Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İzole Edilmiş RNA'nın saflığı ve bütünlüğü, RNA'ya bağlı tahlillerde hayati bir adımdır. Burada, hasarsız pankreas dokusunun küçük bir miktar RNA ayıklamak için pratik, hızlı ve ucuz bir yöntem salıyoruz.

Özet

Ekstraksiyon yöntemine bakılmaksızın, doku ların ve hücre hatlarının optimize edilmiş RNA ekstraksiyonu dört aşamada gerçekleştirilir: 1) homojenizasyon, 2) Proteinlerin RNA'dan etkili denatürasyonu, 3) ribonükleaz inaktivasyonu ve 4) DNA, protein ve karbonhidratlardan kontaminasyonun çıkarılması. Ancak, dokuda yüksek rnase düzeyleri olduğunda RNA bütünlüğünü korumak için çok zahmetli. Spontan otolsis çok zor pankreas dokusundan rna zarar vermeden ayıklamak için yapar. Böylece, pratik bir RNA ekstraksiyon yöntemi çıkarma işlemi sırasında pankreas dokularının bütünlüğünü korumak için gereklidir. Mevcut protokollerin deneysel ve karşılaştırmalı bir çalışma az 2 dakika içinde sıçan pankreas dokularının 20-30 mg elde edilmesi ve RNA ayıklanması ile yapılmıştır. Sonuçlar elektroforez ile değerlendirildi. Deneyler sonuçların genelleştirilmesi için üç kez yapılmıştır. 24 saat için -80 °C'de RNA stabilizasyon reaktifine pankreas dokusu nun daldırılması, RNA ekstraksiyon reaktifi reaktif olarak kullanıldığında yüksek bütünlüklü RNA'ya neden oldu. Elde edilen sonuçlar spin kolon bağlamaları ile ticari kitlerden elde edilen sonuçlarla karşılaştırılabilir.

Giriş

Yapısal gen verileri gen ekspresyonu yoluyla fonksiyonel bir ürüne aktarılabilir. RNA analizi farklı koşullar arasında gen ekspresyonu farklılıkları keşfetmek için kullanılır. Aşağıdaki gibi nükleik asitleri ayıklamak için yöntemler vardır: guanidinium tiyosiyanat, fenol-kloroform ile ekstraksiyon, selüloz bazlı kromatografi, silika matrisler tarafından ekstraksiyon, ve anyon değişimi1,2.

Gen ekspresyonunun doğru saptanması dokulardan izole edilen RNA'nın bütünlüğünden etkilenir; bu nedenle, düşük kaliteli RNA üzerinde tamamlayıcı moleküler testler tanısal uygulama sonuçlarını tehlikeye atabileceğinden, ileri testler yapılmazken dokulardan izole edilen RNA'nın bütünlüğünün değerlendirilmesi hayati önem taşımaktadır. Böylece, yüksek bütünlük RNA farklı tanı uygulamaları ile moleküler biyolojik testler için gereklidir: kantitatif RT-PCR, mikro-diziler, ribonuklez koruma testi, kuzey leke analizi, RNA haritalama, ve cDNA kütüphane inşaat3,4.

RNA uzun süre tutulduktan sonra oldukça kararsız hale gelir. 10 kb üzerindeki uzun mRNA parçaları özellikle 55,6bozulmasına duyarlıdır. Bu nedenle, araştırmacılar arınmış RNA bütünlüğünü etkileyen çeşitli faktörler dikkate almalıdır. RNA saflığı RNa'lara, proteinlere, genomik DNA'ya ve enzimatik inhibitör kontaminasyonuna karşı korunmalıdır. Buna ek olarak, RNA'nın UV'ye (260/280) en iyi ve kabul edilebilir emilim oranı elektroforez üzerinde minimum parçalanma ile 1.8-2.0 aralığında olmalıdır. Son zamanlarda geliştirilen laboratuvar teknikleri bilim adamları daha pratik 77,8moleküler analiz örnek bütünlüğünü değerlendirmek için sağlamıştır.

Bu ribonükleazların yüksek miktarda nedeniyle dokuların diğer türleri daha pankreas dokusundan hasarsız RNA ayıklamak çok daha zordur (RNas). Ancak, mevcut ekstraksiyon yöntemleri, yani karın boşluğundan pankreas dokusunun hızlı ejeksiyon ve düşük sıcaklıklarda homojenizasyon RNases engellemek için, etkisizolduğukanıtlanmıştır 7 ,8,,9,10,11,12,13,14.

Bu karşılaştırmalı deneysel çalışmanın amacı, en verimli yöntemleri belirlemek için mevcut yöntemleri değiştirmek ve karşılaştırmaktır. Bu amaçla, RNA çıkarma çeşitli protokolleri değiştirildi ve karşılaştırıldı. Özellikle pankreas dokusunun minimum miktarda gerektiren en pahalı yöntemi belirlemeamaçlıydı.

Protokol

Bu çalışma için etik onay Şiraz Tıp Bilimleri Üniversitesi'nden alındı (Onay numarası: 93-01-01-7178\03-07-2014).

NOT: 250 g ağırlığında erkek Sprague-Dawley sıçanları kullanın. -80 °C'de bir sıvı azot tankında RNA stabilizasyon reaktifine daldırılmış pankreas dokusu nun bir parçasını içeren şişeyi yerleştirin ve RNA'nın bütünlüğünü korumak için RNA ekstraksiyon reaktifi çözeltisini kullanın.

1. Sıçan pankreas dokusunun çıkarılması

  1. Ameliyathaneyi hazırlayın ve gerekli tüm malzemeleri kaputun altına yerleştirin.
  2. Tüm cerrahi aletleri sterilize (Pansuman forseps, Brown-Adson forseps, Iris makas, ve Littler makas) en az 4 saat için bir fırında 240 °C'de RNases15inaktive . Kaputun altında% 70 alkol ile ameliyat yeri yüzeyini sterilize.
  3. İnsülin şırıngası kullanarak ketamin/ksilazin intraperitoneal enjekte edin [80/8 mg/kg]. Yanıt eksikliği için farenin parmak parmaklarını çimdikleyerek anestezi derinliğini kontrol edin.
  4. Eksizlenmiş dokularda ensonükleazların aktivasyonunu inhibe etmek için uygun mikrotüp (2 mL) RNA stabilizasyon reaktifi 1 mL ekleyin.
  5. Hemen bir orta hat kesi için cerrahi tahta (uzak cerrah baş) üzerinde sıçan yerleştirin.
  6. % 70 alkol ile tüm karın yüzeyini sterilize ve #40 bıçakları ile bir saç makası kullanarak sıçan saç kaldırmak.
  7. Pansuman forceps, Brown-Adson forceps, Iris makas ve Littler makas ile ön bacaklara kasık bölgesinden karın açmak için bir V şeklinde kesi olun.
  8. Pankreasortaya çıkarmak için sol tarafa karın organları çevirin. Dikkatle pankreas dokusu bulmak, hangi karın boşluğunda yayılır. Yağ dokusu ile karıştırılmamalıdır olmadan pankreas bulmak için dalak altında alan bulun.
  9. Hemen az 2 dk içinde karın boşluğundan pankreas 20-30 mg çıkarın. Çıkarılan dokuyu 2 mL mikrotüpe hızlıca yerleştirin ve RNA stabilizasyon reaktifi ile ayrılmış dokulara nüfuz etmek için steril bir kesici ile kesin.
  10. Hemen donması için mikrotüpü bir nitrojen tankına yerleştirin. Mikrotüpü -80 °C'lik bir dondurucuda 24 saat16bekletin.
  11. 24 saat sonra, bir buz kabına pankreas dokularının küçük parçaları aktarın.
  12. Enjekte potasyum klorür (KCl) ameliyat sonrası sıçan ların ötanazi için intrakardiyal.

2. RNA çıkarma

  1. Kaputun altındaki yüzeyi %70 alkolle sterilize edin.
  2. Steril mikrotüpte RNase'yi inhibe etmek için guanidinium tiyosiyanat içeren RNA ekstraksiyon reaktifinin 1 mL'sini koyun.
  3. Ayrılmış pankreas dokusunu mikrotüpe aktarın. Hemen donması için mikrotüpü sıvı nitrojene aktarın.
  4. 4 °C'de mikro uç sondası sonicator ile dokuyu homojenize edin ve 60 s kapalı için 20 dereceye ayarlayın.
  5. Nükleoprotein komplekslerinin tamamen ayrışmasını sağlamak için ezilmiş buz kullanarak 4 °C'de 5 dakika boyunca her homojenize numuneyi kuluçkaya yatırın.
  6. RNA ekstraksiyon reaktifinin her 1 mL'si için numuneleri 0,2 mL kloroform ile zenginleştirin. Tüpü sıkıca kaplayın ve 15 s boyunca zorla sallayın.
  7. Reaktifi üç aşamada ayırmak için tüpü ezilmiş buz (4 °C) üzerinde 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  8. Santrifüjü +2 ila +8 °C'de 15 dakika 12.000 x g'de çalıştırın. Renksiz sulu fazı yeni bir mikrotüpe aktarın.
  9. Sulu faza 0,5 mL %100 isopropanol ekleyin. Tüpü kapatın ve RNA'yı iyice karıştırmak için en az 3 kez ters çevirin.
  10. RNA yağış sağlamak için soğuk bir kutu (4 °C) üzerinde 5-10 dakika için örnek kuluçka.
  11. Santrifüjü +2 ila +8 °C'de 15 dakika 12.000 x g'de çalıştırın. Supernatant atın.
  12. Santrifüj tüplerinin her birini 1 mL %75 etanol ile zenginleştirin.
  13. Tüpü en az 3 kez ters çevirerek RNA peletini yıkayın.
  14. Santrifüjü 7.500 x g+2 ila +8 °C'de 5 dakika çalıştırın. Hava kurutma tarafından RNA pelet aşırı etanol kaldırmak için supernatant atın.
  15. Diethylpyrocarbonate (DEPC) ile arıtılmış RNase içermeyen suda RNA peletini yeniden askıya alın.
  16. RNA peletini eritmek için çözeltiyi bir pipet ucundan birkaç kez geçirin. Daha sonra +65 °C'de 10-15 dk çözeltiyi kuluçkaya yatırın.

3. RNA Bütünlüğünün denatürasyon elektroforezi ile değerlendirilmesi

  1. Jel çalışan tampon hazırlayın: 50 mM NaAc (DEPC tedavi) ve 0.5 M EDTA (pH 8.0) DEPC ile tedavi H2O.
  2. 5x formaldehit jel çalışan tampon (MOPS çalışan tampon): 0,1 MOPS (pH 7.0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0) hazırlayın.
    1. 20.6 g MOPS'yi 800 mL DEPC'de çözün 50 mM sodyum asetat. 2 N NaOH ile pH'ı 7.0 olarak ayarlayın. 10 mL DEPC ile işlenmiş 0,5 M EDTA (pH 8,0) ekleyin. DEPC ile arıtılmış su ile çözeltinin hacmini 1 L'ye ayarlayın.
    2. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden geçirin ve sterilizasyon için oda sıcaklığında ışıktan uzak tutun. Arabellek ışığa maruz kaldığında veya otoklavlatılırsa zamanla sarıya dönüşür. Bir saman renkli tampon iyi çalışır, ama koyu olanlaryok 17.
  3. %1.5 agarose jel18hazırlayın. 50 mL için 0,75 g agarose ve 31 mL H2O. Mikrodalga çözeltisini mikrodalgaya 1 dk ekleyin. 9 mL formaldehit ve 10 mL 5x MOPS çalışan tampon ekleyin.
  4. Jel için örnekleri hazırlayın. Aşağıdakileri steril bir mikrofuge tüpte karıştırın:
    X μL RNA (30°G'ye kadar)
    2 μL 5x jel yükleme tamponu
    10 μL formamid
    4 μL MOPS çalışan tampon
    0.1 mg/mL EtBr'nin 1 μL'si
    3 μL formaldehit 5 x μL DEPC-H2O
  5. Numuneleri 65 °C'de 15 dk kuluçkaya yatırın ve buzüzerinde soğutun. Tüm sıvı birikene kadar 5 s santrifüj.
  6. Jeli 5 V/cm'de 5 dakika önceden çalıştırın.
  7. Örnekleri hemen jel şeritlerine yükleyin ve sonra jeli 1x formaldehit jel çalıştıran tampona batırın. 3-4 V/cm19'daçalıştırın.

Sonuçlar

RNA stabilizasyonu reaktifi olmadan rutin ve modifiye cerrahi protokole göre RNA ekstraksiyon reaktifindeki RNA'nın bütünlüğünün değerlendirilmesi
RNA'nın rutin bir cerrahi protokolden RNA ekstraksiyon reaktifi ile çıkarılmasından sonra kabul edilemez bantlar gözlendi. Lane 1 karaciğerden rna'yı kontrol olarak gösteriyor. Lane 2, rutin bir cerrahi protokolden elde edilen toplam RNA'da 28S/18S rRNA bantlarının bozulmuş durumunu gösterir. Pankreas dokusu miktarı 50 mg (şerit 3) v...

Tartışmalar

Moleküler biyolojide yüksek kaliteli RNA elde etmek hayati önem taşımaktadır. Hücre ve dokularda ribonükleaz enzimlerin varlığı hızla RNA düşürür ve ekstraksiyon karmaşık hale getirir. RNases herhangi bir co-faktör olmadan çalışan kararlı enzimler vardır. Az miktarda RNa RNA'yı yok etmek için yeterlidir. Fare pankreas dokusu karın boşluğundan çıkarıldığında, cerrahi aletleri güçlü deterjanlarla dezenfekte etmek, iyice durulamak ve ameliyattan önce RNases'i inaktive etmek için 240 ?...

Açıklamalar

Hiçbiri açıklanmadı.

Teşekkürler

Bu çalışma Şiraz Tıp Bilimleri Üniversitesi tarafından mali olarak desteklenmiştir (Hibe No. 93-01-01-7178\03-07-2014). Biz E-Tıp Bilimleri, Sanal Okul ve Mükemmellik Merkezi e-Öğrenme Bölümü' nde Sayın Zomorodian ve Bay Rostami teşekkür e-Öğrenme, Şiraz Üniversitesi Tıp Bilimleri video düzenleme için.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseMerck116801Germany
AtoclaveTeb ZaimIran
CentrifugeSigmaGermany
ChloroformMerck107024Germany
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated waterSigmaGermany
EDTAsigma60-00-4Germany
Electrophoresis tankPayapajooheshIran
Eppendorf microTubeExtrageneTaiwan
EtBrsigmaE 8751Germany
EthanolMerck81870Germany
Falcon TubeExtrageneTaiwan
FormaldehydeMerck344198Germany
FormamideMerck344206Germany
Homogenizer-sunicatorMicroson XL 2000USA
Isopropanolsigma19516Germany
Ketamine hydrochloridesigma1867-66-9Germany
Laminar Flow HoodJal TajhizIran
Mgnetic stirrerLabrotechnikUSA
MicrocentrifugeEppendorfGermany
Micropipette TipsExtrageneTaiwan
MOPSsigma85022106Germany
Na ACMerck567422Germany
NaOHMerck109137Germany
OvenTeb ZaimIran
PH meterKnickGermany
RNA Later/RNA stabilization reagentQiagen76104USA
Surgical instrumentAgn ThosGerman made
SyringesAvaPezeshkIran
TriPure reagent/RNA extraction reagentRoche11667157001USA
VortexLabincoNetherland
Water bathMemmertGermany
zylazinesigma7361-61-7Germany

Referanslar

  1. McCarthy, B., Hoyer, B. Identity of DNA and diversity of messenger RNA molecules in normal mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 52 (4), 915-922 (1964).
  2. Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009, (2009).
  3. Peirson, S. N., Butler, J. N. RNA extraction from mammalian tissues. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 315-327 (2007).
  4. Skidmore, A. F., Beebee, T. J. Characterization and use of the potent ribonuclease inhibitor aurintricarboxylic acid for the isolation of RNA from animal tissues. Biochemical Journal. 263 (1), 73-80 (1989).
  5. Mukhopadhyay, T., Roth, J. A. Isolation of total RNA from tissues or cell lines: visualization in gel. RNA Isolation and Characterization Protocols. , 55-59 (1998).
  6. Raeymaekers, L. Quantitative PCR: theoretical considerations with practical implications. Analytical Biochemistry. 214 (2), 582-585 (1993).
  7. Sparmann, G., Jäschke, A., Loehr, M., Liebe, S., Emmrich, J. Tissue homogenization as a key step in extracting RNA from human and rat pancreatic tissue. Biotechniques. 22 (3), 408 (1997).
  8. Kiba, T., et al. High-quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis. Pancreas. 35 (1), 98-100 (2007).
  9. Gill, S. S., Aubin, R. A., Bura, C. A., Curran, I. H., Matula, T. I. Ensuring recovery of intact RNA from rat pancreas. Molecular Biotechnology. 6 (3), 359-362 (1996).
  10. Hernandez, G. E., Mondala, T. S., Head, S. R. Assessing a novel room temperature RNA storage medium for compatibility in microarray gene expression analysis. Biotechniques. 47 (2), 667 (2009).
  11. Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40 (5), 617 (2006).
  12. Li, D., et al. A modified method using TRIzol reagent and liquid nitrogen produces high-quality RNA from rat pancreas. Applied Biochemistry and Biotechnology. 158 (2), 253-261 (2009).
  13. Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. A simplified and versatile method for obtaining high quality rna from pancreas. Biotechniques. 52 (5), 332 (2012).
  14. Jun, E., et al. Method optimization for extracting high-quality RNA from the human pancreas tissue. Translation Oncology. 11 (3), 800-807 (2018).
  15. Green, M. R., Sambrook, J. J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), 101857 (2019).
  16. Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Dai, L. -. j. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649 (2009).
  17. Armstrong, J. A., Schulz, J. R. J. Agarose gel electrophoresis. Current Protocol: Essential Laboratory Techniques. (1), 1-20 (2008).
  18. Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
  19. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. , (1989).
  20. Potenza, N., et al. Hybridase activity of human ribonuclease-1 revealed by a real-time fluorometric assay. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2906-2913 (2006).
  21. Jackson, D., Lewis, F., Taylor, G., Boylston, A., Quirke, P. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Pathology. 43 (6), 499-504 (1990).
  22. Quesada, I., Tudurí, E., Ripoll, C., Nadal, &. #. 1. 9. 3. ;. Physiology of the pancreatic α-cell and glucagon secretion: role in glucose homeostasis and diabetes. Journal of Endocrinology. 199 (1), 5-19 (2008).
  23. Quertinmont, E., Nicaise, C., Gustot, T., Deviere, J. Tissue Homogenization with the MagNA Lyser Instrument for Total RNA Extraction Using the TriPure Reagent. Liver (mg). 100 (100), 100 (2004).
  24. Dastgheib, S., Irajie, C., Assaei, R., Koohpeima, F., Mokarram, P. Optimization of RNA extraction from rat pancreatic tissue. Iranian Journal of Medical Sciences. 39 (3), 282 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 163Safl kEkstraksiyonRNAPankreasOtolsisMaliyet etkin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır