Модифицированная модель регуляции ренина при стенозе почечной артерии

Резюме

Модифицированная модель мыши Голдблатта с 2 почками (2K1C) была разработана с использованием полиуретановых трубок для инициирования стеноза почечной артерии, вызывающего увеличение экспрессии ренина и повреждение почек. Здесь мы описываем подробную процедуру подготовки и размещения манжеты на почечной артерии для создания воспроизводимой и последовательной мышиной модели 2K1C.

Аннотация

Стеноз почечной артерии является распространенным состоянием у пациентов с коронарными или периферическими сосудистыми заболеваниями, когда ренин-ангиотензин альдостероновая система (RAAS) чрезмерно активирована. В этом контексте наблюдается сужение почечных артерий, которые стимулируют увеличение экспрессии и высвобождения ренина, ограничивающего скорость протеазы при РААС. Результирующее повышение экспрессии ренина является известным фактором реноваскулярной гипертензии, часто связанной с повреждением почек и повреждением конечных органов. Таким образом, существует большой интерес к разработке новых методов лечения этого состояния. Молекулярный и клеточный механизм контроля ренина при стенозе почечной артерии не полностью понят и требует дальнейшего изучения. Чтобы вызвать стеноз почечной артерии у мышей, была разработана модифицированная модель мыши Goldblatt с 2 почками (2K1C). Правая почка была стенозирована у мышей дикого типа, а мыши с фиктивной операцией использовались в качестве контроля. После стеноза почечной артерии мы определили экспрессию ренина и повреждение почек. Почки были собраны, и свежие коры были использованы для определения экспрессии белка и мРНК ренина. Эта животная модель воспроизводима и может быть использована для изучения патофизиологических реакций, молекулярных и клеточных путей, участвующих в реноваскулярной гипертензии и повреждении почек.

Введение

Стеноз почечной артерии (RAStenosis) является трудноразрешимой проблемой, затрагивающей около 6% людей старше 65 лет и до 40% людей с ишемической или периферической сосудистой болезнью ^1,2. Современные методы лечения заболевания ограничены; поэтому существует острая необходимость в разработке новых методов лечения реноваскулярной гипертензии или резистентной гипертензии, вызванной РАСтенозом. Ренин ангиотензин альдостероновая система (РААС) является ключевым путем, участвующим в патогенезе индуцированной РАСтенозом гипертонии или реноваскулярной гипертензии ^3,4. Известные методы лечения, нацеленные на РААС, такие как ингибиторы АПФ или блокаторы рецепторов ангиотензина, облегчают гипертонию, но нуждаются в тщательном изучении на предмет почечной недостаточности и гиперкалиемии ^5,6,7. Ренин катализирует стадию ограничения скорости при РААС; превращает ангиотензиноген в ангиотензин I. При атеросклерозе образование бляшек вызывает сужение почечной артерии, что приводит к секреции ренина, что приводит к реноваскулярной гипертензии и повреждению почек⁸. В ряде исследований сообщалось о повышении уровня окислительного стресса во время реноваскулярной гипертензии у людей, которые были подтверждены моделью двух мышей с одной почкой (2K1C), а также другими гипертоническими моделями животных ^{2,9,10,11,12,13,14,15,16} . Молекулярный механизм контроля экспрессии ренина при реноваскулярной гипертензии, вызванной РАСтенозом, недостаточно изучен и требует дальнейшего изучения.

Экспериментальные модели на животных, которые надежно и воспроизводимо рекапитулируют RAStenosis, важны для выяснения клеточных и молекулярных механизмов контроля экспрессии ренина для разработки новых методов лечения. Мышиная модель 2K1C является хорошо зарекомендовавшей себя экспериментальной моделью для изучения патогенеза реноваскулярной гипертензии ^17,18,19,20. Эта модель генерируется сужением почечной артерии с использованием^{клипсы 17,20,21}, что приводит к окклюзии почечной артерии, что приводит к увеличению экспрессии ренина и гипертонии 17,19,20,21. Тем не менее, нет доступных технических отчетов, которые описывают пошаговую процедуру для создания стеноза почечной артерии на животных моделях.

Обычные U-образные серебряные клипсы, полиуретановые трубки и другие клипсы использовались для сужения почечной артерии, чтобы вызвать стеноз почечной артерии. Некоторые исследования показали, что конструкция и материал клипа имеют решающее значение для получения надежных и воспроизводимых данных с помощью животной модели 2K1C. По данным Lorenz et al., использование обычных U-образных серебряных клипс вызывает низкий уровень успеха гипертонии (40-60%)²¹. Из-за клипсовой конструкции почечная артерия прессуется сбоку, вызывая несколько сужений и большую вероятность смещения из почечной артерии. Податливость и пластичность серебра могут привести к изменению ширины зажима; следовательно, вызывая различные уровни гипертонии среди мышей. Диоксиды серебра на клипсе могут вызывать периваскулярное воспаление, интимальную пролиферацию и грануляцию тканей, изменяя диаметр почечной артерии²². Из-за изменчивости уровней гипертонии, полученных с помощью обычного серебряного клипа U-design, Warner et al. и Lorenz et al. успешно использовали полиуретановую трубку круглой конструкции для инициирования стеноза почечной артерии у мышей, генерируя более надежную и последовательную индукцию двух почек с одним клипом животной модели^20,21.

В этом отчете мы описываем хирургический протокол для генерации экспериментального RAStenosis у мышей, используя полиуретановые трубки для сужения почечной артерии. Полиуретановая манжета круглой конструкции является более воспроизводимым, надежным и недорогим зажимом для создания стеноза у мышей. Целью данной экспериментальной модели является изучение и определение молекулярно-клеточного механизма контроля экспрессии ренина при стенозе почечной артерии. Мы подтвердили успех модели RAStenosis на мышах, измерив экспрессию ренина и маркер повреждения почек нейтрофильной желатиназой-ассоциированный липокалин (N-GAL).

протокол

Мыши содержались и ухаживали за ними в Отделе по уходу за животными Медицинского центра Университета Вандербильта (VUMC) в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения (NIH) и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Министерства здравоохранения и социальных служб США. Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию VUMC до начала экспериментов.

1. Подготовка и вскрытие животных

1. Включите проращиватель и водяной насос грелки примерно за 30 минут до начала операции.
2. Нарежьте полиуретановые трубки длиной 0,5 мм острым скальпелем. Удалите 0,2 мм окружности, сделав разрез вдоль, чтобы сделать манжету.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это важная часть процедуры стеноза почечной артерии, которая требует предельной точности, внимания к деталям и терпения. Попробуйте разрезать несколько кусков полиуретановой трубки за один раз. Выполните всю эту процедуру под микроскопом.
3. Прежде чем продолжить дальше, наденьте хирургические стерильные перчатки и хирургическую маску.
4. Используйте C57BL/6 мышей дикого типа (WT) 6-8 недель. Используйте равное количество самцов и самок мышей, чтобы избежать какой-либо сексуальной предвзятости.
5. Запишите вес мышей перед выполнением операции. Идеальный вес для выполнения стеноза почечной артерии с полиуретановой трубкой составляет 18-22 г. Обращайтесь с мышами осторожно и не перемешивайте во время инъекции анестезии. Вводят предоперационную анальгезию (Кетофген, 5 мг/кг тела).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перенося мышей из их комнаты в операционную, переносите их с большой мягкостью и осторожностью, чтобы избежать возбуждения. Настоятельно рекомендуется носить клетки для мышей в руках вместо тележки.
6. Анестезируйте мышей смесью кетамина (100 мг/кг BW) и ксилазина (10 мг/кг BW) с помощью внутрибрюшинных (I.P.) инъекций.
7. Поместите мышь обратно в клетку до полного обезболивания. Проходит около 4-5 минут, прежде чем мышь полностью потеряет сознание. Зажмите хвост или палец ноги щипцами, чтобы проверить, находится ли мышь полностью без сознания и готова ли она к операции.
8. Положите мышь на спину на бумажное полотенце. Удалите волосы бокового живота с помощью электрической машинки для стрижки волос, следуя противоположному направлению роста волос. После бритья места операции очистите область хирургическим скрабом, содержащим йод (или хлоргексидин), с последующим полосканием 70% этанолом (или стерильным физиологическим раствором).  Повторите 3 раза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура удаления волос должна выполняться на некотором расстоянии или предпочтительно на другой скамье, чем на скамейке хирургических процедур, чтобы избежать любого вмешательства в волосы и загрязнения волос во время хирургической процедуры.
9. Накройте грелку стерильным листом. Поднесите мышь к хирургической скамье и положите на стерильный лист, повернувшись лицом к правой боковой стороне мыши к микроскопу. Поддерживайте постоянную температуру прокладки 37 °C с циркулирующей водой.
10. Откройте стерилизованный пакет, содержащий все хирургическое оборудование. Используя рассекающий микроскоп и стерильные острые ножницы, делают небольшой разрез пашины (близкое к^{13-му грудному} ребру, последнее ребро у мыши) и примерно в 0,5 см от позвонков. Пройдите вдоль поясничных позвонков и сделайте 1-дюймовый разрез.
11. Оттяните кожу и мышцы, чтобы обнажить почки.
12. Очистите и удалите окружающий жир с помощью стерильных ватных тампонов для изоляции почечной артерии. Изолируйте почечный нерв от почечной артерии с помощью изогнутых щипцов.
13. При выполнении фиктивной операции наложите швы, чтобы закрыть кожу и приложить антибиотик к закрытой ране, затем приступайте к послеоперационному уходу. Если нет, перейдите к следующему разделу, чтобы стенозировать артерию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В каждом эксперименте должны быть фиктивные животные в качестве контроля хирургической процедуры. Фиктивные животные состоят из мышей, которые прошли через хирургическую процедуру обнажения почечной артерии, не наложив на нее манжету.

2. Стеноз правой почечной артерии

1. Поместите два нейлоновых шва под правую почечную артерию, сделайте свободные узлы, а затем поместите манжету вокруг главной почечной артерии, примерно равноудаленной между почкой и бифуркацией аорты.
2. Закройте манжету нейлоновыми швами. Сделайте четыре узла для каждого шва, чтобы избежать вероятности потери швов после операции.
3. Закройте разрез в мышце, наложив простой непрерывный шов.
4. Сделайте простые прерванные швы, чтобы закрыть кожу.
5. Назначать одобренные IACUC анальгетики.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклавные хирургические инструменты перед каждым использованием. Если одновременно проводится более одной операции, протрите все использованные инструменты стерильным спиртовым датчиком и поместите их в горячий проращиватель на 15-30 с после каждой операции. Смените стерильные перчатки также для каждой мыши.

3. Послеоперационный уход

1. Верните мышей в клетку и оставьте клетку наполовину включенной, наполовину выключенной, циркулирующей водяной грелкой на 2 - 3 часа. Добавьте гелевую диету восстановительной пищи внутрь клетки.
2. Вводят обезболивающее (кетопрофен) внутрибрюшинно (доза: 5 мг/кг BW) на следующий день.
3. Взвешивайте мышей в течение следующих двух дней; если некоторые мыши теряют более 20% своего веса, проконсультируйтесь с ветеринаром и решите, нужно ли усыплять животное в соответствии с соответствующей разрешенной процедурой IACUC.
4. Ежедневно контролируйте мышей, чтобы оценить покраснение, отек, боль или инфекцию.
5. Обратитесь за ветеринарной консультацией при послеоперационных осложнениях в соответствии с институциональной политикой IACUC.

4. Сбор ткани

1. Заготавливают ткань через 3 недели после хирургической процедуры. Запишите вес каждой мыши.
2. Усыплите мышь с помощью процедуры, одобренной IACUC.
3. Поместите мышь на стерильную платформу в лежачее положение для рассечения.
4. Закрепите и вытяните конечности, чтобы ограничить движение.
5. Тщательно опрыскайте мышей 70% этанолом.
6. Сделайте разрез средней линии, чтобы открыть область живота и груди с помощью острых ножниц.
7. Оттяните кожу и брюшинную стенку.
8. Осторожно обнажите сердце и проколите правый желудочек и отшлифуйте мышь.
9. Удалите обе почки с помощью щипцов. Почки расположены на спине мышей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не смешивайте обе почки. Помните о стенозированных, фиктивных и контралатеральных почках.
10. Удалите почечные капсулы, очистите их от любого жира и запишите вес каждой почки отдельно.
11. Вырежьте продольный участок обеих почек и зафиксируйте в 4% PFA на ночь при 4 °C, чтобы затем обработать для встраивания парафина, для выполнения гибридизации in situ (ISH) и иммуногистохимии (IHC). Следовать протоколам ISH и IHC, как сообщалось^23,24.
12. Изолируйте кору оставшейся почки и мгновенно заморозьте в жидком азоте, чтобы выполнить вестерн-блоттинг. Храните образцы при температуре -80 °C до анализа.
13. Количественная оценка выражений ренина и N-GAL с помощью вестерн-блотта, как описано в ^{литературе 23,24}.

5. Статистика

1. Используйте одностороннюю или двустороннюю ANOVA для экспериментов с тремя или более условиями, за которыми следуют пост-специальные тесты Бонферрони для сравнения между отдельными группами. Рассмотрим p-значение, равное или меньшее 0,05 значимого. Используйте программное обеспечение (например, GraphPad Prism 8.2) для выполнения всего статистического анализа.

Результаты

Сужение почечной артерии увеличивает экспрессию ренина в стенозированной почке, одновременно подавляя экспрессию в контралатеральной почке. Модель стеноза с двумя почками (2K1C) или Модель стеноза Голдблатта вызывает повышенную экспрессию ренина и повреждение почек. Это признано лучш...

Обсуждение

Стеноз почечной артерии является важной причиной вторичной или резистентной гипертонии и повреждения почек ^1,29. Модель Голдблатта с двумя почками (2K1C) была использована для изучения реноваскулярной гипертензии^, вызванной RAStenosis 1,17,18,19....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diet Gel	Clear H2O	Diet-Gel 76A	Surgery recovery diet
EMC Heated Hard pad	Hallowell	000A2788B	Heating pads were used to keep mice warm
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	662G	4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin
Ethilon Nylon Suture	Ethicon	2815 G	8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery
Germinator 500	Braintree Scientific Inc.	GER 5287	Sterilize surgical tools between surgeries
Ketoprofen	Zoetis	Ketofen	Painkiller
Polyurethane	Braintree Scientific Inc.	MRE-025	This tube was used to initiate stenosis
Povidone-iodine antiseptic swabsticks	Medline	MDS093901	It was applied after hair removal and surgery on the skin
Reflex 7 Clip Applier	Roboz Surgical Instrument Co	204-1000	This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off
Sterile towel drapes	Dynarex	4410	It was used as a bedsheet for mice during surgery
Triple antibiotic ointment	Medi-First	22312
Water pump	Stryker	T/pump Professionals	Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery