Renal Arter Darlığında Renin Regülasyonunun Modifiye İki Böbrek Bir Klipsli Fare Modeli

Özet

Renal arter darlığını başlatmak için poliüretan tüp kullanılarak modifiye edilmiş 2 böbrek 1 klips (2K1C) Goldblatt fare modeli geliştirildi ve renin ekspresyonunda ve böbrek hasarında artışa neden oldu. Burada, tekrarlanabilir ve tutarlı bir 2K1C fare modeli oluşturmak için manşetin renal arter üzerine hazırlanması ve yerleştirilmesi için ayrıntılı bir prosedür açıklıyoruz.

Özet

Renal arter darlığı, renin anjiyotensin aldosteron sisteminin (RAAS) aşırı aktive olduğu koroner veya periferik vasküler hastalığı olan hastalarda sık görülen bir durumdur. Bu bağlamda, RAAS'ta hız sınırlayıcı proteaz olan renin ekspresyonunda ve salınımında bir artışı uyaran renal arterlerde daralma vardır. Renin ekspresyonunda ortaya çıkan artış, sıklıkla böbrek hasarı ve son organ hasarı ile ilişkili olan renovasküler hipertansiyonun bilinen bir sürücüsüdür. Bu nedenle, bu durum için yeni tedaviler geliştirmeye büyük ilgi vardır. Renal arter darlığında renin kontrolünün moleküler ve hücresel mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır ve daha fazla araştırmayı gerektirmektedir. Farelerde renal arter darlığını indüklemek için, modifiye edilmiş 2 böbrek 1 klip (2K1C) Goldblatt fare modeli geliştirilmiştir. Sağ böbrek vahşi tip farelerde stenozlandı ve sahte ameliyat edilen fareler kontrol olarak kullanıldı. Renal arter darlığı sonrası renin ekspresyonu ve böbrek hasarı saptandı. Böbrekler toplandı ve reninin protein ve mRNA ekspresyonunu belirlemek için taze korteksler kullanıldı. Bu hayvan modeli tekrarlanabilir ve renovasküler hipertansiyon ve böbrek hasarında rol oynayan patofizyolojik yanıtları, moleküler ve hücresel yolları incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Renal arter darlığı (RAStenosis), 65 yaş üstü kişilerin yaklaşık% 6'sını ve koroner veya periferik vasküler hastalığı olan kişilerin% 40'ına kadarını etkileyen inatçı bir sorundur ^1,2. Hastalık için mevcut tedaviler sınırlıdır; Bu nedenle, renovasküler hipertansiyonu veya RAStenosis'in neden olduğu dirençli hipertansiyonu tedavi etmek için yeni tedavilerin geliştirilmesine kritik bir ihtiyaç vardır. Renin anjiyotensin aldosteron sistemi (RAAS), RAStenozise bağlı hipertansiyon veya renovasküler hipertansiyonun patogenezinde rol oynayan anahtar yoldur ^3,4. ACE inhibitörleri veya anjiyotensin reseptör blokerleri gibi RAAS'ı hedef alan bilinen tedaviler hipertansiyonu hafifletir, ancak böbrek yetmezliği ve hiperkalemi^için yakından incelenmelidir ^5,6,7. Renin, RAAS'taki hız sınırlama adımını katalize eder; anjiyotensinojeni anjiyotensin I'e dönüştürür. Aterosklerozda plak oluşumu, renin sekresyonunu yönlendiren renal arterin daralmasına neden olarak renovasküler hipertansiyon ve böbrek hasarı ile sonuçlanır⁸. Bir dizi çalışma, insanlarda renovasküler hipertansiyon sırasında oksidatif stres düzeylerinin arttığını bildirmiştir; bunlar, iki böbrek bir klip (2K1C) fare modelinin yanı sıra diğer hipertansif hayvan modelleri 2,9,10,11,12,13,14,15,16 ile doğrulanmıştır. . RAStenozise bağlı renovasküler hipertansiyon sırasında renin ekspresyon kontrolünün moleküler mekanizması iyi anlaşılmamıştır ve daha fazla araştırma gerektirmektedir.

RAStenosis'i güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde özetleyen deneysel hayvan modelleri, yeni tedavilerin geliştirilmesi için renin ekspresyon kontrolünün hücresel ve moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasında önemlidir. 2K1C fare modeli, renovasküler hipertansiyonun patogenezini incelemek için iyi kurulmuş bir deneysel modeldir^17,18,19,20. Bu model, 17,20,21 numaralı bir klips kullanılarak renal arterin daralmasıyla üretilir, bu nedenle renin ekspresyonunda ve hipertansiyonda ^{17,19,20,21'de} bir artışa neden olan renal arter tıkanıklığı üretir. Bununla birlikte, hayvan modellerinde renal arter darlığı oluşturmak için adım adım bir prosedürü tanımlayan teknik raporlar mevcut değildir.

Geleneksel U-şekilli gümüş klipsler, poliüretan tüpler ve diğer klipsler, renal arter darlığını indüklemek için renal arteri daraltmak için kullanılmıştır. Bazı çalışmalar, klibin tasarımının ve malzemesinin, 2K1C hayvan modeli ile güvenilir ve tekrarlanabilir veriler elde etmek için kritik öneme sahip olduğunu göstermiştir. Lorenz ve ark.'ya göre, geleneksel U-tasarımlı gümüş klipslerin kullanımı, düşük bir hipertansiyon başarı oranına neden olur (%40-60)²¹. Klips tasarımı nedeniyle, renal arter lateral olarak bastırılır, birkaç daralmayı tetikler ve renal arterden çıkma olasılığı daha yüksektir. Gümüş dövülebilirliği ve sünekliği, klips genişliklerinde değişikliklere izin verebilir; bu nedenle, fareler arasında farklı hipertansiyon seviyelerine neden olur. Klips üzerindeki gümüş dioksitler perivasküler inflamasyona, intimal proliferasyona ve doku granülasyonuna neden olarak renal arter çapı^22'yi değiştirebilir. Geleneksel U-design gümüş klips ile elde edilen hipertansiyon seviyelerindeki değişkenlik nedeniyle, Warner ve ark. ve Lorenz ve ark., farelerde renal arter darlığını başlatmak için yuvarlak tasarımlı bir poliüretan tüpü başarıyla kullanmış ve iki böbrek bir klips hayvan modeli ^20,21'in daha güvenilir ve tutarlı bir indüksiyonunu sağlamıştır.

Bu yazıda, renal arteri daraltmak için poliüretan tüpü kullanarak, farelerde deneysel RAStenoz oluşturmak için cerrahi bir protokol tanımlanmıştır. Poliüretan yuvarlak tasarımlı manşet, farede darlık oluşturmak için daha tekrarlanabilir, güvenilir ve düşük maliyetli bir klipstir. Bu deneysel modelin amacı, renal arter darlığı sırasında renin ekspresyon kontrolünün moleküler ve hücresel mekanizmasını incelemek ve tanımlamaktır. RAStenosis fareleri modelinin başarısını, renin ekspresyonu ve böbrek hasarı belirteci nötrofil jelatinaz ile ilişkili lipokalini (N-GAL) ölçerek doğruladık.

Protokol

Fareler, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) kılavuzlarını ve ABD Sağlık ve İnsan Hizmetleri Bakanlığı, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nu izleyerek Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi (VUMC) Hayvan Bakımı Bölümü'nde barındırıldı ve bakıldı. Tüm hayvan prosedürleri, deneylere başlamadan önce VUMC Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvan hazırlama ve diseksiyon

