Após raspar o local cirúrgico, limpe a área com um esfoliante cirúrgico contendo iodo (ou clorexidina), seguido de uma lavagem com 70% de etanol (ou soro fisiológico estéril).  Repita 3 vezes.
   NOTA: O procedimento de depilação deve ser realizado a alguma distância ou preferencialmente em um banco diferente do banco do procedimento cirúrgico para evitar qualquer interferência capilar e contaminação capilar durante o procedimento cirúrgico.
9. Cubra a almofada de aquecimento com uma folha estéril. Leve o mouse para o banco cirúrgico e coloque na folha estéril, de frente para o lado lateral direito do mouse em direção ao microscópio. Mantenha uma temperatura constante da almofada de 37 °C com água circulante.
10. Abra o saco esterilizado contendo todo o equipamento cirúrgico. Usando um microscópio dissecando e uma tesoura afiada estéril, faça uma pequena incisão flanco (perto da costela torácica de^13º , a última costela no rato) e cerca de 0,5 cm de distância das vértebras. Prossiga ao longo das vértebras lombares e faça uma incisão de 1 polegada.
11. Puxe a pele e o músculo para expor o rim.
12. Limpe e remova a gordura circundante usando cotonetes estéreis para isolar a artéria renal. Isole o nervo renal da artéria renal usando fórceps curvos.
13. Ao realizar a cirurgia falsa, aplique suturas para fechar a pele e aplicar antibiótico na ferida fechada, em seguida, prossiga para cuidados pós-operatórios. Se não, prossiga com a seguinte seção para stenose a artéria.
    NOTA: Todo experimento deve ter animais falsos como controles do procedimento cirúrgico. Animais falsos consistem em camundongos que passaram pelo procedimento cirúrgico de expor a artéria renal sem colocar uma braçadeira sobre ela.

2. Estenose da artéria renal direita

1. Coloque duas suturas de nylon sob a artéria renal direita, faça nós soltos e, em seguida, coloque o manguito ao redor da artéria renal principal aproximadamente equidistante entre o rim e a bifurcação da aorta
2. Feche a braçadeira usando as suturas de nylon. Faça quatro nós para cada sutura para evitar a probabilidade de perder as suturas após a cirurgia.
3. Feche a incisão no músculo aplicando uma sutura contínua simples.
4. Faça suturas simples interrompidas para fechar a pele.
5. Administrar analgésicos aprovados pela IACUC.
   NOTA: Ferramentas cirúrgicas autoclave antes de cada uso. Se mais de uma cirurgia estiver sendo realizada de uma só vez, limpe todas as ferramentas usadas com um medidor de álcool estéril e coloque-as em germinadores quentes para 15-30 s após cada cirurgia. Troque luvas estéreis também para cada rato.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Voltem os ratos para sua gaiola e deixem a gaiola meio em frente, meio fora, uma almofada de aquecimento de água circulante por 2 - 3 horas. Adicione alimentos de recuperação da dieta gel dentro da gaiola.
2. Administrá-lo com analgésico (cetoprofeno) intraperitoneal (dose: 5 mg/kg BW) no dia seguinte.
3. Pesar os ratos pelos próximos dois dias; se alguns camundongos perderem mais de 20% de seu peso consultar o veterinário e decidir se o animal precisa ser eutanizado após o procedimento autorizado pela IACUC.
4. Monitore os camundongos diariamente para avaliar vermelhidão, inchaço, dor ou infecção.
5. Procure consulta veterinária para complicações pós-operatórias de acordo com as políticas institucionais da IACUC..

4. Colheita de tecidos

1. Colher tecido 3 semanas após o procedimento cirúrgico. Grave o peso de cada rato.
2. Eutanize o mouse com um procedimento aprovado pela IACUC.
3. Coloque o mouse em uma plataforma estéril em posição supina para dissecar.
4. Segure e estenda os membros para limitar o movimento.
5. Pulverize minuciosamente os ratos com 70% de etanol.
6. Faça uma incisão midline para abrir o abdômen e a área do peito usando uma tesoura afiada.
7. Puxe a pele e a parede peritoneal.
8. Exponha cuidadosamente o coração e perfure o ventrículo direito e exsanguine o rato.
9. Remova ambos os rins usando fórceps. Os rins estão localizados na parte de trás dos ratos.
   NOTA: Não misture os dois rins. Esteja ciente dos rins estenosed, falso e contralateral.
10. Remova a cápsula renal, limpe-as de qualquer gordura e grave o peso de cada rim separadamente.
11. Corte uma seção longitudinal de ambos os rins e fixada em 4% pfa durante a noite a 4 °C para ser posteriormente processada para incorporação de parafina, para realizar em situ hibridização (ISH) e imunohistoquímica (IHC). Siga os protocolos ISH e IHC conforme relatado^23,24.
12. Isole o córtex do rim restante e o flash congele em nitrogênio líquido para realizar a mancha ocidental. Armazene amostras a -80 °C até a análise.
13. Quantifique expressões de renin, e N-GAL com mancha ocidental como descrito na literatura^23,24.

5. Estatísticas

1. Use ANOVA unidirecional ou bidirecional para experimentos com três ou mais condições seguidas de testes pós-hoc bonferroni para comparações entre grupos individuais. Considere um valor p igual ou inferior a 0,05 significativo. Use software (por exemplo, GraphPad Prism 8.2) para realizar todas as análises estatísticas.

Resultados

A constrição da artéria renal aumenta a expressão de renin no rim estenoso enquanto reprime a expressão no rim contralateral. O dois rim um clipe (2K1C) ou modelo Goldblatt de estenose induz aumento da expressão renin e lesão renal. Este é reconhecido como o melhor modelo representativo de estenose unilateral da artéria renal em humanos.

A expressão de renin e prorenina (precursora da renin) foram medidas utilizando-se imunoblotting. Os dados mostram que a expressão de renin e pror...

Discussão

A estenose da artéria renal é uma importante causa de hipertensão secundária ou resistente, e lesão renal ^1,29. O modelo goldblatt de dois rins (2K1C) foi empregado para estudar a hipertensão renovascular induzida por RAStenosis 1,17,18,19. Vários estudos anteriores utilizando vários modelos de animais mostraram que a estenose n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diet Gel	Clear H2O	Diet-Gel 76A	Surgery recovery diet
EMC Heated Hard pad	Hallowell	000A2788B	Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	662G	4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815 G	8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500	Braintree Scientific Inc.	GER 5287	Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen	Zoetis	Ketofen	Painkiller
Polyurethane	Braintree Scientific Inc.	MRE-025	This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks	Medline	MDS093901	It was applied after hair removal and surgery on the skin
Reflex 7 Clip Applier	Roboz Surgical Instrument Co	204-1000	This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off
Sterile towel drapes	Dynarex	4410	It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment	Medi-First	22312
Water pump	Stryker	T/pump Professionals	Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery