ラット膵臓組織の迅速かつ費用対効果の高いRNA抽出

要約

単離されたRNAの純度と完全性は、RNA依存アッセイにおいて重要なステップです。ここでは、少量の損傷を受けていない膵臓組織からRNAを抽出する実用的で迅速かつ安価な方法を提示する。

要約

抽出方法に関係なく、組織および細胞株の最適化されたRNA抽出は、1)均質化、2)RNAからのタンパク質の有効な変性、3)リボヌクレアーゼ不活性化、および4)DNA、タンパク質、および炭水化物からの汚染の除去の4つの段階で行われます。しかし、組織に高レベルのRNaseがある場合、RNAの完全性を維持することは非常に面倒です。自発的な自己分解は、それを損傷することなく、膵臓組織からRNAを抽出することは非常に困難になります。したがって、抽出プロセス中に膵臓組織の完全性を維持するために実用的なRNA抽出方法が必要です。既存のプロトコルの実験的および比較研究は、2分未満で20〜30mgのラット膵臓組織を得てRNAを抽出することによって行われた。結果は電気泳動によって評価された。実験は、結果の一般化のために3回行った。24時間に対して−80°CでのRNA安定化試薬に膵臓組織を浸漬すると、RNA抽出試薬を試薬として用いた場合に高い完全性RNAが生じ、。得られた結果は、スピンカラム結合を有する市販キットから得られた結果と同等であった。

概要

構造遺伝子データは、遺伝子発現を通じて機能産物に転写することができる。RNA解析は、異なる条件間で遺伝子発現の違いを発見するために使用されます。核酸を抽出する方法は数多くあります:グアニジニウム・チオシアネート、フェノールクロロホルムによる抽出、セルロース系クロマトグラフィー、シリカマトリックスによる抽出、およびアニオン交換^11,2。2

遺伝子発現の適切な検出は、組織から分離されたRNAの完全性の影響を受けます。したがって、低品質RNAの補完的な分子試験は診断アプリケーションの結果を危険にさらす可能性があるため、さらなる試験を行う前に、組織から分離されたRNAの完全性を評価することが重要です。したがって、定量的RT-PCR、マイクロアレイ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ノーザンブロット分析、RNAマッピング、およびcDNAライブラリ構築^33、44など、さまざまな診断アプリケーションを用いた分子生物学的試験には高い完全性RNAが必要です。

RNAは、長期間保持された後、かなり不安定になります。10 kb 以上の長い mRNA フラグメントは、特に分解の影響を受けやすい^5,,6。したがって、研究者は、精製されたRNAの完全性に影響を与える様々な要因を考慮する必要があります。RNAの純度は、RNases、タンパク質、ゲノムDNA、および酵素阻害剤汚染から保護されなければならない。さらに、RNAとUVの吸収率(260/280)は、電気泳動に対する最小の断片化で1.8~2.0の範囲内でなければなりません。最近開発された実験室の技術は、科学者がより実質的に^7、8の分子分析⁷サンプルの完全性を評価することを可能^{にしました}。

リボヌクレアーゼ(RNases)の量が多いため、他のタイプの組織よりも膵臓組織から損傷を受けていないRNAを抽出することははるかに困難です。しかし、既存の抽出方法、すなわち、RNasesを妨げる低温での腹腔および均質化からの膵臓組織の急速な放出は、有効でない⁷⁸7、8、9、10、11、12、13、14^,13,14を証明している。^11,12,9,10,,

本比較実験研究の目的は、既存の方法を修正し、比較して最も効率的な方法を決定することです。そのために、RNA抽出の様々なプロトコルを改変し、比較した。これは、膵臓組織の最小量を必要とする最も安価な方法を決定することを特に目的とした。

プロトコル

この研究の倫理的承認は、シラーズ医科大学(承認番号:93-01-01-7178\03-07-2014)から得られました。

注:雄のスプレイグ-ドーリーラットの体重250グラムを使用してください。80°Cの液体窒素タンクにRNA安定化試薬に浸漬した膵臓組織のスライバーを含むバイアルを置き、RNA抽出試薬溶液を使用してRNAの完全性を維持します。

1. ラット膵臓組織の除去

1. 手術室を準備し、フードの下にすべての必要な材料を配置します。
2. RNases¹⁵を不活性化するために、240°Cで少なくとも4時間オーブンですべての手術器具(ドレッシング鉗子、ブラウン・アドソン鉗子、アイリスはさみ、およびリトルハサミ)を殺菌する。フードの下に70%アルコールで手術場所の表面を殺菌します。
3. インスリン注射器を使用して腹腔内にケタミン/キシラジンを注入する [80/8 mg/kg].反応の欠如のためにラットのつまみで麻酔の深さを確認してください。
4. 適切なマイクロチューブ(2 mL)にRNA安定化試薬を1 mL添加して、切除組織におけるエンドヌクレアーゼの活性化を阻害します。
5. すぐに中間線の切開のために外科用板(外科医から離れて頭)にラットを置きます。
6. 70%アルコールで腹部の表面全体を殺菌し、#40刃の毛のクリッパーを使用してラットの毛を除去します。
7. V字型の切開を行い、陰部から前脚までの腹部をドレッシング鉗子、ブラウン・アドソン鉗子、アイリスはさみ、リトルハサミで開きます。
8. 腹部の器官を左側にひっくり返して膵臓を露出させます。慎重に腹腔に広がる膵臓組織を見つける。脂肪組織と混同されることなく膵臓を見つけるために脾臓の下の領域を見つけます。
9. すぐに20〜30mgの膵臓を腹腔から2分以内に取り除く。取り出した組織を2mLマイクロチューブに素早く入れ、滅菌カッターで切断し、RNA安定化試薬で分離した組織を貫通させます。
10. マイクロチューブを窒素タンクに入れ、すぐに凍結します。マイクロチューブを-80°C冷凍庫に24時間¹⁶時間保管してください。
11. 24時間後、膵臓組織の小片を氷容器に移します。
12. 手術後のラットの安楽死のために、塩化カリウム(KCl)を心内に注入する。

2. RNA抽出

1. 70%アルコールでボンネットの下の表面を殺菌します。
2. RNA抽出試薬の1 mLを入れて、これは、滅菌マイクロチューブに、RNaseを阻害するためにチオシアネートグアニジニウムを含有する。
3. 分離した膵臓組織をマイクロチューブに移します。マイクロチューブを液体窒素に移し、すぐに凍結します。
4. 4 °Cのマイクロチッププローブ超音波処理器で組織を均質化し、60 s onと5 s offのレベル20に設定します。
5. 砕氷を用いて4°Cで均質化したサンプルを5分間インキュベートし、核タンパク質複合体を完全に解光することができます。
6. RNA抽出試薬の各1 mLに対して0.2 mLのクロロホルムでサンプルを濃縮します。チューブをしっかりとキャップし、15 sの間強く振ります。
7. 破砕した氷(4°C)上でチューブを15分間インキュベートし、試薬を3段階で分離します。
8. 遠心分離機を+2~+8°Cで15分間12,000 x g で実行します。 無色水相を新しいマイクロチューブに移します。
9. 水相に100%イソプロパノールの0.5mLを加えます。チューブを閉じ、それを少なくとも3回反転してRNAを完全に混合します。
10. 冷たい箱(4°C)に5〜10分間サンプルをインキュベートして、RNA沈殿を可能にします。
11. 遠心分離機を+2~+8°Cで15分間12,000 x g で実行します。 上清を捨てます。
12. 75%エタノールの1 mLで遠心分離管のそれぞれを豊かにします。
13. RNAペレットを、チューブを3回以上反転させて洗浄します。
14. 7,500 x g で+2 ~ +8 °C で 5 分間遠心分離機を実行します。上清を捨てて、空気乾燥によりRNAペレットから余分なエタノールを除去する。
15. ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理したRNaseフリー水中のRNAペレットを再懸濁する。
16. 溶液をピペットチップを通して数回通過し、RNAペレットを溶解します。その後、溶液を+65°Cで10〜15分間インキュベートします。

3. 変性電気泳動によるRNAインテグリティの評価

1. ゲルランニングバッファを準備する:DEPC処理_H2Oで50 mM NaAc(DEPC処理)および0.5 M EDTA(pH 8.0)。
2. 5xホルムアルデヒドゲルランニングバッファ(MOPSランニングバッファ):0.1 M MOPS(pH 7.0)、40 mM NaAc、5 mM EDTA(pH 8.0)
   1. 50 mM酢酸ナトリウムを処理したDEPCの800 mLに20.6 gのMOPSを溶解する。2 N NaOH で pH を 7.0 に調整します。10 mLの DEPC 処理 0.5 M EDTA (pH 8.0) を加えます。DEPC処理水で溶液の体積を1 Lに調整します。
   2. 0.2 μmフィルターで溶液をフィルターし、滅菌のために光から離れて室温に保ちます。バッファーは、光にさらされるか、オートクレーブされている場合、時間とともに黄色になります。ストロー色のバッファはうまく機能しますが、暗いバッファは¹⁷ではありません。
3. 1.5%アガロースゲル¹⁸を準備します。50 mL の場合、0.75 gのアガロースと 31 mL の H₂O. マイクロ波に1分間マイクロ波に溶液を加えます。ホルムアルデヒド9 mLと5x MOPSランニングバッファの10 mLを加えます。
4. ゲル用のサンプルを準備します。滅菌マイクロフュージチューブに以下を混ぜます:
   X μL RNA(最大30μg)
   5xゲルローディングバッファの2 μL
   10 μL のフォルムアミド
   4 μL の MOPS 実行バッファ
   1 μL 0.1 mg/mL EtBr
   3 μL の ホルムアルデヒド 5-x μL の DEPC-H₂O
5. サンプルを65°Cで15分間インキュベートし、氷の上で冷却します。すべての流体が堆積するまで5 sの遠心分離機。
6. ゲルを5V/cmで5分間前走します。
7. すぐにゲルのレーンにサンプルをロードし、1xホルムアルデヒドゲルランニングバッファーにゲルを沈めます。3-4 V/cm¹⁹で実行します。

結果

RNA安定化試薬を使用しないルーチンおよび修飾された外科プロトコルによるRNA抽出試薬におけるRNAの完全性の評価
受け入れられないバンドは、定期的な外科プロトコルからRNA抽出試薬を用いたRNAの抽出後に観察された。レーン1は、肝臓からのRNAをコントロールとして示す。レーン2は、ルーチンの外科プロトコルから得られた総RNAにおける28S/18S rRNAバンドの劣化状態を示す。?...

ディスカッション

分子生物学では、高品質のRNAを得ることが不可欠です。細胞および組織におけるリボヌクレアーゼ酵素の存在は、RNAを迅速に分解し、抽出を複雑にします。RNasesは共因子なしで機能する安定した酵素である。少量のRNaseはRNAを破壊するのに十分です。ラット膵臓組織が腹腔から取り出されるとき、強い洗剤によって外科器具を消毒し、十分に洗い流し、手術前にRNasesを不活性化するために240°...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Merck	116801	Germany
Atoclave	Teb Zaim		Iran
Centrifuge	Sigma		Germany
Chloroform	Merck	107024	Germany
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water	Sigma		Germany
EDTA	sigma	60-00-4	Germany
Electrophoresis tank	Payapajoohesh		Iran
Eppendorf microTube	Extragene		Taiwan
EtBr	sigma	E 8751	Germany
Ethanol	Merck	81870	Germany
Falcon Tube	Extragene		Taiwan
Formaldehyde	Merck	344198	Germany
Formamide	Merck	344206	Germany
Homogenizer-sunicator	Microson XL 2000		USA
Isopropanol	sigma	19516	Germany
Ketamine hydrochloride	sigma	1867-66-9	Germany
Laminar Flow Hood	Jal Tajhiz		Iran
Mgnetic stirrer	Labrotechnik		USA
Microcentrifuge	Eppendorf		Germany
Micropipette Tips	Extragene		Taiwan
MOPS	sigma	85022106	Germany
Na AC	Merck	567422	Germany
NaOH	Merck	109137	Germany
Oven	Teb Zaim		Iran
PH meter	Knick		Germany
RNA Later/RNA stabilization reagent	Qiagen	76104	USA
Surgical instrument	Agn Thos		German made
Syringes	AvaPezeshk		Iran
TriPure reagent/RNA extraction reagent	Roche	11667157001	USA
Vortex	Labinco		Netherland
Water bath	Memmert		Germany
zylazine	sigma	7361-61-7	Germany