Un modello di topo modificato a due rene una clip della regolazione della renina nella stenosi dell'arteria renale

Riepilogo

Un modello murino Goldblatt modificato a 2 rene 1 clip (2K1C) è stato sviluppato utilizzando tubi in poliuretano per avviare la stenosi dell'arteria renale, inducendo un aumento dell'espressione della renina e un danno renale. Qui, descriviamo una procedura dettagliata di preparazione e posizionamento del bracciale sull'arteria renale per generare un modello murino 2K1C riproducibile e coerente.

Abstract

La stenosi dell'arteria renale è una condizione comune nei pazienti con malattia coronarica o vascolare periferica in cui il sistema renina-angiotensina aldosterone (RAAS) è iperattivato. In questo contesto, c'è un restringimento delle arterie renali che stimola un aumento dell'espressione e del rilascio di renina, la proteasi limitante nella RAAS. Il conseguente aumento dell'espressione della renina è un noto driver dell'ipertensione renovascolare, frequentemente associata a danno renale e danno agli organi terminali. Pertanto, vi è un grande interesse nello sviluppo di nuovi trattamenti per questa condizione. Il meccanismo molecolare e cellulare del controllo della renina nella stenosi dell'arteria renale non è completamente compreso e merita ulteriori indagini. Per indurre la stenosi dell'arteria renale nei topi, è stato sviluppato un modello murino Goldblatt modificato 2 rene 1 clip (2K1C). Il rene destro è stato stenoso in topi wild type e topi operati fittizi sono stati utilizzati come controllo. Dopo la stenosi dell'arteria renale, abbiamo determinato l'espressione della renina e il danno renale. I reni sono stati raccolti e sono state utilizzate cortecce fresche per determinare l'espressione di proteine e mRNA della renina. Questo modello animale è riproducibile e può essere utilizzato per studiare le risposte fisiopatologiche, le vie molecolari e cellulari coinvolte nell'ipertensione renovascolare e nel danno renale.

Introduzione

La stenosi dell'arteria renale (RAStenosis) è un problema intrattabile che colpisce circa il 6% delle persone sopra i 65 anni e fino al 40% delle persone con malattia coronarica o vascolare periferica ^1,2. I trattamenti attuali per la malattia sono limitati; pertanto, vi è una necessità critica di sviluppare nuove terapie per trattare l'ipertensione renovascolare o l'ipertensione resistente indotta da RAStenosis. Il sistema dell'angiotensina aldosterone renina (RAAS) è la via chiave coinvolta nella patogenesi dell'ipertensione indotta da RAStenosi o dell'ipertensione renovascolare ^3,4. Le terapie note che prendono di mira la RAAS, come gli ACE-inibitori o i bloccanti del recettore dell'angiotensina, alleviano l'ipertensione, ma richiedono un attento esame per insufficienza renale e iperkaliemia ^5,6,7. La renina catalizza la fase limitante del tasso in RAAS; converte l'angiotensinogeno in angiotensina I. Nell'aterosclerosi, la formazione di placche provoca il restringimento dell'arteria renale che guida la secrezione di renina, con conseguente ipertensione renovascolare e danno renale⁸. Numerosi studi hanno riportato un aumento dei livelli di stress ossidativo durante l'ipertensione renovascolare nell'uomo, che sono stati corroborati con il modello di topi a due rene una clip (2K1C) e altri modelli animali ipertesi 2,9,10,11,12,13,14,15,16 . Il meccanismo molecolare del controllo dell'espressione della renina durante l'ipertensione renovascolare indotta da RAStenosi non è ben compreso e giustifica ulteriori indagini.

Modelli animali sperimentali che ricapitolano RAStenosi in modo affidabile e riproducibile sono importanti per chiarire i meccanismi cellulari e molecolari del controllo dell'espressione della renina per lo sviluppo di nuove terapie. Il modello murino 2K1C è un modello sperimentale consolidato per studiare la patogenesi dell'ipertensione renovascolare^17,18,19,20. Questo modello è generato dalla costrizione dell'arteria renale utilizzando una clip 17,20,21, producendo quindi occlusione dell'arteria renale che si traduce in un aumento dell'espressione della renina e ipertensione^17,19,20,21. Tuttavia, non ci sono relazioni tecniche disponibili, che descrivono una procedura passo passo per generare stenosi dell'arteria renale in modelli animali.

Clip d'argento convenzionali a forma di U, tubi in poliuretano e altre clip sono stati utilizzati per restringere l'arteria renale per indurre la stenosi dell'arteria renale. Alcuni studi hanno dimostrato che il design e il materiale della clip sono fondamentali per ottenere dati affidabili e riproducibili con il modello animale 2K1C. Secondo Lorenz et al., l'uso di clip d'argento convenzionali progettate a U induce un basso tasso di successo di ipertensione (40-60%)²¹. A causa del design della clip, l'arteria renale viene premuta lateralmente, innescando alcune costrizioni e una maggiore probabilità di essere spostata dall'arteria renale. La malleabilità e la duttilità dell'argento possono consentire variazioni nella larghezza delle clip; pertanto, causando diversi livelli di ipertensione tra i topi. I biossidi d'argento sulla clip possono causare infiammazione perivascolare, proliferazione intimale e granulazione dei tessuti, alterando il diametro dell'arteria renale²². A causa della variabilità dei livelli di ipertensione ottenuti con la clip d'argento convenzionale U-design, Warner et al. e Lorenz et al. hanno utilizzato con successo un tubo in poliuretano dal design più rotondo per iniziare la stenosi dell'arteria renale nei topi, generando un'induzione più affidabile e coerente del modello animale a due rene una clip^20,21.

In questo rapporto, descriviamo un protocollo chirurgico per generare RAStenosi sperimentale nei topi, utilizzando il tubo di poliuretano per restringere l'arteria renale. Il polsino rotondo in poliuretano è una clip più riproducibile, affidabile e a basso costo per generare stenosi nel mouse. L'obiettivo di questo modello sperimentale è quello di studiare e definire il meccanismo molecolare e cellulare del controllo dell'espressione della renina durante la stenosi dell'arteria renale. Abbiamo confermato il successo del modello di topi RAStenosis misurando l'espressione della renina e il marcatore di danno renale lipocalina associata alla gelatinasi neutrofila (N-GAL).

Protocollo

I topi sono stati ospitati e curati presso la Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Division of Animal Care seguendo le linee guida del National Institutes of Health (NIH) e la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, Dipartimento della salute e dei servizi umani degli Stati Uniti. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal VUMC Institutional Animal Care and Use Committee prima di iniziare gli esperimenti.

1. Preparazione e dissezione degli animali

1. Accendere il germinatore e la pompa dell'acqua della piastra riscaldante circa 30 minuti prima di iniziare l'intervento chirurgico.
2. Tagliare tubi in poliuretano lunghi 0,5 mm con un bisturi affilato. Rimuovere 0,2 mm della circonferenza facendo un taglio longitudinale per fare un polsino.
   NOTA: Questa è una parte critica della procedura di stenosi dell'arteria renale che richiede estrema precisione, attenzione ai dettagli e pazienza. Prova a tagliare diversi pezzi di tubi di poliuretano alla volta. Eseguire tutta questa procedura al microscopio.
3. Prima di procedere oltre, indossare guanti chirurgici sterili e una maschera chirurgica.
4. Utilizzare topi C57BL / 6 wild-type (WT) di 6-8 settimane. Utilizzare un numero uguale di topi maschi e femmine per evitare qualsiasi pregiudizio sessuale.
5. Registra il peso dei topi prima di eseguire un intervento chirurgico. Il peso ideale per eseguire la stenosi dell'arteria renale con tubo in poliuretano è 18-22 g. Maneggiare i topi delicatamente e non agitare durante l'iniezione dell'anestesia. Somministrare l'analgesia preoperatoria (Ketofgen, 5 mg/kg di larghezza corporea).
   NOTA: Durante il trasferimento dei topi dalla loro stanza di alloggio alla sala operatoria, portarli con grande delicatezza e cura per evitare agitazione. Si consiglia vivamente di portare gabbie per topi in mano invece di un carrello.
6. Anestetizzare i topi con una miscela di ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) tramite iniezioni intraperitoneali (I.P.).
7. Riposizionare il mouse all'interno della gabbia fino a completa anestetizzazione. Ci vogliono circa 4-5 minuti prima che il mouse sia completamente incosciente. Pizzicare la coda o la punta del piede con una pinza per verificare se il topo è completamente incosciente e pronto per l'intervento chirurgico.
8. Appoggia il mouse sulla schiena su un tovagliolo di carta. Rimuovere i peli dell'addome laterale utilizzando un tagliacapelli elettrico seguendo la direzione opposta della crescita dei capelli. Dopo aver rasato il sito chirurgico, pulire l'area con uno scrub chirurgico contenente iodio (o clorexidina) seguito da un risciacquo con etanolo al 70% (o soluzione salina sterile).  Ripeti 3 volte.
   NOTA: La procedura di depilazione deve essere eseguita a una certa distanza o preferibilmente su un banco diverso rispetto al banco della procedura chirurgica per evitare interferenze e contaminazione dei capelli durante la procedura chirurgica.
9. Coprire la piastra riscaldante con un foglio sterile. Portare il topo al banco chirurgico e posizionarlo sul foglio sterile, rivolto verso il lato laterale destro del topo verso il microscopio. Mantenere una temperatura costante del tampone di 37 °C con acqua circolante.
10. Aprire la sacca sterilizzata contenente tutte le attrezzature chirurgiche. Utilizzando un microscopio da dissezione e forbici sterili taglienti, fare una piccola incisione sul fianco (vicino alla 13a^costola toracica, l'ultima costola nel topo) e a circa 0,5 cm di distanza dalle vertebre. Procedere lungo le vertebre lombari e fare un'incisione di 1 pollice.
11. Tirare indietro la pelle e il muscolo per esporre il rene.
12. Pulire e rimuovere il grasso circostante utilizzando tamponi di cotone sterili per isolare l'arteria renale. Isolare il nervo renale dall'arteria renale usando una pinza curva.
13. Quando si esegue l'intervento chirurgico fittizio, applicare punti di sutura per chiudere la pelle e applicare antibiotici alla ferita chiusa, quindi procedere alla cura post-operatoria. In caso contrario, procedere con la sezione seguente per stenosare l'arteria.
    NOTA: Ogni esperimento dovrebbe avere animali fittizi come controlli della procedura chirurgica. Gli animali fittizi sono costituiti da topi che hanno attraversato la procedura chirurgica di esporre l'arteria renale senza posizionare un bracciale su di essa.

2. Stenosi dell'arteria renale destra

1. Posizionare due suture di nylon sotto l'arteria renale destra, sciogliere i nodi e quindi posizionare il bracciale attorno all'arteria renale principale approssimativamente equidistante tra il rene e la biforcazione dell'aorta
2. Chiudere il bracciale usando le suture di nylon. Fai quattro nodi per ogni sutura per evitare la probabilità di perdere le suture dopo l'intervento.
3. Chiudere l'incisione nel muscolo applicando una semplice sutura continua.
4. Fai semplici punti di sutura interrotti per chiudere la pelle.
5. Somministrare analgesici approvati dalla IACUC.
   NOTA: Strumenti chirurgici in autoclave prima di ogni utilizzo. Se viene eseguito più di un intervento chirurgico contemporaneamente, pulire tutti gli strumenti usati con un indicatore alcolico sterile e metterli in un germinatore caldo per 15-30 secondi dopo ogni intervento chirurgico. Cambiare guanti sterili anche per ogni topo.

3. Assistenza post-operatoria

1. Riportare i topi nella loro gabbia e lasciare la gabbia metà accesa, metà spenta, una piastra riscaldante ad acqua circolante per 2 - 3 ore. Aggiungi cibo per il recupero della dieta gel all'interno della gabbia.
2. Somministrare antidolorifico (ketoprofene) per via intraperitoneale (dose: 5 mg/kg p.c.) il giorno successivo.
3. Pesare i topi per i prossimi due giorni; se alcuni topi perdono più del 20% del loro peso, consultarsi con il veterinario e decidere se l'animale deve essere eutanasia seguendo l'appropriata procedura autorizzata IACUC.
4. Monitorare i topi ogni giorno per valutare arrossamento, gonfiore, dolore o infezione.
5. Cercare un consulto veterinario per le complicanze postoperatorie in conformità con le politiche istituzionali IACUC.

4. Raccolta dei tessuti

1. Raccogliere il tessuto 3 settimane dopo la procedura chirurgica. Registra il peso di ciascun mouse.
2. Eutanasia del mouse con una procedura approvata IACUC.
3. Posizionare il mouse su una piattaforma sterile in posizione supina per sezionare.
4. Fissare ed estendere gli arti per limitare i movimenti.
5. Spruzzare accuratamente i topi con etanolo al 70%.
6. Fai un'incisione della linea mediana per aprire l'addome e la zona del torace usando forbici affilate.
7. Tirare indietro la pelle e la parete peritoneale.
8. Esporre attentamente il cuore e perforare il ventricolo destro ed essanguare il topo.
9. Rimuovere entrambi i reni usando una pinza. I reni si trovano sul retro dei topi.
   NOTA: Non mescolare entrambi i reni. Essere consapevoli dei reni stenosi, finti e controlaterali.
10. Rimuovere la capsula renale, pulirli da qualsiasi grasso e registrare il peso di ciascun rene separatamente.
11. Tagliare una sezione longitudinale di entrambi i reni e fissarla in PFA al 4% durante la notte a 4 °C per essere successivamente elaborata per l'incorporazione di paraffina, per eseguire l'ibridazione in situ (ISH) e l'immunoistochimica (IHC). Seguire i protocolli ISH e IHC come riportato^23,24.
12. Isolare la corteccia del rene rimanente e congelare l'azoto liquido per eseguire il western blot. Conservare i campioni a -80 °C fino all'analisi.
13. Quantificare le espressioni di renina e N-GAL con Western blot come descritto in letteratura^23,24.

5. Statistiche

1. Utilizzare ANOVA unidirezionale o bidirezionale per esperimenti con tre o più condizioni seguiti da test post-hoc Bonferroni per confronti tra singoli gruppi. Si consideri un valore p uguale o minore di 0,05 significativo. Utilizzare un software (ad esempio, GraphPad Prism 8.2) per eseguire tutte le analisi statistiche.

Risultati

La costrizione dell'arteria renale aumenta l'espressione della renina nel rene stenoso mentre reprime l'espressione nel rene controlaterale. Il modello di stenosi a due rene una clip (2K1C) o Goldblatt induce un aumento dell'espressione di renina e danno renale. Questo è riconosciuto come il miglior modello rappresentativo di stenosi unilaterale dell'arteria renale nell'uomo.

L'espressione di renina e prorenina (precursore della renina) è stata misurata utilizzando immunoblotting. I dati mo...

Discussione

La stenosi dell'arteria renale è una causa importante di ipertensione secondaria o resistente e danno renale ^1,29. Il modello Goldblatt a due rene una clip (2K1C) è stato impiegato per studiare l'ipertensione renovascolare indotta da RAStenosi 1,17,18,19. Numerosi studi precedenti che utilizzano vari modelli animali hanno dimostrato c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diet Gel	Clear H2O	Diet-Gel 76A	Surgery recovery diet
EMC Heated Hard pad	Hallowell	000A2788B	Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	662G	4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815 G	8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500	Braintree Scientific Inc.	GER 5287	Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen	Zoetis	Ketofen	Painkiller
Polyurethane	Braintree Scientific Inc.	MRE-025	This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks	Medline	MDS093901	It was applied after hair removal and surgery on the skin
Reflex 7 Clip Applier	Roboz Surgical Instrument Co	204-1000	This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off
Sterile towel drapes	Dynarex	4410	It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment	Medi-First	22312
Water pump	Stryker	T/pump Professionals	Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery