Estrazione rapida ed economica dell'RNA del tessuto pancreatico ratto

Riepilogo

La purezza e l'integrità dell'RNA isolato è un passo vitale nei saggi dipendenti dall'RNA. Qui, presentiamo un metodo pratico, rapido ed economico per estrarre l'RNA da una piccola quantità di tessuto pancreatico non danneggiato.

Abstract

Indipendentemente dal metodo di estrazione, l'estrazione ottimizzata dell'RNA dei tessuti e delle linee cellulari viene effettuata in quattro fasi: 1) omogeneizzazione, 2) denaturazione efficace delle proteine da RNA, 3) inattivazione della ribonuclea e 4) rimozione della contaminazione da DNA, proteine e carboidrati. Tuttavia, è molto laborioso mantenere l'integrità dell'RNA quando ci sono alti livelli di RNase nel tessuto. L'autolisi spontanea rende molto difficile estrarre l'RNA dal tessuto pancreatico senza danneggiarlo. Pertanto, è necessario un metodo pratico di estrazione dell'RNA per mantenere l'integrità dei tessuti pancreatici durante il processo di estrazione. Uno studio sperimentale e comparativo dei protocolli esistenti è stato effettuato ottenendo 20-30 mg di tessuti pancreatici di ratto in meno di 2 minuti ed estraendo l'RNA. I risultati sono stati valutati per elettroforesi. Gli esperimenti sono stati effettuati tre volte per la generalizzazione dei risultati. Immergere il tessuto pancreatico nel reagente di stabilizzazione dell'RNA a -80 gradi centigradi per 24 h ha prodotto RNA ad alta integrità, quando il reagente di estrazione dell'RNA è stato utilizzato come reagente. I risultati ottenuti sono stati paragonabili ai risultati ottenuti da kit commerciali con attacchi di colonna di spin.

Introduzione

I dati genetici strutturali possono essere trascritti in un prodotto funzionale attraverso l'espressione genica. L'analisi dell'RNA viene utilizzata per scoprire le differenze nell'espressione genica in diverse condizioni. Ci sono una serie di metodi per estrarre gli acidi nucleici come segue: guanidinium thiocyanate, estrazione tramite fenolo-cloroformio, cromatografia a base di cellulosa, estrazione da matrici di silice e scambio di^{anioni 1,2}.

La corretta rilevazione dell'espressione genica è influenzata dall'integrità dell'RNA isolato dai tessuti; pertanto, è fondamentale valutare l'integrità dell'RNA isolato dai tessuti prima che vengono effettuati ulteriori test perché test molecolari complementari su RNA di bassa qualità possono compromettere i risultati dell'applicazione diagnostica. Pertanto, l'RNA ad alta integrità è necessario per i test biologici molecolari con diverse applicazioni diagnostiche: RT-PCR quantitativo, micro-array, analisi della protezione della ribonucleasi, analisi delle macchie settentrionali, mappatura dell'RNA e costruzione della libreria cDNA^3,4.

L'RNA diventa piuttosto instabile dopo essere stato tenuto a lungo. Frammenti di mRNA lunghi oltre 10 kb sono particolarmente suscettibili alla degradazione^5,6. Pertanto, i ricercatori devono considerare vari fattori che influenzano l'integrità dell'RNA purificato. La purezza dell'RNA deve essere protetta da RNases, proteine, DNA genomico e contaminazione da inibitori enzimatici. Inoltre, il miglior e accettabile rapporto di assorbimento tra RNA e UV (260/280) deve essere compreso nell'intervallo di 1,8-2,0 con frammentazione minima sull'elettroforesi. Tecniche di laboratorio sviluppate di recente hanno permesso agli scienziati di valutare l'integrità del campione di analisi molecolare^{più praticamente 7,8}.

È molto più difficile estrarre l'RNA non danneggiato dal tessuto pancreatico rispetto ad altri tipi di tessuti a causa dell'elevata quantità di ribonucleasi (RNases). Tuttavia, i metodi di estrazione esistenti, vale a dire la rapida espulsione del tessuto pancreatico dalla cavità addominale e l'omogeneizzazione a basse temperature per ostacolare le RNases, si sono dimostrati inefficaci^{7,8,9,10,11,12,13,14}.

Lo scopo dell'attuale studio sperimentale comparativo è quello di modificare e confrontare i metodi esistenti per determinare i metodi più efficienti. A tal fine, vari protocolli di estrazione dell'RNA sono stati modificati e confrontati. Era specificamente finalizzato a determinare il metodo meno costoso che richiede una quantità minima di tessuto pancreatico.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

L'approvazione etica per questo studio è stata ottenuta dalla Shiraz University of Medical Sciences (numero di approvazione: 93-01-01-7178-03-07-2014).

NOTA: Utilizzare ratti maschi Sprague-Dawley del peso di 250 g. Posizionare la fiala contenente una scheggia di tessuto pancreatico immerso nel reagente stabilizzante dell'RNA in un serbatoio di azoto liquido a -80 gradi centigradi e utilizzare la soluzione del reagente di estrazione dell'RNA per mantenere l'integrità dell'RNA.

1. Rimozione del tessuto pancreatico ratto

1. Preparare la sala operatoria e posizionare tutti i materiali necessari sotto il cofano.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici (dressing forceps, forceps Brown-Adson, forbici Iris e forbici Littler) in forno per almeno 4 h a 240 gradi centigradi per inattivare RNases¹⁵. Sterilizzare la superficie del luogo di chirurgia con 70% di alcol sotto il cofano.
3. Iniettare chetamina/xylazina intraperitonealmente utilizzando una siringa insulina [80/8 mg/kg]. Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi del ratto per una mancanza di risposta.
4. Aggiungere 1 mL di reagente di stabilizzazione dell'RNA nel microtubo corretto (2 mL) per inibire l'attivazione delle endonucleasi nei tessuti azizzati.
5. Posizionare immediatamente il ratto sulla tavola chirurgica (allontanarsi dal chirurgo) per un'incisione a media linea.
6. Sterilizzare l'intera superficie addominale con il 70% di alcol e rimuovere i capelli di ratto utilizzando un tagliacapello con #40 lame.
7. Fai un'incisione a forma di V per aprire l'addome dall'area pubica alle zampe anteriori con le forbici Dressing, le forcepi Brown-Adson, le forbici Iris e le forbici Littler.
8. Capovolgere gli organi addominali sul lato sinistro per esporre il pancreas. Trova con attenzione il tessuto pancreatico, che si diffonde nella cavità addominale. Individuare l'area sotto la milza per trovare il pancreas senza essere confuso con il tessuto adiposo.
9. Rimuovere immediatamente 20-30 mg di pancreas dalla cavità addominale in meno di 2 min. Mettere rapidamente il tessuto rimosso nel microtubo da 2 mL e tagliarlo con una fresa sterile per penetrare i tessuti separati con il reagente di stabilizzazione dell'RNA.
10. Posizionare il microtubo in un serbatoio di azoto per congelare immediatamente. Conservare il microtubo in un congelatore a -80 gradi centigradi per 24 h¹⁶.
11. Dopo 24 h, trasferire i piccoli pezzi di tessuti pancreatici in un contenitore di ghiaccio.
12. Iniettare cloruro di potassio (KCl) intracardially per l'eutanasia dei ratti dopo l'intervento chirurgico.

2. Estrazione dell'RNA

1. Sterilizzare la superficie sotto il cofano con 70% di alcol.
2. Mettere 1 mL del reagente di estrazione dell'RNA, che contiene il diocianio di guanidinio per inibire RNase, nel microtubo sterile.
3. Trasferire il tessuto pancreatico separato nel microtubo. Trasferire il microtubo nell'azoto liquido per congelare immediatamente.
4. Omogeneizzare il tessuto con il sonicatore della sonda a micro punta a 4 gradi centigradi impostato al livello 20 per 60 s on e 5 s off.
5. Incubare ogni campione omogeneizzato per 5 minuti a 4 gradi centigradi utilizzando ghiaccio tritato per consentire ai complessi di nucleoproteina di essere completamente dissociati.
6. Arricchire i campioni con 0,2 mL di cloroformio per ogni 1 mL di reagente di estrazione dell'RNA. Stringere saldamente il tubo e agitarlo con forza per 15 s.
7. Incubare il tubo per 15 minuti sul ghiaccio tritato (4 gradi centigradi) per separare il reagente in tre fasi.
8. Eseguire la centrifuga a 12.000 x g per 15 min a 2 -8 . Trasferire la fase aques incolore in un nuovo microtubo.
9. Aggiungere 0,5 mL del 100% isopropanolo alla fase aque. Chiudere il tubo e invertire almeno 3 volte per mescolare accuratamente l'RNA.
10. Incubare il campione per 5-10 min su una scatola fredda (4 gradi centigradi) per consentire la precipitazione dell'RNA.
11. Eseguire la centrifuga a 12.000 x g per 15 min a 2 -8 . Scarta il supernatant.
12. Arricchire ciascuno dei tubi centrifuga con 1 mL del 75% di etanolo.
13. Lavare il pellet dell'RNA invertendo il tubo almeno 3 volte.
14. Eseguire la centrifuga a 7.500 x g a 2-8 dollari per 5 min. Scartare il supernatant per rimuovere l'etanolo in eccesso dal pellet dell'RNA mediante l'essiccazione dell'aria.
15. Sospendere nuovamente il pellet di RNA in acqua libera da diethylpyrocarbonate (DEPC) trattata senza RNase.
16. Passare la soluzione attraverso una punta di pipetta più volte per sciogliere il pellet di RNA. Quindi, incubare la soluzione per 10-15 min a 65 dollari.

3. Valutazione dell'integrità dell'RNA con elettroforesi denaturazione

1. Preparare il buffer di esecuzione del gel: 50 mM NaAc (DEPC trattato) e 0,5 M EDTA (pH 8.0) in H₂O trattato da DEPC.
2. Preparare 5x formaldeide gel-running buffer (buffer di esecuzione MOPS): 0,1 M MOPS (pH 7.0), 40 mM NaAc, 5 mM EDTA (pH 8.0).
   1. Sciogliere 20,6 g di MOPS in 800 mL di DEPC trattati con acetato di sodio da 50 mM. Regolare il pH a 7,0 con 2 N NaOH. Aggiungere 10 mL di DEPC-trattato 0.5 M EDTA (pH 8.0). Regolare il volume della soluzione a 1 L con acqua trattata DEPC.
   2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 m e tenerla a temperatura ambiente lontano dalla luce per motivi di sterilizzazione. Il buffer diventa giallo con il tempo se è esposto alla luce o è autoclaved. Un buffer color paglia funziona bene, ma quelli più scuri non¹⁷.
3. Preparare un gel di agarose¹⁸. Per 50 mL, aggiungere 0,75 g di agarose e 31 mL di H₂O. Microonde la soluzione nel microonde per 1 min. Aggiungere 9 mL di formaldeide e 10 mL di buffer in esecuzione MOPS 5x.
4. Preparare i campioni per il gel. Mescolare quanto segue in un tubo di microfugio sterile:
   RNA X L (fino a 30 g)
   2 L di buffer di caricamento gel 5x
   10 L di formamide
   4 L di buffer di esecuzione MOPS
   1 L di 0,1 mg/mL EtBr
   3 L di formaldeide 5-x L di DEPC-H₂O
5. Incubare i campioni a 65 gradi centigradi per 15 minuti e raffreddarli sul ghiaccio. Centrifuga per 5 s fino a quando tutto il fluido viene depositato.
6. Pre-eseguire il gel a 5 V/cm per 5 minuti.
7. Caricare immediatamente i campioni nelle corsie del gel e poi immergere il gel in un tampone di gel di formaldeide 1x. Eseguire a 3-4 V/cm¹⁹.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Valutazione dell'integrità dell'RNA nel reagente di estrazione dell'RNA secondo un protocollo chirurgico di routine e modificato senza reagente di stabilizzazione dell'RNA
Dopo l'estrazione dell'RNA sono state osservate bande inaccettabili con il reagente di estrazione dell'RNA da un protocollo chirurgico di routine. La corsia 1 mostra l'RNA dal fegato come controllo. La corsia 2 mostra lo stato degradato delle bande di rRNA 28S/18S nell'RNA totale ottenuto da un protocollo chirurgico di routine. Qua...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Nella biologia molecolare è fondamentale ottenere RNA di alta qualità. La presenza degli enzimi ribonucleasi nelle cellule e nei tessuti degrada rapidamente l'RNA e rende l'estrazione complessa. Le rule sono enzimi stabili che funzionano senza co-fattori. Piccole quantità di RNase sono adeguate per distruggere l'RNA. Quando il tessuto pancreatico del ratto viene rimosso dalla cavità addominale, è necessario disinfettare gli strumenti chirurgici con detergenti forti, sciacquarli accuratamente e metterli in forno per ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Merck	116801	Germany
Atoclave	Teb Zaim		Iran
Centrifuge	Sigma		Germany
Chloroform	Merck	107024	Germany
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water	Sigma		Germany
EDTA	sigma	60-00-4	Germany
Electrophoresis tank	Payapajoohesh		Iran
Eppendorf microTube	Extragene		Taiwan
EtBr	sigma	E 8751	Germany
Ethanol	Merck	81870	Germany
Falcon Tube	Extragene		Taiwan
Formaldehyde	Merck	344198	Germany
Formamide	Merck	344206	Germany
Homogenizer-sunicator	Microson XL 2000		USA
Isopropanol	sigma	19516	Germany
Ketamine hydrochloride	sigma	1867-66-9	Germany
Laminar Flow Hood	Jal Tajhiz		Iran
Mgnetic stirrer	Labrotechnik		USA
Microcentrifuge	Eppendorf		Germany
Micropipette Tips	Extragene		Taiwan
MOPS	sigma	85022106	Germany
Na AC	Merck	567422	Germany
NaOH	Merck	109137	Germany
Oven	Teb Zaim		Iran
PH meter	Knick		Germany
RNA Later/RNA stabilization reagent	Qiagen	76104	USA
Surgical instrument	Agn Thos		German made
Syringes	AvaPezeshk		Iran
TriPure reagent/RNA extraction reagent	Roche	11667157001	USA
Vortex	Labinco		Netherland
Water bath	Memmert		Germany
zylazine	sigma	7361-61-7	Germany