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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Reinheit und Integrität der isolierten RNA ist ein wichtiger Schritt in RNA-abhängigen Assays. Hier präsentieren wir eine praktische, schnelle und kostengünstige Methode, um RNA aus einer kleinen Menge unbeschädigtem Bauchspeicheldrüsengewebe zu extrahieren.

Zusammenfassung

Unabhängig von der Extraktionsmethode erfolgt die optimierte RNA-Extraktion von Geweben und Zelllinien in vier Stufen: 1) Homogenisierung, 2) effektive Denaturierung von Proteinen aus der RNA, 3) Ribonuklease-Inaktivierung und 4) Entfernung von Verunreinigungen aus DNA, Proteinen und Kohlenhydraten. Jedoch, Es ist sehr mühsam, die Integrität der RNA zu erhalten, wenn es hohe Niveaus von RNase im Gewebe. Die spontane Autolyse macht es sehr schwierig, RNA aus Bauchspeicheldrüsengewebe zu extrahieren, ohne sie zu beschädigen. Daher ist eine praktische RNA-Extraktionsmethode erforderlich, um die Integrität des Bauchspeicheldrüsengewebes während des Extraktionsprozesses zu erhalten. Eine experimentelle und vergleichende Untersuchung bestehender Protokolle wurde durchgeführt, indem 20-30 mg Bauchspeicheldrüsengewebe der Ratte in weniger als 2 Minuten erhalten und die RNA extrahiert wurden. Die Ergebnisse wurden durch Elektrophorese bewertet. Die Experimente wurden dreimal zur Verallgemeinerung der Ergebnisse durchgeführt. Das Eintauchen von Bauchspeicheldrüsengewebe in das RNA-Stabilisierungsreagenz bei -80 °C für 24 h ergab eine hochintegrierte RNA, als das RNA-Extraktionsreagenz als Reagenz verwendet wurde. Die erzielten Ergebnisse waren vergleichbar mit den Ergebnissen kommerzieller Kits mit Spinsäulenbindungen.

Einleitung

Strukturelle Gendaten können durch Genexpression auf ein funktionelles Produkt übertragen werden. Die RNA-Analyse wird verwendet, um Unterschiede in der Genexpression zwischen verschiedenen Bedingungen zu entdecken. Es gibt eine Reihe von Methoden, um Nukleinsäuren wie folgt zu extrahieren: Guanidiniumthiocyanat, Extraktion über Phenol-Chlorform, Cellulose-basierte Chromatographie, Extraktion durch Kieselsäurematrizen und Anionenaustausch1,2.

Der richtige Nachweis der Genexpression wird durch die Integrität der aus Geweben isolierten RNA beeinflusst; Daher ist es wichtig, die Integrität der aus Geweben isolierten RNA zu bewerten, bevor weitere Tests durchgeführt werden, da ergänzende molekulare Tests an minderwertiger RNA die Ergebnisse der diagnostischen Anwendung gefährden können. Daher wird hochintegrierte RNA für molekularbiologische Tests mit verschiedenen diagnostischen Anwendungen benötigt: quantitative RT-PCR, Mikro-Arrays, Ribonuklease-Schutz-Assay, Nordfleckanalyse, RNA-Mapping und cDNA-Bibliothekskonstruktion3,4.

RNA wird ziemlich instabil, nachdem sie für eine lange Zeit gehalten wurde. Lange mRNA-Fragmente über 10 kb sind besonders anfällig für Abbau5,6. Daher müssen die Forscher verschiedene Faktoren berücksichtigen, die die Integrität der gereinigten RNA beeinflussen. Die Reinheit der RNA muss gegen RNasen, Proteine, genomische DNA und enzymatische Inhibitorkontamination geschützt werden. Darüber hinaus muss das beste und akzeptable Absorptionsverhältnis von RNA zu UV (260/280) im Bereich von 1,8-2,0 bei minimaler Fragmentierung über Elektrophorese liegen. Kürzlich entwickelte Labortechniken haben es Wissenschaftlern ermöglicht, die Integrität molekularer Analyseprobenpraktischerzu bewerten 7,8.

Es ist viel schwieriger, unbeschädigte RNA aus Bauchspeicheldrüsengewebe zu extrahieren als andere Gewebearten wegen der hohen Menge an Ribonukleasen (RNasen). Jedoch, bestehende Extraktionsmethoden, nämlich der schnelle Auswurf des Bauchspeicheldrüsengewebes aus der Bauchhöhle und Homogenisierung bei niedrigen Temperaturen, um RNases zu behindern, haben sich als ineffektiv7,8,9,10,11,12,13,14.

Der Zweck der vorliegenden vergleichenden experimentellen Studie besteht darin, bestehende Methoden zu modifizieren und zu vergleichen, um die effizientesten Methoden zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Protokolle der RNA-Extraktion modifiziert und verglichen. Es zielte speziell darauf ab, die am wenigsten teure Methode zu bestimmen, die eine minimale Menge an Bauchspeicheldrüsengewebe erfordert.

Protokoll

Die ethische Zulassung für diese Studie wurde von der Shiraz University of Medical Sciences (Zulassungsnummer: 93-01-01-7178-03-07-2014) eingeholt.

HINWEIS: Verwenden Sie männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250 g. Legen Sie die Durchstechflasche mit einem Splitter von Bauchspeicheldrüsengewebe, das in das RNA-stabilisierende Reagenz eingetaucht ist, bei -80 °C in einen flüssigen Stickstofftank und verwenden Sie eine RNA-Extraktionsreagenzlösung, um die Integrität der RNA zu erhalten.

1. Entfernung des Bauchspeicheldrüsengewebes der Ratte

  1. Bereiten Sie den Operationssaal vor und legen Sie alle benötigten Materialien unter die Haube.
  2. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente (Dressing Zange, Brown-Adson Zange, Irisschere und Littler Schere) in einem Ofen für mindestens 4 h bei 240 °C, um RNases15zu inaktivieren. Sterilisieren Sie die Oberfläche des Operationsplatzes mit 70% Alkohol unter der Haube.
  3. Ketamin/Xylazin intraperitoneal mit einer Insulinspritze injizieren [80/8 mg/kg]. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen der Ratte auf mangelnde Reaktion kneifen.
  4. Fügen Sie 1 ml RNA-Stabilisierungsreagenz in das richtige Mikrorohr (2 ml) ein, um die Aktivierung von Endonukleasen in ausgeschnittenen Geweben zu hemmen.
  5. Legen Sie die Ratte sofort auf das Operationsbrett (Kopf weg vom Chirurgen) für einen Mittellinienschnitt.
  6. Sterilisieren Sie die gesamte Bauchoberfläche mit 70% Alkohol und entfernen Sie Rattenhaare mit einem Haarschneider mit #40 Klingen.
  7. Machen Sie einen V-förmigen Schnitt, um den Bauch vom Schambereich zu den Vorderbeinen mit Dressing Zange, Brown-Adson Zange, Irisschere und Littler Schere zu öffnen.
  8. Drehen Sie die Bauchorgane auf die linke Seite, um die Bauchspeicheldrüse freizulegen. Finden Sie sorgfältig das Bauchspeicheldrüsengewebe, das sich in der Bauchhöhle ausbreitet. Suchen Sie den Bereich unter der Milz, um die Bauchspeicheldrüse zu finden, ohne mit dem Fettgewebe verwechselt zu werden.
  9. Entfernen Sie sofort 20-30 mg Bauchspeicheldrüse aus der Bauchhöhle in weniger als 2 min. Legen Sie das entfernte Gewebe schnell in das 2 ml Mikrorohr und schneiden Sie es mit einem sterilen Fräser, um das abgetrennte Gewebe mit RNA-Stabilisierungsreagenz zu durchdringen.
  10. Legen Sie das Mikrorohr in einen Stickstofftank, um es sofort einzufrieren. Halten Sie das Mikrorohr in einem -80 °C Gefrierschrank für 24 h16.
  11. Nach 24 h die winzigen Stücke Bauchspeicheldrüsengewebe in einen Eisbehälter geben.
  12. Injizieren Sie Kaliumchlorid (KCl) intrakardinativ zur Euthanasie von Ratten nach der Operation.

2. RNA-Extraktion

  1. Sterilisieren Sie die Oberfläche unter der Haube mit 70% Alkohol.
  2. 1 ml des RNA-Extraktionsreagenzes, das Guanidiniumthiocyanat enthält, um RNase zu hemmen, in das sterile Mikrorohr geben.
  3. Übertragen Sie das abgetrennte Bauchspeicheldrüsengewebe in das Mikrorohr. Übertragen Sie das Mikrorohr auf den flüssigen Stickstoff, um sofort einzufrieren.
  4. Homogenisieren Sie das Gewebe mit dem Mikrospitzensondensonicator bei 4 °C auf Stufe 20 für 60 s ein und 5 s aus.
  5. Inkubieren Sie jede homogenisierte Probe für 5 min bei 4 °C mit zerkleinertem Eis, um die Nukleoproteinkomplexe vollständig zu dissoziieren.
  6. Bereichern Sie die Proben mit 0,2 ml Chloroform für jeweils 1 ml RNA-Extraktionsreagenz. Das Rohr fest verkapseln und 15 s kräftig schütteln.
  7. Inkubieren Sie das Rohr für 15 min auf dem zerkleinerten Eis (4 °C), um das Reagenz in drei Phasen zu trennen.
  8. Führen Sie die Zentrifuge bei 12.000 x g 15 min bei +2 bis +8 °C. Übertragen Sie die farblose wässrige Phase auf ein neues Mikrorohr.
  9. 0,5 ml 100% Isopropanol in die wässrige Phase geben. Schließen Sie die Röhre und invertieren Sie sie dann mindestens 3 Mal, um die RNA gründlich zu mischen.
  10. Inkubieren Sie die Probe für 5-10 min auf einer Kalten Dose (4 °C), um die RNA-Ausfällung zu ermöglichen.
  11. Führen Sie die Zentrifuge bei 12.000 x g 15 min bei +2 bis +8 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
  12. Bereichern Sie jeden der Zentrifugenrohre mit 1 ml 75% Ethanol.
  13. Waschen Sie das RNA-Pellet, indem Sie das Rohr mindestens 3 Mal invertieren.
  14. Führen Sie die Zentrifuge bei 7.500 x g bei +2 bis +8 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand, um das überschüssige Ethanol durch Lufttrocknung aus dem RNA-Pellet zu entfernen.
  15. Das RNA-Pellet in Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem RNase-freiem Wasser wieder aufsetzen.
  16. Übergeben Sie die Lösung mehrmals durch eine Pipettenspitze, um das RNA-Pellet aufzulösen. Dann inkubieren Sie die Lösung für 10-15 min bei +65 °C.

3. Beurteilung der RNA-Integrität mit Denaturierungselektrophorese

  1. Bereiten GelLaufpuffer: 50 mM NaAc (DEPC behandelt) und 0,5 M EDTA (pH 8.0) in DEPC-behandelten H2O.
  2. 5x Formaldehyd-Gel-Laufpuffer (MOPS-Laufpuffer): 0,1 M MOPS (pH 7,0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8,0).
    1. 20,6 g MOPS in 800 ml dePC behandeltem 50 mM Natriumacetat auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 2 N NaOH ein. 10 ml DEPC-behandelte 0,5 M EDTA (pH 8,0) hinzufügen. Stellen Sie das Volumen der Lösung mit DEPC-behandeltem Wasser auf 1 L ein.
    2. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2 m-Filter und halten Sie sie zur Sterilisation bei Raumtemperatur vom Licht fern. Der Puffer wird mit der Zeit gelb, wenn er Licht ausgesetzt oder autoklaviert ist. Ein strohfarbener Puffer funktioniert gut, aber dunkler eisern nicht17.
  3. Bereiten Sie ein 1,5% Agarose Gel18vor. Für 50 ml 0,75 g Agarose und 31 mlH2O hinzufügen. Mikrowelle die Lösung in der Mikrowelle für 1 min. Fügen Sie 9 ml Formaldehyd und 10 ml 5x MOPS Laufpuffer hinzu.
  4. Bereiten Sie die Proben für das Gel vor. Mischen Sie Folgendes in einem sterilen Mikrofugenrohr:
    X-L-RNA (bis zu 30 g)
    2 l 5x Gel-Ladepuffer
    10 l Formamid
    4 L DES MOPS-Laufpuffers
    1 l von 0,1 mg/ml EtBr
    3 l Formaldehyd 5-x l DEPC-H2O
  5. Die Proben 15 min bei 65 °C bebrüten und auf Eis abkühlen lassen. Zentrifuge für 5 s, bis die gesamte Flüssigkeit abgelagert ist.
  6. Führen Sie das Gel bei 5 V/cm 5 Minuten vor.
  7. Die Proben sofort in die Bahnen des Gels geben und dann das Gel in einen 1x Formaldehyd-Gel-Laufpuffer untertauchen. Laufen Sie bei 3-4 V/cm19.

Ergebnisse

Bewertung der Integrität der RNA in der RNA-Extraktionsreagenz nach einem Routine- und modifizierten Operationsprotokoll ohne RNA-Stabilisierungsreagenz
Nach der Extraktion von RNA mit dem RNA-Extraktionsreagenz aus einem routinemäßigen Operationsprotokoll wurden inakzeptable Bänder beobachtet. Lane 1 zeigt RNA aus der Leber als Kontrolle. Lane 2 zeigt den herabgestuften Status von 28S/18S rRNA-Bändern in der gesamten RNA, die aus einem routinemäßigen chirurgischen Protokoll gewonnen werden. We...

Diskussion

In der Molekularbiologie ist es wichtig, hochwertige RNA zu erhalten. Das Vorhandensein der Ribonuklease-Enzyme in Zellen und Geweben baut die RNA schnell aus und macht den Extraktionskomplex. RNasen sind stabile Enzyme, die ohne Co-Faktoren wirken. Kleine Mengen an RNase sind ausreichend, um RNA zu zerstören. Wenn das Bauchspeicheldrüsengewebe der Ratte aus der Bauchhöhle entfernt wird, ist es notwendig, die chirurgischen Instrumente mit starken Reinigungsmitteln zu desinfizieren, gründlich zu spülen und sie mindes...

Offenlegungen

Keine deklariert.

Danksagungen

Die vorliegende Studie wurde von der Shiraz University of Medical Sciences finanziell unterstützt (Grant-Nr. 93-01-01-7178-03-07-2014). Wir danken Herrn Zomorodian und Herrn Rostami am Department of e-Learning in Medical Sciences, Virtual School und Center of Excellence in e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences für die Bearbeitung des Videos.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseMerck116801Germany
AtoclaveTeb ZaimIran
CentrifugeSigmaGermany
ChloroformMerck107024Germany
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated waterSigmaGermany
EDTAsigma60-00-4Germany
Electrophoresis tankPayapajooheshIran
Eppendorf microTubeExtrageneTaiwan
EtBrsigmaE 8751Germany
EthanolMerck81870Germany
Falcon TubeExtrageneTaiwan
FormaldehydeMerck344198Germany
FormamideMerck344206Germany
Homogenizer-sunicatorMicroson XL 2000USA
Isopropanolsigma19516Germany
Ketamine hydrochloridesigma1867-66-9Germany
Laminar Flow HoodJal TajhizIran
Mgnetic stirrerLabrotechnikUSA
MicrocentrifugeEppendorfGermany
Micropipette TipsExtrageneTaiwan
MOPSsigma85022106Germany
Na ACMerck567422Germany
NaOHMerck109137Germany
OvenTeb ZaimIran
PH meterKnickGermany
RNA Later/RNA stabilization reagentQiagen76104USA
Surgical instrumentAgn ThosGerman made
SyringesAvaPezeshkIran
TriPure reagent/RNA extraction reagentRoche11667157001USA
VortexLabincoNetherland
Water bathMemmertGermany
zylazinesigma7361-61-7Germany

Referenzen

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