JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הטוהר והיושרה של ה-RNA המבודד הוא צעד חיוני בהתלות RNA. כאן, אנו מציגים שיטה מעשית, מהירה וזולה כדי לחלץ RNA מכמות קטנה של רקמת הלבלב שלא ניזוקה.

Abstract

ללא קשר לשיטת החילוץ, מיצוי RNA אופטימיזציה של רקמות וקווי תאים מתבצעים בארבעה שלבים: 1) הומוגניזציה, 2) denaturization יעיל של חלבונים מ RNA, 3) אי-הפעלה ריבונוקלאז, ו 4) הסרת זיהום מ-DNA, חלבונים, ופחמימות. עם זאת, זה מאוד מייגע כדי לשמור על שלמות RNA כאשר יש רמות גבוהות של RNase ברקמה. Autolysis ספונטני עושה את זה קשה מאוד לחלץ RNA מרקמות הלבלב מבלי לפגוע בו. לכן, שיטת מיצוי RNA מעשית יש צורך לשמור על שלמות של רקמות הלבלב במהלך תהליך החילוץ. מחקר ניסיוני והשוותי של פרוטוקולים קיימים בוצע על ידי קבלת 20-30 מ"ג של רקמות הלבלב חולדה בפחות מ 2 דקות וחילוץ RNA. התוצאות הוערכו על ידי אלקטרופורזה. הניסויים בוצעו שלוש פעמים להכללת התוצאות. טבילה רקמת הלבלב בריאגנט ייצוב RNA ב -80 ° C עבור 24 שעות הניב RNA שלמות גבוהה, כאשר ריאגנט מיצוי RNA שימש כמו reagent. התוצאות שהתקבלו היו דומות לתוצאות שהתקבלו ערכות מסחריות עם איגודי עמודות ספין.

Introduction

ניתן לתעתק נתוני גנים מבניים למוצר פונקציונלי באמצעות ביטוי גנים. ניתוח RNA משמש לגילוי הבדלים בביטוי גנים בתנאים שונים. ישנן מספר שיטות לחלץ חומצות גרעין כדלקמן: גאנידיניום thiocyanate, חילוץ באמצעות פנול-כלורופורם, כרומטוגרפיה מבוססת תאית, מיצוי על ידי מטריצות סיליקה, ואניון-exchange1,,2.

זיהוי נכון של ביטוי גנים מושפע על ידי שלמות RNA מבודד מרקמות; לכן, זה חיוני כדי להעריך את שלמות RNA מבודד מרקמות לפני בדיקות נוספות מתבצעות כי בדיקות מולקולריות משלימות על RNA באיכות נמוכה עלול לסכן את תוצאות יישום אבחון. לכן, RNA שלמות גבוהה נדרש עבור בדיקות ביולוגיות מולקולריות עם יישומי אבחון שונים: RT-PCR כמותי, מיקרו-מערכים, אחסון הגנת ribonuclease, ניתוח כתם צפוני, מיפוי RNA, ובניית ספריית cDNA3,4.

RNA הופך להיות לא יציב למדי לאחר שהוחזק במשך זמן רב. שברי mRNA ארוכים מעל 10 kb רגישים במיוחד להשפלה5,6. לפיכך, על החוקרים לשקול גורמים שונים המשפיעים על שלמות ה-RNA המטוהר. הטוהר של RNA חייב להיות מוגן מפני RNases, חלבונים, DNA גנומי, וזיהום מעכב אנזימטי. בנוסף, יחס הספיגה הטוב והמקובל של RNA ל-UV (260/280) חייב להיות בטווח של 1.8-2.0 עם פיצול מינימלי על פני אלקטרופורזה. טכניקות מעבדה שפותחו לאחרונה אפשרו למדענים להעריך את שלמות מדגם הניתוח המולקולרייותר כמעט 7,8.

זה הרבה יותר קשה לחלץ RNA לא ניזוק מרקמות הלבלב מאשר סוגים אחרים של רקמות בגלל הכמות הגבוהה של ribonucleases (RNases). עם זאת, שיטות החילוץ הקיימות, כלומר פליטה מהירה של רקמת הלבלב מחלל הבטן והומוגניזציה בטמפרטורות נמוכות כדי לסתור RNases,הוכחו כלא יעילים 7, 8,9,,10,11,12,,13,14.9

מטרת המחקר הניסיוני ההשוואתי הנוכחי היא לשנות ולהשוות שיטות קיימות כדי לקבוע את השיטות היעילות ביותר. כך שונו והשוו פרוטוקולים שונים של חילוץ RNA. זה היה מכוון במיוחד כדי לקבוע את השיטה הפחות יקרה הדורשת כמות מינימלית של רקמת הלבלב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

אישור אתי למחקר זה התקבל מאוניברסיטת שיראז למדעי הרפואה (מספר אישור: 93-01-01-7178\03-07-2014).

הערה: השתמש בחולדות ספראג-דאולי זכר במשקל 250 גרם. מניחים את הבקבוקון המכיל רסיס של רקמת הלבלב שקוע בריאגנט ייצוב RNA במיכל חנקן נוזלי ב -80 ° C ולהשתמש בתמיסת חילוץ RNA 7 כדי לשמור על שלמות RNA.

1. הסרת רקמת הלבלב חולדה

  1. הכינו את חדר הניתוח והניכו את כל החומרים הנדרשים מתחת למכסה המנוע.
  2. לחטא את כל כלי הניתוח (מפס ההלבשה, מפס בראון-Adson, מספריים איריס, ומספריים Littler) בתנור לפחות 4 שעות ב 240 מעלות צלזיוס כדי להשבית RNases15. לחטא את פני השטח של מקום הניתוח עם 70% אלכוהול מתחת למכסה המנוע.
  3. להזריק קטמין / xylazine תוך-אפרטינולי באמצעות מזרק אינסולין [80/8 מ"ג/ק"ג]. בדוק את עומק ההרדמה על ידי צביטת בהונות החולדה לחוסר תגובה.
  4. להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט ייצוב RNA במיקרו-tube הנכון (2 מ"ל) כדי לעכב את ההפעלה של אנדונוקליז ברקמות excised.
  5. מיד מניחים את העכברוש על הלוח הכירורגי (ראש הרחק מהמנתח) לחתך באמצע הקו.
  6. לחטא את כל משטח הבטן עם 70% אלכוהול ולהסיר שיער חולדה באמצעות קוצץ שיער עם #40 דם.
  7. הפוך חתך בצורת V כדי לפתוח את הבטן אזור הערווה לרגליים הקדמיות עם מפסים הלבשה, מכריחים בראון-Adson, מספריים איריס, ומספריים Littler.
  8. הופכים את איברי הבטן לצד שמאל כדי לחשוף את הלבלב. בזהירות למצוא את רקמת הלבלב, אשר מתפשט בחלל הבטן. אתר את האזור מתחת הטחול כדי למצוא את הלבלב מבלי להתבלבל עם רקמת השומן.
  9. מיד להסיר 20-30 מ"ג של לבלב מן חלל הבטן בפחות מ 2 דקות. לשים את הרקמה הוסרה במיקרוtube 2 מ"ל במהירות לחתוך אותו עם חותך סטרילי לחדור את הרקמות המופרדות עם reagent ייצוב RNA.
  10. מניחים את המיקרו-טיוב במיכל חנקן כדי להקפיא מיד. שמור את המיקרו-טיוב במקפיא של -80°C למשך 24 שעותו-16.
  11. לאחר 24 שעות, להעביר את החלקים הזעירים של רקמות הלבלב למכל קרח.
  12. להזריק אשלגן כלורי (KCl) תוך לב עבור המתת חסד של חולדות לאחר הניתוח.

2. חילוץ RNA

  1. לחטא את פני השטח מתחת למכסה המנוע עם 70% אלכוהול.
  2. לשים 1 מ"ל של ריאגנט מיצוי RNA, אשר מכיל גאנידיניום thiocyanate לעכב RNase, במיקרו-tube סטרילי.
  3. מעבירים את רקמת הלבלב המופרדת למיקרו-טיוב. מעבירים את המיקרו-טיוב לחנקן הנוזלי כדי להקפיא מיד.
  4. המגן את הרקמה עם sonicator בדיקה קצה מיקרו ב 4 מעלות C להגדיר לרמה 20 עבור 60 s על ו 5 s כבוי.
  5. דגירה כל מדגם הומוגני במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס באמצעות קרח כתוש כדי לאפשר את תסביכות nucleoprotein להיות מנותק לחלוטין.
  6. להעשיר את הדגימות עם 0.2 מ"ל של כלורופורם עבור כל 1 מ"ל של ריאגנט חילוץ RNA. מכסים את הצינור בחוזקה ומנערים אותו בכוח במשך 15 שניות.
  7. דגירה הצינור במשך 15 דקות על הקרח כתוש (4 ° C) כדי להפריד את ריאגנט בשלושה שלבים.
  8. הפעל את הצנטריפוגה ב- 12,000 x g במשך 15 דקות ב- +2 עד +8 °C. העבר את שלב המים חסר הצבע למיקרו-טיוב חדש.
  9. להוסיף 0.5 מ"ל של 100% isopropanol לשלב המיווס. סגור את הצינור ולאחר מכן להפוך אותו לפחות 3 פעמים כדי לערבב את RNA ביסודיות.
  10. דגירה הדגימה במשך 5-10 דקות על קופסה קרה (4 °C) כדי לאפשר משקעים RNA.
  11. הפעל את הצנטריפוגה ב- 12,000 x g במשך 15 דקות ב- +2 עד +8 °C. זרוק את הסופרנטנט.
  12. להעשיר כל אחד מצינורות הצנטריפוגה עם 1 מ"ל של 75% אתנול.
  13. לשטוף את גלולת RNA על ידי היפוך הצינור לפחות 3 פעמים.
  14. הפעל את הצנטריפוגה ב- 7,500 x g ב- +2 עד +8 °C למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט כדי להסיר את האתנול העודף מנות ה-RNA על ידי ייבוש אוויר.
  15. להשעות מחדש את גלולת RNA ב diethylpyrocarbonate (DEPC)-מטופלים RNase מים ללא.
  16. להעביר את הפתרון דרך קצה פיפטה מספר פעמים כדי להמיס את גלולת RNA. לאחר מכן, דגירה את הפתרון במשך 10-15 דקות ב + 65 °C.

3. הערכת תקינות RNA עם אלקטרופורזה denaturation

  1. הכן מאגר פועל ג'ל: 50 mM NaAc (DEPC מטופל) ו 0.5 M EDTA (pH 8.0) ב- H2O שטופלו DEPC.
  2. הכן מאגר פועל ג'ל פורמלדהיד 5x (מאגר פועל MOPS): 0.1 M MOPS (pH 7.0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).
    1. להמיס 20.6 גר ' של MOPS ב 800 מ"ל של DEPC מטופל 50 mM נתרן אצטט. כוונן את ה-pH ל- 7.0 עם 2 N NaOH. הוסף 10 מ"ל של DEPC שטופלו 0.5 M EDTA (pH 8.0). כוונן את נפח הפתרון ל- 1 L עם מים שטופלו ב- DEPC.
    2. לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 μm ולשמור אותו בטמפרטורת החדר הרחק מהאור למען עיקור. המאגר הופך לצהוב עם הזמן אם הוא נחשף לאור או משועבד אוטומטית. מאגר בצבע קש עובד היטב, אבל אלה כהים יותר לא17.
  3. הכן 1.5% ג'ל agarose18. עבור 50 מ"ל, להוסיף 0.75 גרם של agarose ו 31 מ"ל של H2O. מיקרוגל הפתרון במיקרוגל במשך 1 דקות. הוסף 9 מ"ל של פורמלדהיד ו-10 מ"ל של מאגר 5x MOPS פועל.
  4. הכן את הדגימות לג'ל. ערבב את הפעולות הבאות בצינור מיקרופוג סטרילי:
    X μL RNA (עד 30 μg)
    2 μL של מאגר טעינת ג'ל 5x
    10 μL של צורה
    4 μL של מאגר פועל של MOPS
    1 μL של 0.1 מ"ג /מ"ל EtBr
    3 μL של פורמלדהיד 5-x μL של DEPC-H2O
  5. מדגרים את הדגימות ב-65 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ומצננים אותן על קרח. צנטריפוגה ל-5 שניות עד שכל הנוזלים מופקדים.
  6. הפעל מראש את הג'ל ב-5 V/cm למשך 5 דקות.
  7. טען את הדגימות לתוך הנתיבים של הג'ל מיד ולאחר מכן להשתיג את הג'ל 1x פורמלדהיד ג'ל פועל חוצץ. הפעל ב- 3-4 V/cm19.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הערכה של תקינות RNA בריגנט חילוץ RNA על פי פרוטוקול כירורגי שגרתי ושונה ללא ריגרציה ייצוב RNA
להקות לא מקובלות נצפו לאחר החילוץ של RNA עם reagent החילוץ RNA מפרוטוקול כירורגי שגרתי. נתיב 1 מראה RNA מהכבד כשליטה. נתיב 2 מראה את המצב המשפיל של 28S/18S rRNA להקות בסך הכל RNA שהושג פרוטוקול כירורגי שגרתי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בביולוגיה מולקולרית חיוני להשיג RNA באיכות גבוהה. הנוכחות של אנזימי ribonuclease בתאים ורקמות במהירות משפיל RNA והופך את החילוץ מורכב. RNases הם אנזימים יציבים מתפקדים ללא כל גורמים שונים. כמויות קטנות של RNase מספיקות כדי להרוס RNA. כאשר רקמת הלבלב חולדה מוסרת מחלל הבטן, יש צורך לחטא את כלי הניתוח על ידי ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

אף אחד לא הוכרז.

Acknowledgements

המחקר הנוכחי נתמך כספית על ידי אוניברסיטת שיראז למדעי הרפואה (גרנט מס' 93-01-01-7178/03-07-2014). אנו מודים למר זומורודיאן ולמר רוסתמי במחלקה ללמידה אלקטרונית במדעי הרפואה, בית הספר הווירטואלי והמרכז למצוינות בלמידה אלקטרונית, אוניברסיטת שיראז למדעי הרפואה על עריכת הסרטון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseMerck116801Germany
AtoclaveTeb ZaimIran
CentrifugeSigmaGermany
ChloroformMerck107024Germany
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated waterSigmaGermany
EDTAsigma60-00-4Germany
Electrophoresis tankPayapajooheshIran
Eppendorf microTubeExtrageneTaiwan
EtBrsigmaE 8751Germany
EthanolMerck81870Germany
Falcon TubeExtrageneTaiwan
FormaldehydeMerck344198Germany
FormamideMerck344206Germany
Homogenizer-sunicatorMicroson XL 2000USA
Isopropanolsigma19516Germany
Ketamine hydrochloridesigma1867-66-9Germany
Laminar Flow HoodJal TajhizIran
Mgnetic stirrerLabrotechnikUSA
MicrocentrifugeEppendorfGermany
Micropipette TipsExtrageneTaiwan
MOPSsigma85022106Germany
Na ACMerck567422Germany
NaOHMerck109137Germany
OvenTeb ZaimIran
PH meterKnickGermany
RNA Later/RNA stabilization reagentQiagen76104USA
Surgical instrumentAgn ThosGerman made
SyringesAvaPezeshkIran
TriPure reagent/RNA extraction reagentRoche11667157001USA
VortexLabincoNetherland
Water bathMemmertGermany
zylazinesigma7361-61-7Germany

References

  1. McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
  2. Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
  3. Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
  4. Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
  5. Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
  6. Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
  7. Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408(1997).
  8. Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
  9. Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
  10. Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667(2009).
  11. Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617(2006).
  12. Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
  13. Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332(2012).
  14. Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
  15. Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857(2019).
  16. Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Dai, L. -j A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649(2009).
  17. Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
  18. Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
  19. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
  20. Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
  21. Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
  22. Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, Á Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
  23. Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100(2004).
  24. Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

163RNAAutolysis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved