Быстрая и экономически эффективная РНК-экстракция крысиной ткани поджелудочной железы

Резюме

Чистота и целостность изолированной РНК является жизненно важным шагом в РНК зависимых анализов. Здесь мы представляем практический, быстрый и недорогой метод извлечения РНК из небольшого количества неповрежденной ткани поджелудочной железы.

Аннотация

Независимо от метода экстракции, оптимизированная рнк-экстракция тканей и клеточных линий осуществляется в четыре этапа: 1) гомогенизация, 2) эффективная денатурация белков из РНК, 3) инактивация рибонуклеазы и 4) удаление загрязнения из ДНК, белков и углеводов. Тем не менее, это очень трудоемкий для поддержания целостности РНК, когда Есть высокий уровень RNase в ткани. Спонтанный аутолиз делает его очень трудно извлечь РНК из ткани поджелудочной железы, не повреждая его. Таким образом, практический метод извлечения РНК необходим для поддержания целостности тканей поджелудочной железы в процессе извлечения. Экспериментальное и сравнительное исследование существующих протоколов было проведено путем получения 20-30 мг тканей поджелудочной железы крыс менее чем за 2 минуты и извлечения РНК. Результаты были оценены электрофорезом. Эксперименты проводились трижды для обобщения результатов. Погружение ткани поджелудочной железы в реагент стабилизации РНК при -80 градусов по Цельсию на 24 ч дало высокую целостность РНК, когда реагент извлечения РНК использовался в качестве реагента. Полученные результаты были сопоставимы с результатами, полученными из коммерческих комплектов с привязками спиновой колонки.

Введение

Структурные генные данные могут быть транскрибированы в функциональный продукт через экспрессию генов. Анализ РНК используется для обнаружения различий в экспрессии генов в различных условиях. Существует ряд методов извлечения нуклеиновых кислот следующим образом: гуанидиний тиоцианат, экстракция через фенол-хлороформ, целлюлозно-основанная хроматография, экстракция матрицами кремнезема и^{анион-обмен 1,,2}.

Правильное обнаружение экспрессии генов зависит от целостности РНК, изолированной от тканей; поэтому крайне важно оценить целостность РНК, изолированной от тканей, до того, как будут проведены дальнейшие испытания, поскольку дополнительные молекулярные тесты на некачественной РНК могут поставить под угрозу результаты диагностического применения. Таким образом, высокой целостности РНК необходима для молекулярно-биологических тестов с различными диагностическими приложениями: количественные RT-PCR, микро-arrays, рибонуклеазы защиты анализа, северной помарки анализа, РНК-картирования, и строительство библиотеки cDNA^3,4.

РНК становится довольно нестабильной после того, как хранится в течение длительного времени. Длинные фрагменты мРНК более 10 кб особенно восприимчивы к^{деградации 5,,6.} Таким образом, исследователи должны учитывать различные факторы, влияющие на целостность очищенной РНК. Чистота РНК должна быть защищена от RNases, белков, геномной ДНК и ферментативного загрязнения ингибиторами. Кроме того, наилучшее и приемлемое соотношение поглощения РНК к УФ (260/280) должно быть в пределах 1,8-2,0 с минимальной фрагментацией над электрофорезом. Недавно разработанные лабораторные методы позволили ученым оценить целостность образца молекулярного анализа более^{практически 7,,8.}

Гораздо труднее извлечь неповрежденную РНК из ткани поджелудочной железы, чем другие типы тканей из-за большого количества рибонуклейсов (RNases). Однако существующие методы экстракции, а именно быстрый выброс ткани поджелудочной железы из брюшной полости и гомогенизация при низких температурах, препятствующие RNases, оказались^{неэффективными 7,,8,,9,,10,,11,,12,,13,,14.}

Целью нынешнего сравнительного экспериментального исследования является изменение и сравнение существующих методов для определения наиболее эффективных методов. С этой целью были изменены и сопоставлены различные протоколы извлечения РНК. Он был специально направлен на определение наименее дорогостоящего метода, требующего минимального количества ткани поджелудочной железы.

протокол

Этическое одобрение этого исследования было получено в Ширазском университете медицинских наук (утверждение номер: 93-01-01-7178-03-07-2014). approval

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте самцов крыс Спраг-Доули весом 250 г. Поместите флакон, содержащий щепку ткани поджелудочной железы, погруженную в РНК стабилизирующий реагент, в резервуар с жидким азотом при -80 градусов по Цельсию и используйте раствор реагентов для извлечения РНК для поддержания целостности РНК.

1. Удаление ткани поджелудочной железы крысы

1. Подготовь операционную и поместите все необходимые материалы под капот.
2. Стерилизовать все хирургические инструменты (одевание типсов, коричневый-Adson типсы, ножницы Ирис, и Littler ножницы) в духовке, по крайней мере 4 ч при температуре 240 градусов по Цельсию, чтобы инактивировать RNases¹⁵. Стерилизовать поверхность хирургического места с 70% алкоголя под капотом.
3. Инъекционный кетамин/ксилазин интраперитонно с использованием инсулинового шприца (80/8 мг/кг). Проверьте глубину анестезии, щипать крысы ног за отсутствие ответа.
4. Добавьте 1 мл реагента стабилизации РНК в правильную микротрубку (2 мл) для ингибирования активации эндонуклейза в выкакциированных тканях.
5. Немедленно поместите крысу на хирургическую доску (голова от хирурга) для разреза средней линии.
6. Стерилизовать всю брюшную поверхность с 70% алкоголя и удалить крысиные волосы с помощью ножницы для волос #40 лезвиями.
7. Сделайте V-образный разрез, чтобы открыть живот от лобковой области до передних ног с силами одевания, forceами Brown-Adson, ножницами Iris и ножницами Littler.
8. Переверните органы брюшной полости в левую сторону, чтобы разоблачить поджелудочной железы. Тщательно найдите ткани поджелудочной железы, которая распространяется в брюшной полости. Найдите область под селезенкой, чтобы найти поджелудочной железы, не путать с жировой тканью.
9. Немедленно удалите 20-30 мг поджелудочной железы из брюшной полости менее чем за 2 мин. Положите удаленную ткань в микротрубку 2 мл быстро и разрежьте ее стерильным резаком, чтобы проникнуть в разделенные ткани с реагентом стабилизации РНК.
10. Поместите микротрубки в резервуар с азотом, чтобы немедленно замерзнуть. Храните микротрубку в морозильной камере -80 градусов по Цельсию в течение 24^{ч 16}.
11. После 24 ч, передать крошечные кусочки тканей поджелудочной железы в контейнер со льдом.
12. Впрыснуть хлорид калия (KCl) intracardially для эвтаназии крыс после операции.

2. Добыча РНК

1. Стерилизовать поверхность под капотом с 70% алкоголя.
2. Положите 1 мл реагента экстракции РНК, который содержит гуанидиний тиоцианат для ингибирования RNase, в стерильной микротрубки.
3. Перенесите отделенную ткань поджелудочной железы на микротрубки. Перенесите микротрубки в жидкий азот, чтобы немедленно заморозить.
4. Гомогенизировать ткани с микро наконечник зонда sonicator на 4 градусов по Цельсию установлен на уровне 20 для 60 с и 5 с выключенным.
5. Инкубировать каждый гомогенизированный образец в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия с использованием дробленого льда, чтобы позволить нуклеопротеин комплексов быть полностью разобщены.
6. Обогащает образцы 0,2 мл хлороформа на каждый 1 мл реагента экстракции РНК. Крышка трубки твердо и встряхнуть его силой в течение 15 с.
7. Инкубировать трубку в течение 15 минут на дробленом льду (4 градусов по Цельсию), чтобы отделить реагент в три этапа.
8. Вы запустите центрифугу по 12 000 х г в течение 15 мин при 2 - 8 градусов по Цельсию. Перенесите бесцветную aqueous фазу на новую микротрубку.
9. Добавьте 0,5 мл 100% изопропанола в aqueous фазу. Закройте трубку, а затем инвертировать его по крайней мере 3 раза, чтобы смешать РНК тщательно.
10. Инкубировать образец в течение 5-10 минут на холодной коробке (4 градусов по Цельсию), чтобы РНК осадков.
11. Вы запустите центрифугу по 12 000 х г в течение 15 мин при 2 - 8 градусов по Цельсию. Откажитесь от супернатанта.
12. Обогатить каждую из трубок центрифуги 1 мл 75% этанола.
13. Вымойте гранулы РНК, инвертирование трубки по крайней мере 3 раза.
14. Вы запустите центрифугу по 7500 х г при 2 до 8 градусов по Цельсию в течение 5 минут. Откажитесь от супернатанта, чтобы удалить избыток этанола из гранул РНК путем сушки воздуха.
15. Повторно приостановить РНК гранулы в диэтилпирокарбонат (DEPC)-обработанных RNase свободной воды.
16. Перейдите раствор через наконечник пипетки несколько раз, чтобы растворить гранулы РНК. Затем инкубировать раствор в течение 10-15 мин при 65 градусов по Цельсию.

3. Оценка целостности РНК с помощью электрофорезации денатурации

1. Подготовка гель работает буфер: 50 мМ Наак (DEPC лечение) и 0,5 М EDTA (рН 8,0) в DEPC-обработанных H₂O.
2. Подготовка 5x формальдегида гель работает буфер (MOPS работает буфер): 0,1 М MOPS (рН 7,0), 40 мМ Наак, 5 мМ EDTA (рН 8,0).
   1. Растворите 20,6 г MOPS в 800 мл DEPC обработано 50 м ацетата натрия. Отрегулируйте рН до 7,0 с 2 N NaOH. Добавьте 10 мл ОБработаемого DEPC 0,5 М ЭДТА (рН 8,0). Отрегулируйте объем раствора до 1 л с помощью воды, обработанной DEPC.
   2. Фильтровать раствор через фильтр 0,2 мкм и держать его при комнатной температуре от света ради стерилизации. Буфер становится желтым со временем, если он подвергается воздействию света или автоматически. Буфер соломенного цвета работает хорошо, но темные не¹⁷.
3. Подготовка 1,5% агарозы гель¹⁸. Для 50 мл добавьте 0,75 г агарозы и 31 мл H₂O. Микроволновая печь раствор в микроволновой печи в течение 1 мин. Добавьте 9 мл формальдегида и 10 мл 5x буфера MOPS.
4. Подготовь образцы для геля. Смешайте следующее в стерильной трубке микрофьюджа:
   РНК X х L (до 30 мкг)
   2 МКЛ буфера загрузки геля 5x
   10 МКЛ формамида
   4 МКЛ буфера MOPS
   1 мл 0,1 мг/мл EtBr
   3 МКЛ формальдегида 5-х МКЛ DEPC-H₂O
5. Инкубировать образцы при 65 градусов по Цельсию в течение 15 минут и охладить их на льду. Центрифуга на 5 с, пока вся жидкость не будет отложена.
6. Предварительно запустите гель при 5 В/см в течение 5 минут.
7. Загрузите образцы в полосы геля немедленно, а затем погрузить гель в 1x формальдегид гель работает буфер. Вы бегите при 3-4 В/см¹⁹.

Результаты

Оценка целостности РНК в реагенте извлечения РНК в соответствии с обычным и измененным хирургическим протоколом без реагента стабилизации РНК
Неприемлемые полосы наблюдались после извлечения РНК с реагентом извлечения РНК из обычного хирургического протокола. Лейн 1 пока?...

Обсуждение

В молекулярной биологии очень важно получить высококачественную РНК. Наличие ферментов рибонуклеазы в клетках и тканях быстро ухудшает РНК и делает экстракции сложным. RNases являются стабильными ферментами, функционирующими без каких-либо со-факторов. Небольшое количество RNase достаточ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Merck	116801	Germany
Atoclave	Teb Zaim		Iran
Centrifuge	Sigma		Germany
Chloroform	Merck	107024	Germany
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water	Sigma		Germany
EDTA	sigma	60-00-4	Germany
Electrophoresis tank	Payapajoohesh		Iran
Eppendorf microTube	Extragene		Taiwan
EtBr	sigma	E 8751	Germany
Ethanol	Merck	81870	Germany
Falcon Tube	Extragene		Taiwan
Formaldehyde	Merck	344198	Germany
Formamide	Merck	344206	Germany
Homogenizer-sunicator	Microson XL 2000		USA
Isopropanol	sigma	19516	Germany
Ketamine hydrochloride	sigma	1867-66-9	Germany
Laminar Flow Hood	Jal Tajhiz		Iran
Mgnetic stirrer	Labrotechnik		USA
Microcentrifuge	Eppendorf		Germany
Micropipette Tips	Extragene		Taiwan
MOPS	sigma	85022106	Germany
Na AC	Merck	567422	Germany
NaOH	Merck	109137	Germany
Oven	Teb Zaim		Iran
PH meter	Knick		Germany
RNA Later/RNA stabilization reagent	Qiagen	76104	USA
Surgical instrument	Agn Thos		German made
Syringes	AvaPezeshk		Iran
TriPure reagent/RNA extraction reagent	Roche	11667157001	USA
Vortex	Labinco		Netherland
Water bath	Memmert		Germany
zylazine	sigma	7361-61-7	Germany