1. Ameliyata başlamadan yaklaşık 30 dakika önce ısıtma yastığının çimlendiricisini ve su pompasını açın.
2. 0,5 mm uzunluğunda poliüretan boruları keskin bir neşterle kesin. Bir manşet yapmak için uzunlamasına bir kesim yaparak çevrenin 0,2 mm'sini çıkarın.
   NOT: Bu, renal arter darlığı prosedürünün aşırı hassasiyet, detaylara dikkat ve sabır gerektiren kritik bir parçasıdır. Bir seferde birkaç parça poliüretan boru kesmeye çalışın. Tüm bu prosedürü mikroskop altında gerçekleştirin.
3. Daha fazla ilerlemeden önce, cerrahi steril eldivenler ve cerrahi maske takın.
4. 6-8 haftalık C57BL/6 vahşi tip (WT) fareler kullanın. Herhangi bir cinsiyet önyargısından kaçınmak için eşit sayıda erkek ve dişi fare kullanın.
5. Ameliyat yapmadan önce farelerin ağırlığını kaydedin. Poliüretan tüp ile renal arter darlığı yapmak için ideal ağırlık 18-22 g'dır. Fareleri nazikçe tutun ve anesteziyi enjekte ederken ajitasyon yapmayın. Ameliyat öncesi analjezi uygulayın (Ketofgen, 5 mg/kg vücut genişliği).
   NOT: Fareleri barınma odalarından ameliyat odasına aktarırken, ajitasyonu önlemek için onları büyük bir nezaket ve özenle taşıyın. Fare kafeslerinin bir araba yerine ellerde taşınması şiddetle tavsiye edilir.
6. Fareleri intraperitoneal (I.P.) enjeksiyonlar yoluyla ketamin (100 mg / kg BW) ve ksilazin (10 mg / kg BW) karışımı ile anestezi altına alın.
7. Tamamen anestezi uygulanana kadar fareyi kafesin içine geri yerleştirin. Farenin tamamen bilinçsiz hale gelmesi yaklaşık 4-5 dakika sürer. Farenin tamamen bilinçsiz ve ameliyat için hazır olup olmadığını kontrol etmek için kuyruğu veya ayak parmağını forseps ile sıkıştırın.
8. Fareyi sırt üstü bir kağıt havlunun üzerine koyun. Saç büyümesinin ters yönünü takip eden elektrikli bir saç kesme makinesi kullanarak lateral karın kıllarını çıkarın. Cerrahi bölgeyi tıraş ettikten sonra, bölgeyi iyot (veya klorheksidin) içeren cerrahi bir ovma ile temizleyin ve ardından% 70 etanol (veya steril salin) ile durulayın.  3 kez tekrarlayın.
   NOT: Epilasyon prosedürü, ameliyat prosedürü sırasında herhangi bir saç parazitini ve saç kontaminasyonunu önlemek için belirli bir mesafede veya tercihen cerrahi prosedür tezgahından farklı bir tezgahta yapılmalıdır.
9. Isıtma yastığını steril bir tabaka ile örtün. Fareyi cerrahi tezgaha getirin ve farenin sağ yan tarafına mikroskopa doğru bakacak şekilde steril tabakaya yerleştirin. Dolaşımdaki su ile 37 °C'lik sabit bir ped sıcaklığını koruyun.
10. Tüm cerrahi ekipmanı içeren sterilize edilmiş torbayı açın. Diseksiyon yapan bir mikroskop ve steril keskin makas kullanarak, küçük bir yan kesi (13. torasik kaburgaya yakın, faredeki son kaburga) ve omurlardan yaklaşık 0,5 cm uzakta yapın^. Bel omurları boyunca ilerleyin ve 1 inçlik bir kesi yapın.
11. Böbreği açığa çıkarmak için cildi ve kası geri çekin.
12. Renal arteri izole etmek için steril pamuklu çubuklar kullanarak çevredeki yağları temizleyin ve çıkarın. Kavisli forseps kullanarak renal siniri renal arterden izole edin.
13. Sahte ameliyatı gerçekleştirirken, cildi kapatmak için dikişler uygulayın ve kapalı yaraya antibiyotik uygulayın, ardından ameliyat sonrası bakıma devam edin. Değilse, arteri stenose etmek için aşağıdaki bölüme devam edin.
    NOT: Her deney, cerrahi prosedürün kontrolleri olarak sahte hayvanlara sahip olmalıdır. Şam hayvanları, üzerine bir manşet yerleştirmeden renal arteri açığa çıkarmanın cerrahi prosedüründen geçen farelerden oluşur.

2. Sağ renal arter darlığı

1. Sağ renal arterin altına iki naylon sütür yerleştirin, gevşek düğümler yapın ve ardından manşeti ana renal arterin etrafına böbrek ve aort bifurkasyonu arasında yaklaşık olarak eşit mesafeye yerleştirin.
2. Naylon dikişleri kullanarak manşeti kapatın. Ameliyattan sonra dikişleri kaybetme olasılığını önlemek için her dikiş için dört düğüm yapın.
3. Basit bir sürekli dikiş uygulayarak kastaki kesiyi kapatın.
4. Cildi kapatmak için basit kesilmiş dikişler yapın.
5. IACUC onaylı analjezikleri uygulayın.
   NOT: Her kullanımdan önce otoklav cerrahi aletleri. Aynı anda birden fazla ameliyat yapılıyorsa, kullanılan tüm aletleri steril bir alkol göstergesi ile silin ve her ameliyattan sonra 15-30 sn boyunca sıcak çimlendiriciye yerleştirin. Her fare için steril eldivenleri de değiştirin.

3. Ameliyat sonrası bakım

1. Fareleri kafeslerine geri döndürün ve kafesi yarı açık, yarı kapalı, 2-3 saat boyunca dolaşımdaki bir su ısıtma yastığı olarak bırakın. Kafesin içine jel diyet kurtarma yiyecekleri ekleyin.
2. Ağrı kesici (ketoprofen) ertesi gün intraperitoneal olarak (doz: 5 mg / kg BW) uygulayın.
3. Fareleri önümüzdeki iki gün boyunca tartın; Bazı fareler ağırlıklarının% 20'sinden fazlasını kaybederse veterinere danışın ve uygun IACUC yetkili prosedürünü takiben hayvanın ötenazi yapılması gerekip gerekmediğine karar verin.
4. Kızarıklık, şişlik, ağrı veya enfeksiyon açısından değerlendirmek için fareleri günlük olarak izleyin.
5. Kurumsal IACUC politikalarına uygun olarak postoperatif komplikasyonlar için veteriner konsültasyonu isteyin.

4. Doku hasadı

1. Cerrahi işlemden 3 hafta sonra doku hasadı. Her farenin ağırlığını kaydedin.
2. IACUC onaylı bir prosedürle fareyi ötenazileştirin.
3. Fareyi steril bir platforma diseksiyon yapmak için sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
4. Hareketi sınırlamak için uzuvları sabitleyin ve uzatın.
5. Farelere% 70 etanol ile iyice püskürtün.
6. Keskin makas kullanarak karın ve göğüs bölgesini açmak için orta hat kesisi yapın.
7. Cildi ve periton duvarını geri çekin.
8. Kalbi dikkatlice ortaya çıkarın ve sağ ventrikülü delin ve fareyi exsanguinate edin.
9. Forseps kullanarak her iki böbreği de çıkarın. Böbrekler farelerin arkasında bulunur.
   NOT: Her iki böbreği de karıştırmayın. Stelsezli, sahte ve kontralateral böbreklerin farkında olun.
10. Böbrek kapsülünü çıkarın, herhangi bir yağdan temizleyin ve her böbreğin ağırlığını ayrı ayrı kaydedin.
11. Her iki böbreğin uzunlamasına bir bölümünü kesin ve daha sonra parafin gömme için işlenmek, in situ hibridizasyon (ISH) ve immünohistokimya (IHC) gerçekleştirmek için 4 ° C'de bir gecede% 4 PFA'ya sabitlenir. ISH ve IHC protokollerini rapor edildiği gibi takip edin^23,24.
12. Kalan böbreğin korteksini izole edin ve batı lekesini gerçekleştirmek için sıvı azotta dondurun. Numuneleri analize kadar -80 °C'de saklayın.
13. Renin ve N-GAL ifadelerini literatür^23,24'te tanımlandığı gibi Batı lekesi ile sayısallaştırın.

5. İstatistik

1. Üç veya daha fazla koşullu deneyler için tek yönlü veya iki yönlü ANOVA'yı kullanın, ardından bireysel gruplar arasındaki karşılaştırmalar için Bonferroni post-hoc testleri yapın. 0,05'e eşit veya daha küçük bir p değerinin önemli olduğunu düşünün. Tüm istatistiksel analizleri yapmak için yazılım kullanın (örneğin, GraphPad Prism 8.2).

Sonuçlar

Renal arter daralması, stenozlu böbrekte renin ekspresyonunu arttırırken, kontralateral böbrekte ekspresyonu baskılar. İki böbrek bir klip (2K1C) veya Goldblatt stenoz modeli, artmış renin ekspresyonuna ve böbrek hasarına neden olur. Bu, insanlarda tek taraflı renal arter darlığının en iyi temsili modeli olarak kabul edilmektedir.

Renin ve prorenin ekspresyonu (renin öncüsü) immünoblotlama kullanılarak ölçüldü. Veriler, renin ve prorenin ekspresyonunun stenozlu böbr...

Tartışmalar

Renal arter darlığı, sekonder veya dirençli hipertansiyonun ve böbrek hasarının ^1,29'unun önemli bir nedenidir. İki böbrek bir klip (2K1C) Goldblatt modeli, RAStenozise bağlı renovasküler hipertansiyonu^1,17,18,19 incelemek için kullanılmıştır. Çeşitli hayvan modellerini kullanan bir dizi önceki çalışma, renal art...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diet Gel	Clear H2O	Diet-Gel 76A	Surgery recovery diet
EMC Heated Hard pad	Hallowell	000A2788B	Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	662G	4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815 G	8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500	Braintree Scientific Inc.	GER 5287	Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen	Zoetis	Ketofen	Painkiller
Polyurethane	Braintree Scientific Inc.	MRE-025	This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks	Medline	MDS093901	It was applied after hair removal and surgery on the skin
Reflex 7 Clip Applier	Roboz Surgical Instrument Co	204-1000	This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off
Sterile towel drapes	Dynarex	4410	It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment	Medi-First	22312
Water pump	Stryker	T/pump Professionals	Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery