גישת ניתוק תא יחיד לניתוח מולקולרי של שלפוחית השתן בעכבר בעקבות פגיעה בחוט השדרה

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא להחיל פרוטוקול ניתוק רקמות ממוטב על מודל עכבר של פגיעה בחוט השדרה ולאמת את הגישה לניתוח תא יחיד על ידי ציטומטריית זרימה.

Abstract

אנו מתארים את היישום של פגיעה בחוט השדרה בעכברים כדי לעורר detrusor-sphincter dyssynergia, חסימת שקע שלפוחית השתן תפקודית, ושיפוץ דופן שלפוחית השתן הבאים. כדי להקל על הערכת ההרכב התאי של דופן שלפוחית השתן בעכברים פצועים שאינם פצועים בבקרה ובחוט השדרה, פיתחנו פרוטוקול דיסוציאציה אופטימלי התומך בכדאיות גבוהה של התאים ומאפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות נפרדות על ידי ציטומטריית זרימה.

פגיעה בחוט השדרה נוצרת על ידי טרנסציה מלאה של חוט השדרה בבית החזה. בזמן קצירת הרקמות, החיה חדורת מלוחים עם אגירת פוספט תחת הרדמה עמוקה ושלפוחיות השתן נקצרות לתוך החיץ של טיירוד. רקמות טחונות לפני הדגירה במאגר העיכול כי כבר אופטימיזציה המבוססת על תכולת הקולגן של שלפוחית השתן של העכבר כפי שנקבע על ידי חקירה של מסדי נתונים ביטוי גנים זמין לציבור. לאחר הדור של השעיית תא יחיד, החומר מנותח על ידי cytometry זרימה להערכת הכדאיות של התא, מספר התא ותת-אוכלוסיות ספציפיות. אנו מראים כי השיטה מניבה אוכלוסיות תאים עם יותר מ 90% הכדאיות, וייצוג חזק של תאים ממוצא mesenchymal ואפיתל. שיטה זו תאפשר ניתוח מדויק במורד הזרם של סוגי תאים דיסקרטיים בשלפוחית השתן של העכבר ובאיברים אחרים פוטנציאליים.

Introduction

הפרעות לתפקוד תקין של שלפוחית השתן יכולות להוביל לירידה באיכות החיים של אנשים רבים. על מנת לקבל הבנה טובה יותר של איך פציעה או מחלה משבשת תפקוד תקין של שלפוחית השתן, חשוב לחקור את המצב הביולוגי הרגיל של תאים בתוך שלפוחית השתן וכיצד הם משתנים תחת הפרעה ניסיונית. עד כה, עם זאת, אוכלוסיות התאים הספציפיות השוכנות בתוך שלפוחית השתן, וכיצד הן משתנות עם פציעה, התאפיינו באופן חלקי.

שיטות פרופיל תא יחיד כגון cytometry זרימה או רצף RNA תא יחיד (scRNA-seq) יש פוטנציאל לשפוך אור על סוגי תאים ספציפיים בתוך שלפוחית השתן. עם זאת, עבור גישות אלה להיות רקמה אינפורמטיבית חייב להיות מתעכל באופן שאינו משפיע על הכדאיות, ביטוי גנים, ואת אחוזי אוכלוסיית התא הייצוגי של הרקמה שנקטפו. פרוטוקולים המעסיקים הפרדה אנזימטית יכולים להשפיע על ביטוי סמן פני השטח באמצעות פעילות פרוטאז ללא הבחנה¹, ובכך להשפיע על זיהוי התא על ידי cytometry זרימה, ואילו תהליך הדיסוציאציה עצמו יכול להוביל אינדוקציה של גנים מוקדמים מיידיים, כפי שתואר לאחרונה על ידי ואן דן ברינק ועמיתיו². המחברים הראו כי למרות תת-אוכלוסיית מושפע דיסוציאציה היה קטן, זה יכול לעורר אות מזהם חזק במחקרים ביטוי בתפזורת בשל רמות ביטוי גבוהות של גנים מוקדמים מיידית. בנוסף, משך פרוטוקול הדיסוציאציה המושפע זיהה רמות ביטוי בתפזורת של גנים המוצגים כייחודיים לכמה אוכלוסיות משנה. לפיכך, ערכות נתונים של תא יחיד שנוצרו מבלי להביא בחשבון את ההשפעה של פרוטוקול הדיסוציאציה עשויות להניב שינויים בביטוי הגנים הנובעים משיטת הדיסוציאציה, בניגוד לביולוגיה הבסיסית. תצפיות אלה מצביעות על כך שיש לפרש בזהירות נתוני תעתיקים של תא יחיד שפורסמו, וכי יש לאמת את התוצאות בשיטות עצמאיות.

אמנם, שיטות דיסוציאציה קשות וממושכות עשויות לשנות את ביטוי הגנים בתאים²; בידוד יעיל של תאים חיוני כדי לקבל ייצוג מדויק של סוגי התאים הקיימים. מכיוון ששלפוחית השתן היא איבר מורכב המורכב מסוגי תאים מרובים, אוכלוסיות מסוימות כגון תאים urothelial או stromal עשויות להיות מיוצגות באופן יחסי, בעוד שסוגי תאים אחרים כגון פיברובלסטים קיימים בתוך מטריצה חוץ-תאית ויכולים להיות מאתגרים לבידוד. דיסוציאציה הופכת למאתגרת עוד יותר אם שלפוחית השתן עברה שיפוץ ופיברוזיס משמעותיים כגון זה שנצפה בפגיעה בחוט השדרה^3,4 או חסימת שקע שלפוחית השתן^5,6.

כאן, אנו מתארים שיטת ניתוק רקמות אופטימלית לניתוח תא יחיד במורד הזרם בשלפוחית השתן הפגועה של העכבר. באמצעות ציטומטריית זרימה, השווינו ארבעה פרוטוקולי עיכול אנזימטיים ליכולתם להניב השעיית תא יחיד, לתמוך בכדאיות התא ולשמור על השיעור הנכון של אוכלוסיות התאים. בהתבסס על ניתוח זה, אנו מסיקים כי מזעור מוות תאי, אגרגטים תאיים, חומצות גרעין לא תאיות ומעכבים פוטנציאליים של ניתוח במורד הזרם הם קריטיים להשגת נתונים באיכות גבוהה.

Protocol

הנהלים בוצעו בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות. כל הניסויים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של בית החולים לילדים בבוסטון.

הערה: עכברים שוכנו במתקן בעלי חיים מוכר AAALAC עם גישה לליביטום מודעה למזון ומים. עכברים נקבה ב 8 \u201212 שבועות של גיל שימשו לניסויים אלה. בהתחשב באופי הפגיעה, ניתנה העשרה תזונתית נוספת לעכברים כדי להבטיח את שלומם.

1. התעברות נמוכה של חוט השדרה בבית החזה בעכברים

1. הכנה לפני העברת חוט השדרה
   הערה: המכשירים הכירורגיים הדרושים להליך זה הם מספריים אביביים מנתחים מיקרו, מלקחיים זעירים מנתחים, נהג מחט תפירה מיקרו, hemostats, ו 7-0 פוליגלקטין 910 תפרים. אספקה כירורגית אחרת הנדרשת הם וילונות כירורגיים, יריעות סטריליות לשדה כירורגי, ספוג גזה, אפליקטורים כותנה קצה, ו 1 מזרקים מ"ל עם מחטים 25 G.
   1. אוטוקלאב את המכשירים הכירורגיים ואת האספקה לפני הניתוח.
   2. נקו את האזור הכירורגי ואת רפידות החימום במגבוני אלכוהול. כרית חימום אחת תשמש במהלך הניתוח והשנייה לתקופה שלאחר הניתוח המיידית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החיה עד להחזרת הפעילות המלאה.
   3. השתמש זכוכית מגדלת (2.5x או יותר) כדי לבצע את ההליך הכירורגי.
   4. הפעל את רפידות החימום, את מקור האור ואת מעקר חרוזי הזכוכית כדי להיות מוכן לשימוש במהלך ההליך.
   5. פתח את הווילונות הכירורגיים ואת המכשירים. השתמש כפפות סטריליות לעטוף את השדה הכירורגי ומניחים את המכשירים בתחום הכירורגי.
2. הכנת בעלי החיים
   1. מביאים את העכברים לחדר הניתוח וגם מביאים כלוב נקי לעכברים הפצועים בחוט השדרה.
   2. לנהל הרדמה על ידי הצבת העכבר בתא האינדוקציה עם זרימת isoflurane להגדיר ב 3.0%, זרימת חמצן ב 1 L / min, ויניקה ב 20 מ"מ ח"ג עד שאין תגובה צביטת כפות רגליים.
   3. מיד לשקול את החיה ולאחר מכן למקם את החיה בתנוחה נוטה על כרית החימום.
   4. מניחים את חרוט ההרדמה בנוחות על אפו של העכבר, מעבירים את זרימת הגז מתא האינדוקציה לקונוס האף, ומגדירים את זרימת האיזופלוראן ל -2% ואת זרימת החמצן ל- 1 L / min.
   5. ודא כי החיה מורדמת כראוי עם היעדר תגובה לצביטת כפות רגליים. תדביק את איברי החיה לרפידת החימום. מניחים חתיכה מגולגלת של ספוג גזה מתחת לחזה התחתון כדי לרומם ולהגמיש לפתוח את חוליות בית החזה התחתון.
   6. יש למרוח חומר סיכה אופטלמולוגי על שתי העיניים. מתן משככי כאבים (Meloxicam, 10 מ"ג/ק"ג, תת עורית) ואנטיביוטיקה (Enrofloxacin, 5 מ"ג/ק"ג, תת עורית).
      הערה: משתמשי קצה צריכים להשתמש במשככי כאבים ואנטיביוטיקה המומלצים על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המקומית שלהם.
   7. לממיש את התהליך הספין הבולט ביותר בעמוד השדרה החזי אשר בדרך כלל מתאים עם תהליך ספינוס T13⁷. לגלח אזור מלבן אורך על הגב של העכבר מהצוואר התחתון אל ממש מתחת לתהליך ספינוס הבולט ביותר (T13) עבור 1 ס"מ בכל צד של קו האמצע.
3. הליך כירורגי
   1. מכינים את האזור המגולח עם 10% תמיסת יוד povidone ו 70% אתנול שלוש פעמים לחילופין באופן מעגלי החל מאתר החתך עובד כלפי חוץ ולאחר מכן לכסות את החיה עם ספוג סטרילי 4 x 4 גזה עם חלון במרכז overlying השדה הכירורגי.
   2. הפוך חתך 1.5 ס"מ בקו האמצע של הגב באמצעות מספריים בסדר המסתיים בתהליך ספינוס הבולט ביותר (T13). החתך צריך לכלול את העור ואת fascia שטחי. באמצעות מספריים להפריד את העור fascia שטחי משני הצדדים כדי לחשוף את התהליכים ספיני ואת השרירים paraspinous שמסביב.
   3. באמצעות ניתוח חד וקהה להפריד את השרירים מן התהליכים ספיני laminae של חוליות T9, T10, ו T11.
   4. מחלקים בחדות את הרצועות הבין-ראשיות בין T9 ל- T10 ובין T10 ל- T11 באמצעות מספריים עדינות ולאחר מכן מוציאים את התהליך הסיבובי של T10 ומבצעים בזהירות כריתת למין T10 דו-צדדית כדי לחשוף את חוט השדרה. ודא כי laminae הם נכרתו לחלוטין.
   5. חוצים את חוט השדרה באמצעות מספריים עדינות. דימום מינימלי מתרחש בדרך כלל בשלב זה עקב transection של כלי חוט השדרה. לדחוס את אזור הדימום עם מוליך כותנה סטרילי הטה כדי להשיג עצירת דימום. לאחר אישור עצירת דימום מלאה, סגור את העור עם 7-0 פוליגלקטין 910 תפרים רציפים.
   6. לנהל 1 מ"ל של תמיסת מלח תת עורית כדי למנוע התייבשות לאחר הניתוח.
4. טיפול לאחר הניתוח
   1. מניחים את החיה על כרית חימום עד להחלמה מלאה, ואז מעבירים לכלוב רק לעכברים פצועים בחוט השדרה.
   2. טיפול לאחר הניתוח כולל התבוננות ושקילה של בעלי החיים מדי יום, וניטור של אתר החתך לסימני זיהום עד 7 ימים. יש לתת תמיסת מלח 1 מ"ל, משכך כאבים (meloxicam 10 מ"ג/ק"ג) ואנטיביוטיקה (אנרופלוקסאצין 5 מ"ג/ק"ג) כולם תת עורית מדי יום במשך 3 ימים.
      הערה: משתמשי קצה צריכים להשתמש במשככי כאבים ואנטיביוטיקה המומלצים על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המקומית שלהם.
   3. בצע ביטוי ידני של שלפוחית השתן (תמרון Credé) כל 12 שעות עד שהחיה מסוגלת להשתין בכוחות עצמה (בדרך כלל ב 10 עד 14 ימים). החזיקו את החיה ביד אחת ועסוו את הבטן התחתונה ביד השנייה, ואז הרגישו ודחסו בעדינות את שלפוחית השתן המנופחת עם האצבע והאגודל המורה. דחיסה חולפת עדינה צריכה לסירוגין עם הרפיה. לאחר ביטוי ידני, לשטוף את הבטן התחתונה עם מי ברז להתייבש בעדינות עם מגבת נייר ללא שפשוף מוגזם.
      הערה: גודל קטן של שלפוחית השתן לפני תחילת הביטוי וההרטבה של הבטן התחתונה עם שתן הם אינדיקציות כי החיה צברה את היכולת לבטל בכוחות עצמה.
   4. כדי למזער את הירידה במשקל, לספק העשרה תזונתית לעכברים בצורה של ג'ל מזין ופינוקים מזינים אחרים (רכות בייקון, פריכות פירות עקיצות ירקות) להציב על הרצפה של הכלוב עבור גישה קלה הערה: במחקר זה, עכברים היו מותזים שלפוחיות השתן רכשה ב 8 שבועות לאחר SCI.
5. סיבוכים לאחר הניתוח
   1. למזער את הפוטנציאל לקרע של שלפוחית השתן עקב ביטוי שלפוחית השתן ידנית נלהבת מדי על ידי לא מלא להביע את שלפוחית השתן.
   2. למנוע excoriation של העור perineal מחשיפה מתמשכת כדרור שתן מן הסוגר פסול באמצעות שטיפת האזור perineal עם מי ברז. למזער את הדלקת באמצעות יישום של משחה אנטיביוטית משולשת.
      הערה: חסימת השופכה עקב קריש דם במהלך התקופה של המטוריה חולפת או מזרע coagulum עקב שפיכה מדרדרת בעכברים זכרים עלולה להתרחש בעקבות פגיעה בחוט השדרה. חסימת שופכה מלאה בעכברים זכרים מגיעה לעתים קרובות לשיאה בקרע בשלפוחית השתן ובמוות. מניסיוננו התדירות של חסימת השופכה בעכברים זכרים שהובילה למוות הייתה 10%.

2. זלוף ורכש רקמות

הערה: עבור ניתוחים במורד הזרם של סוגי תאים מסוימים כגון תאים חיסוניים ברקמות היקפיות כדאי להסיר דם על ידי זלוף בזמן קצירת רקמות, כמתואר להלן.

1. יש לבצע הרדמה כאמור בהליך הכירורגי (שלב 2.2) ולאשר כי החיה מורדמת כראוי ללא תגובה של צביטה מראש (החיה משותקת, ולכן ההידבקויות האחוריות הצטמצמו והתגובה של הצביטה האחורית הופכת ללא רלוונטית).
2. מניחים את החיה בתנוחת סופין ומנגבים את הבטן והחזה עם 70% אתנול כדי להרטיב את הפרווה כדי למנוע ממנה להיכנס לאתר הניתוח.
3. בצע לפרוטומיה בקו האמצע מהאגן לסרעפת. חותכים את הסרעפת מהצלעות.
   הערה: בעקבות שלב זה, מהירות חשובה מאז הפרש הלחץ בבית החזה כבר לא קיים הריאות לא יכול לנפח, ולכן החיה מתחילה להיחנק.
4. חותכים את בית החזה פתוח לאורך הצלעות בצד שמאל וימינה בעקבות גבול סחוס העצם על קו מקביל עצם החזה, מתחיל בסרעפת וממשיך עד הצלע הראשונה.
5. מניחים את קיר בית החזה הראשון השלם מעל ראשו של החיה ולתקן אותו במצב זה באמצעות מלחצי מגבת. אין לחתוך את דופן בית החזה הפנימי שכן זה יגרום לדימום חמור משני עורקי בית החזה הפנימיים.
6. חותכים את קרום הלב באמצעות מספריים בסדר.
7. לחבר מחט 23 G למנגנון זלוף, ולאחר מכן להכניס אותו לתוך החדר השמאלי לאט לתוך האב העורקים, מקפיד לא לנקב אותו.
   הערה: מנגנון הזלוף כולל משאבת זלוף ומזרק 50 מ"ל המחובר לצינורות תוך ורידי.
8. התחל את הזחילה במהירות לעשות חתך קטן עם קצה המספריים בסדר באטריום הנכון לניקוז. יש להקפיד לא להציג בועות אוויר במהלך עירוי נוזלים.
9. בצע זלוף עם תמיסת מלח אגירה פוספט (PBS) לרוץ ב 15 מ"ל / דקה. הזלוף הושלם כאשר הניקוז צלול ומושג צבע בהיר של הכבד (איור 1).
   הערה: הזמן הממוצע לזלוף היה 3.5-4 דקות. זלוף לקוי מתבטא בהתקדמות איטית של בלינצ'ינג של רקמות ובדרך כלל נובע ממיקום שגוי של המחט בחדר השמאלי. התאמת המחט והארכת משך הזלוף למשך 1 עד 2 דקות יבטיחו זלוף נאות של רקמות.
10. יש להפסיק את הזיעה ולנתח את שלפוחית השתן ללא פדיקלים ושופכה של כלי הדם ולמקם אותה בצינור מיקרוצנטריפוג המכיל את הפתרון של טיירוד קר כקרח.

3. עיכול שלפוחית השתן בשליטה ועכברים שנפצעו בחוט השדרה

הערה: על מנת לגבש תערובת עיכול יעילה המותאמת לשלפוחית השתן של העכבר ביקשנו להתאים את יחידת האנזימים המשמשת להשחתת רכיבי המטריצה החוץ-תאיים השולטים כגון קולגנים וחומצה היאלורונית. לכן, השתמשנו בנתוני רצף RNA הזמינים לציבור שנוצרו על ידי פרויקט EnCODE של העכבר (BioProject: PRJNA66167) כדי לחלץ קריאות לקילו-בייס למיליון (RPKM) וטאבולה מוריס⁸ להערכת ביטוי מרחבי בתוך שלפוחית השתן. קולגנים 1, 3 ו-6 היו שלושת הגנים הבולטים ביותר בקרב 42 קולגנים שונים(איור 2A). הביטוי של קולגנים אלה סינתאז hyaluronan 1 (Has1) נצפו בעיקר בתאי שריר פיברובלסטים של דופן שלפוחית השתן (איור 2B).

1. הכנת מאגרים ופתרונות
   1. הכן פתרון נתרן Tyrode לפי טבלה 1 בבקבוק נקי 500 מ"ל. הוסף 300 מ"ל של ddH₂O. הפתרון הוא חומצי לאחר ההכנה. כוונן את ה-pH ל-7.4 באמצעות NaOH. להביא נפח ל 500 מ"ל באמצעות H מזוקק כפול₂O, ואז aliquot ולאחסן ב -20 °C (69 °F).
      הערה: מאגר זה שומר על ה- pH ועל האיזון האוסמוטי במאגר העיכול ומספק לתאים מים ויונים אנאורגניים חיוניים. הוא מכיל מגנזיום, כמו גם גלוקוז כמקור אנרגיה. האשלגן בתמיסה מספק השפעות מגן על הפעילות האלקטרומכנית בתמיסת התא המבודד. אבקת מלחים הם hygroscopic ויש להגן מפני לחות. כל התוכן של התערובת יש להשתמש מיד לאחר ההכנה. הכנת תמיסת מלח מרוכזת אינה מומלצת מכיוון שמשקעים עשויים להיווצר. עיקור באמצעות סינון (מסנן 0.22 מיקרומטר) יכול להתבצע אם התאים הולכים להיות תרבותיים לאחר הניתוח.
   2. הכן פתרון עיכול אנזימטי בצינור חרוט 15 מ"ל על ידי הוספת כמויות וכמויות מומלצות עבור כל רכיב (טבלה 2). הוסף פתרון נתרן Tyrode עד 2.5 מ"ל. וורטקס ביסודיות להתמוסס.
      הערה: פפאין הוא פרוטאז סולפידריל מקריקה פפאיה לטקס. פפאין יש ספציפיות רחבה וזה יהיה להשפיל את רוב מצעי החלבון⁹. פפאין הוכיח פחות מזיק ויעיל יותר מאשר פרוטאזות אחרות בפרוטוקולים ניתוק התא¹⁰. אנו מספקים פרטים על ארבעת פרוטוקולי הניתוק בטבלה 2; צפינו בפרוטוקול סעיף 3 כדי לתמוך בכדאיות הגבוהה ביותר (93%) של השעיות תאים שהוכנו משלפוחית השתן של העכבר.
2. הליך דיסוציאציה והכנת השעיית תאים
   1. לאסוף את שלפוחית השתן מעכברים לאחר זלוף.
   2. לנקב את שלפוחית השתן כדי לשחרר תוכן, אם בכלל.
   3. הוסף 100 μL של הפתרון של Tyrode לצינור צנטריפוגה ריק 1.5 מ"ל ו tare. מניחים את שלפוחית השתן בצינור ומשקלים שוב כדי לקבוע משקל שלפוחית השתן מדויק.
   4. מניחים שלפוחית השתן על צלחת פטרי 10 ס"מ על קרח ומוסיפים 100 μL של הפתרון של Tyrode לכרייה.
   5. באמצעות מספריים כירורגיים, לחתוך חתיכות קטנות ככל האפשר תוך מזעור זמן טחון לא יותר מ 2\u20123 דקות לכל שלפוחית השתן. אם איגום רקמת שלפוחית השתן מבעלי חיים מרובים, טחון את שלפוחיות השתן בבת אחת.
   6. מעבירים את רקמת שלפוחית השתן הטחונה באמצעות קצה צינור רחב נשא לתוך 2.5 מ"ל של מאגר עיכול עבור כל שלפוחית השתן. כוונן את עוצמת הקול אם שלפוחיות מרובות מאוחסנות במאגר. הדגירה את הרקמה בתמיסת העיכול ב 37 °C (69 °F) באינקובטור על מערבל מים במשך 40 דקות.
   7. בסוף תקופת הדגירה, להסיר צינור העיכול מן החממה. פתרון עיכול תלת-טורט (פיפט למעלה ולמטה) באמצעות פיפטה של 5 מ"ל למשך דקה.
   8. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 350 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של פתרון ניתוק התא. מניחים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס על מערבל מאגוזים במשך 10 דקות.
   9. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 350 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של מאגר תמוגה RBC (1x). דגירה במשך דקה.
   10. הוסף PBS של 9 מ"ל כדי לדלל את מאגר RBC ולהפסיק את התמוגה של RBC.
   11. להעביר תאים דרך מסננת תא μm 70 לתוך צינור חרוט 50 מ"ל, באמצעות הבוכנה מזרק כדי לגרד קלות את מסננת התא כדי להבטיח מעבר תא מלא. הקפד לאסוף את הנוזל שעובר דרך מסננת אבל עלול להיתפס על החלק התחתון של מסננת.
   12. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 350 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 200 μL של חיץ כתמי תאים (PBS עם 2% FBS).
   13. לספור את התאים.
3. כשל חיסוני של תאים ספציפיים עבור ציטומטריית זרימה
   הערה: כדי לזהות סוגים שונים של תאים בשלפוחית השתן, עיצבנו לוח ציטומטריה זרימה מרובה צבעים. כדי לבצע פיצוי ולגבש אסטרטגיית גת מתאימה, אנו כוללים פקדים לא מוכתמים ופלואורסצנטיים מינוס פקד אחד (FMO). פקדי FMO חשובים לאוכלוסייה חיובית בשער, במיוחד כאשר החלק החיובי עמום. הליך הכתם הוא כדלקמן.
   1. חסימת קולטני FcγRII/III בתאים
      הערה: אנו ממליצים לחסום כריכה לא ספציפית של נוגדנים חד שבטיים על ידי דגירה מוקדמת של תאים עם נוגדנים קולטן חד שבטי נגד Fc, או חלבון Fc רקומביננטי.
      1. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 350 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהוסיף מאגר כתמי תאים.
      2. השלך supernatant ולחסום קולטני FcγRII / III על תאים כדי למנוע כתמי נוגדנים לא ספציפיים על ידי הוספת נוגדני CD16 ו- CD32 במאגר כתמי תאים בדילול של 1:100.
      3. דגירה על קרח במשך 10 דקות.
         הערה: אין צורך לשטוף את התאים; תאים יכולים להיות מוכתמים ישירות לאחר שלב זה.
   2. כתמים עבור FMOs
      הערה: בקרת פלואורסצנטיות מינוס אחת (FMO) היא צינור של כל הפלואורוכרומים המשמשים בניסוי המכיל את כל הפלואורוכרומים למעט אחד.
      1. לדוגמה, אם לאחד יש 4 פלואורוכרומים שונים (A, B C ו- D + Annexin V ו פרופידיום יודיד (PI)), הכן את צינורות FMO כדלקמן. צינור FMO 1: נוגדנים עם B, C, D פלואורוכרומים + (נספח V ו- PI); צינור FMO 2: נוגדנים עם A, C, D פלואורוכרומים + (נספח V ו- PI); צינור FMO 3: נוגדנים עם A, B, C פלואורוכרומים + (נספח V ו PI); צינור FMO 4: נוגדנים עם A, B, C, D פלואורוכרומים + (נספח V); צינור FMO 5: נוגדנים עם A, B, C, D פלואורוכרומים + (PI).
      2. קחו למשל את טבעו של הפלואורוכרום המצומד לנוגדן נספחין V.
   3. מכתים את התאים החסומים בנוגדנים הרצויים
      1. דגירה תאים חסומים עם תערובות הורים מתאימות של נוגדנים מצומדים פלואורופור נגד החלבונים הרצויים במשך 20 דקות על קרח מוגן מפני אור. זכור לכלול FMOs.
      2. לשטוף תאים עם 1 מ"ל של חיץ כתמי תאים הוסיף לכל צינור ולאחר מכן צנטריפוגה שוב ב 350 x g במשך 5 דקות ב 10 מעלות צלזיוס.
      3. השלך את supernatant ו resuspend גלולת התא ב 200 μL של חיץ כתמי תאים. יש לשמור על הקרח עד שניתן יהיה לרכוש נתוני פלואורסצנטיות באמצעות ציטומטר זרימה.
   4. החל כתם נספח V / PI.
      1. הכן פתרון עבודה של PI (100 מיקרוגרם / מ"ל) במאגר איגוד נספח 1x כמתואר בפרוטוקול היצרן עבור ערכת אפופטוזיס התא המת.
      2. קבע את צפיפות התא ושים לב למאגר ולאמצעי האחסון שבהם הם מאוחסנים.
      3. דגימות צנטריפוגה ב 350 x g במשך 5 דקות, להשליך את התאים supernatant ו resuspend במאגר 1x נספח מחייב לצפיפות של ~ 1 x 10⁶ תאים / מ"ל בכרך של 100 μL.
      4. הוסף FITC-Annexin V (5 μL) ופתרון עבודה PI (1 μL) לכל מדגם (100 μL), כמתואר בפרוטוקול היצרן, ואת הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
      5. הוסף 400 μL של 1x נספח מחייב מאגר לדגימות, לערבב על ידי היפוך ולשמור על קרח עד cytometry זרימה.
4. כיול FACS
   1. בקרת ציטומטריה וטוהר זרימה
      1. התחל ניתוח cytometry זרימה על ידי מדידת התאים מוכתמים כדי לציין מורפולוגיה של התא ואת השוקת של fluorochromes.
      2. כוונן את פיזור הצד (SSC) ואת הפיזור קדימה (FSC) על-ידי שינוי המתחים של כל פרמטר פלואורסצנטי. למדוד את פליטת הפלואורסצנטיות ב 530 ננומטר (Annexin V) ו >575 ננומטר (PI).
      3. הגדר את האוכלוסיה השלילית בעשור הראשון באמצעות הרשתות בכל התוויית נקודה. מקם כל פקד FMO בציטומטר ותקן את החפיפה הספקטרלית עד לחציוני האוכלוסיה השלילית והחיובית.
      4. מדוד 100,000 אירועים. למדוד תאים מוכתמים בסמנים ספציפיים וליצור שערים עבור אוכלוסיות תאים של עניין.
5. ניתוח נתונים
   1. לאסוף את הנתונים מן cytometer זרימה. פתח את התוכנה כדי להמחיש את סביבת העבודה לניתוח.
   2. יצירת סביבת עבודה
      1. יבא קבצי FCS על-ידי גרירתם לסביבת העבודה. קבצים יהיו גלויים במקטע הדוגמה והקבוצה של סביבת העבודה. לחץ פעמיים בשם לדוגמה כדי לפתוח את הקובץ.
      2. השתמש באזור פיזור צדדי (SSC-A) עבור ציר y ואזור פיזור קדימה (FSC-A) עבור ציר ה- x(איור 3A). לחצו על הסמל לצייצן.
      3. צור שער סביב אוכלוסיית התאים המעניינת בחלקת הנקודות על-ידי לחיצה כדי ליצור צומת שער ולאחר מכן המשך ללחוץ סביב אוכלוסיית התאים עד להשלמתה; לחץ פעמיים כדי לסגור את השער.
      4. תן שם לשער בהתאם לאוכלוסייה שנלכדה (למשל, "כל התאים") ולחץ על אישור.
         הערה: לחיצה כפולה בתוך השער "כל התאים" תפתח חלון גרף חדש המציג רק את האירועים הכלולים ב"כל התאים".
      5. התאם את ציר ה- y של התוויית הנקודה החדשה ל- SSC-H (גובה פיזור צדדי) על-ידי לחיצה על החץ השחור ובחר לשנות את ציר ה- y.
         הערה: שערים אלה עבור תאים בודדים (סינגלים בודדים) ואינם כוללים כפולים או אגרגטים גדולים יותר (איור 3B). מכיוון שלתאים בודדים יש רוחב ואורך פרופורציונליים, עליהם להיות מיוצגים כאוכלוסייה באלכסון. תאים הנופלים מחוץ לשער אלכסוני זה הם כפולים או אגרגטים גדולים יותר.
      6. לחץ פעמיים על השער כדי לנתח תאים נמקיים (PI חיובי), אפופטוטי מוקדם (Annexin V חיובי, PI שלילי) ו apoptotic מאוחר (Annexin V חיובי, PI שלילי) תאים (איור 3C).
      7. סמן את ציר ה- x כ- Annexin V ואת ציר ה- y כ- PI.
         הערה: במקרים מסוימים, שבהם עוצמת האות נמוכה, אוכלוסיות התאים עשויות להיראות כבעלות ערכי פלואורסצנטיות שליליים, כתוצאה מתיקון הרקע. במקרה זה, מומלץ לבצע טרנספורמציה דו-מעריכית. כדי לעשות זאת, לחץ על T לצד ציר y ובחר התאמה אישית של הציר. בחלון החדש שנה את קנה המידה לדו-מעריכי (Biex), הוסף ערכים שליליים לצירים על-ידי הגדלת בסיס הרוחב ולחץ על החל. פעולה זו תשפר את הרזולוציה של אירועים בעוצמת אות נמוכה.
      8. הצג נתונים כתווית ספירה. השתמש בכרטיסיה Option ממש מתחת לציר ה- x ובחר התוויית מונה מהתפריט.
      9. צייר שער קוואט על המגרש כדי להגדיר 4 אוכלוסיות יעד נפרדות.
      10. לחץ בחלק העליון של החלון כדי לפתוח את עורך הפריסה, על-ידי לחיצה בעורך פריסה וגרור אוכלוסיות לכל אזור נפרד.
      11. מקם התוויות בעורך הפריסה על-ידי גרירה ושחרור של אוכלוסיות מסביבת העבודה לחלון עורך הפריסה.
   3. הדמיה באמצעות היסטוגרמות
      1. בחר היסטוגרמה מהכרטיסיה אפשרויות.
      2. החל שער כדי לבחור נספח V חיובי תאים; לחלופין, ניתן להגדיר אוכלוסיות חיוביות ושליליות באמצעות הכלי bisector. מקטע המדגם חייב כעת להציג את האוכלוסיות השונות בצורתן ואת ההירארכיה שלהן.
      3. להשוואת דוגמאות, גררו את כל ההיסטוגרמות זו על גבי זו; לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ההיסטוגרמה ומהיסטוגרמה בחר היסט סטאגר.
   4. הוספת ניתוחים סטטיסטיים
      1. פתח את הכרטיסיה Statistic על-ידי לחיצה כפולה על אוכלוסיית העניין. בחר את הפונקציה להחלה ואת הפרמטר המעורב.
      2. חזור על הפעולה עם אוכלוסיות אחרות, על-ידי גרירת סמל סיגמא לשם האוכלוסיה.
      3. החל את הניתוח על כל הדגימות על ידי בחירת אסטרטגיית gating ממדגם הריבית וגרירתו לקבוצה המוגדרת על ידי סמן הריבית, למשל Annexin V.
      4. צור שערים בדגימות הבקרה של FMO והגדר אוכלוסיות שליליות וחיוביות; אסטרטגיית גטינג זו תחול על הניסוי כולו (איור 3D\u2012F).
         הערה: בדוק כל דגימה בנפרד כדי לוודא ש-gating נכון ושנה במידת הצורך.
      5. אם התאים הוכתמו בנוגדן סמן (למשל, CD45) השתמש ב- FMO המתאים ושער בהתאם.
      6. כדי לייצא את הפריסה, לחץ על קובץ | | 'ייצוא תמונה' בחר תבנית קובץ (למשל, jpg, pdf).
      7. לחץ על צור טבלה כדי לפתוח חלון עם הגירסה הסופית של הטבלה.
      8. יצא את הטבלה על-ידי בחירה באפשרות | קובץ שמירה בשם | שם קובץ.

תוצאות

הליך כירורגי
ההצלחה של העברת חוט השדרה בבית החזה נקבעת על ידי הערכה של מספר פרמטרים, שהבולט שבהם הוא שיתוק בדיעבד. החיה נעה רק באמצעות רגליים קדמונות שלה, גרירת hindlimbs שלה. אחרת רמות הפעילות, כולל האכלה, טיפוח וערנות הם בדרך כלל נורמליים. בנוסף, בעלי חיים מאבדים שליטה בשלפוחית השתן מרצונם וכתוצאה מכך הצורך בביטוי ידני של שלפוחית השתן על ידי החוקר כל 12 שעות עד ביטול רפלקס חוזר ב 10 עד 14 ימים לאחר פציעה. לאחר המתת חסד, סימנים נוספים להצלחת הפציעה מתייחסים בעיקר לעלייה ביחס משקל שלפוחית השתן לגוף, המעידה על שיפוץ רקמות. ניתוח היסטולוגי מגלה היפרפלזיה בתוך תאי השרירים urothelial וחלק³.

הכנת השעיית תא בודד
באמצעות נתוני ביטוי הזמינים לציבור, נקבעה העשרת רקמת שלפוחית השתן לחלבוני מטריצה חוץ-תאית (איור 2) ושימשה לניסוח תערובת העיכול. מאז קולגנים הם מרכיבים מרכזיים של דופן שלפוחית השתן^11,12, הראשון ביקשנו לקבוע את הקולגן הנפוץ ביותר בשלפוחית השתן של העכבר באמצעות ערכות נתונים פרופיל RNA שנוצר על ידי פרויקט ENCODE עכבר¹³. הניתוח שלנו הראה כי קולגן 1A1, קולגן 3A1, קולגן 1A2 וקולגן 6A1 הם סוגי הקולגן הנפוצים ביותר בשלפוחית השתן של העכבר(איור 2A). השתמשנו גם טאבולה מוריס (סיכום של נתוני תעתיק תא יחיד מעכבר (שרירים))⁸ כדי לקבוע את רמת ביטוי mRNA של קולגנים 1, 3, 6 ו hyaluronan. הנתונים מאפשרים השוואה ישירה ומבוקרת של ביטוי גנים בסוגי תאים המשותפים לרקמות. ניתוח זה גילה כי הביטוי של רכיבי מטריצה חוץ-תאית אלה נפוץ יותר בסוגי התאים המזנכימליים ולא באורותליום (איור 2B).

השפעת הדיסוציאציה על הכדאיות של תאים מבודדים בשלפוחית השתן
ניתוח cytometry זרימה הראה כי עיכול אנזימטי באמצעות 4 פרוטוקולים שונים הניבו הכדאיות של 83%, 86%, 93% או 90%, בהתאמה. לפיכך, פרוטוקול סעיף 3 נחשב לבעל הערך הרב ביותר לשימור הכדאיות של התאים. כמו כן, ראינו שכ-4% מהתאים היו נמקיים (PI⁺/Annexin V^-)(איור 4A). תצפיות אלה מדגישות את היעילות של פרוטוקול העיכול ואת התועלת הנובעת על הכדאיות של התא.

השפעת פגיעה בחוט השדרה על אוכלוסיות שונות של תאים בשלפוחית השתן
ראינו עלייה משמעותית במספר התאים הכולל בשלפוחיות של עכברי SCI בהשוואה לבקרות. התבנית של חלקות הנקודות שהתקבלו משלפוחיות SCI הייתה גם שונה במקצת בקנה אחד עם שיפוץ איברים מתמשך עקב פגיעה בחוט השדרה (איור 4B: העמודה הראשונה). בהשוואה לבקרות, שלפוחיות השתן מחיות SCI הציגו עלייה משמעותית בתאים CD45 חיוביים.

איור 1: השלמת זלוף מייצגת עם צבע בהיר של הכבד. (A)מדגים את צבע הכבד בתחילת הזלוף. (B) מראה את צבע הכבד הבהיר בסוף זלוף. העכבר ב (A) היה עירוי חוט השדרה שבועיים לפני זלוף וכתוצאה מכך היפרטרופיה שלפוחית השתן ואת הבליטה שלה מתוך האגן בניגוד לעכבר ב (B) כי לא היה פגיעה בחוט השדרה; במקרה זה שלפוחית השתן קטנה ומוסתרת באגן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ביטוי תעתיקי של רכיבי מטריצה חוץ-תאית (ECM) בשלפוחית השתן של העכבר. (A) תרשים עמודות של 43 סוגי קולגן שונים. הביטוי מצוין על ידי קריאות לקילו-בייס של תעתיק, למיליון קריאות ממופות (RPKM) (נתונים נאספים מ- BioProject: PRJNA66167)¹⁴. (B)חלקות כינור של ביטוי גנים בסוגי תאים המתקבלות מספירה מיקרופלואידית מבוססת טיפה 3'-end בבריכה של דגימות שלפוחית השתן דיסוציאציה זכר ונקבה (זכר ונקבות). ספירות היו יומן מנורמל עבור כל תא באמצעות הלוגריתם הטבעי של 1+ ספירות לכל מיליון ln(CPM +1)⁸. מספר בדוי של 1 עלות לאלף חשיפות נוסף לפני נטילת לוגריתמים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: אסטרטגיית גטינג ובקרות FMO לקביעת התפשטות הפלואורסצנטיות. (A) בחירת אוכלוסיית תאים. (B)אסטרטגיית גטינג לרווקים. (C)גטינג לתאים נמקיים, ותאי אפופטוטיקה מוקדמים ומאוחרים באמצעות נוגדן PI ו- Annexin V. (D\u2012F) עלילת נקודה סכמטית של ציטומטריית זרימה צבעונית (למשל, נוגדנים הקשורים ל- A, B, C, D fluorochromes + (Annexin V ו- PI). זה מראה את הפלואורסצנטיות התפשטה לתוך הנוגדן עם ערוץ פלואורוכרום A המוצג על ידי בקרת FMO לעומת שליטה מוכתמת. קו מנוקד כתום מייצג את גבול הגה FMO בהשוואה לגבול לא מוכתם באדום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ציטומטריית זרימה של סוגי תאים שונים בשלפוחית השתן. (A) תרשימי זרימה מכתימים כפולים של Annexin V/PI. השילובים השונים של אנזימים וכימיקלים המשמשים לכל פרוטוקול מיוצגים מול עלילת הכדאיות המתאימה. נתונים אלה מדגימים את הכדאיות הגבוהה ביותר שהושגה בפרוטוקול סעיף 3. (B)היסטוגרמות מייצגות הממחישות את עוצמתם של Ly-6A/E (Sca-1) ו- CD326 (Ep-CAM) שזוהו בערוצים בודדים. (C) ההשפעה של SCI על אוכלוסיית התאים של שלפוחית השתן של העכבר. הפאנל העליון מראה תוצאות של כתמים על שלוש שלפוחיות נטושות המתקבלות מעכברים לא כירורגיים שליטה הלוח התחתון מראה את התוצאות של כתמים על שלושה בעלי חיים עם SCI. העמודה הראשונה היא אוכלוסיית התאים הכוללת. העמודה השניה מציגה את בחירת הג'ינג הבודד. העמודה השלישית מציגה את תת-האכלוס של תאים חיים שליליים עבור תאי B, תאי T ותאי NK. העמודה הרביעית מציגה את הכתמים עבור תאים חיים חיוביים עבור CD45. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

רכיב	סכום (עבור 500 מ"ל)	הטוחנות
נקלה (נקל)	4.091 גרם	140 מ"מ
KCl	0.186 גרם	5 מ"מ
MgCl2	0.0476 גרם	1 מ"מ
די גלוקוז	0.9 גרם	10 מ"מ
היפס (היפס)	1.19 גרם	10 מ"מ

טבלה 1: רכיבים להכנת הפתרון של Tyrode. הרכיבים שצוינו הם להכנת הפתרון של 500 מ"ל Tyrode.

רכיב	כמות	סעיף פרוטוקול 1	סעיף פרוטוקול 2	סעיף פרוטוקול 3	פרוטוקול סעיף 4
BSA	5 מ"ג	כן	כן	כן	כן
CaCl2	0.03 מ"מ	כן	כן	כן	כן
קולגנאז מסוג I	132.5 יחידות	כן	כן	כן	כן
קולגנאז סוג III	96.4 יחידות דיור	כן	כן	כן	כן
קולגנאז סוג VI	50 יחידות	-	-	כן	-
אופן דיון	10 יחידות	כן	כן	כן	-
פפאין (199	115 יחידות	-	-	כן	כן
פאן קולגנאז	50 יחידות	-	-	כן	כן
היולורונידדאז	10.5 יחידות	-	-	כן	כן
פזר את השני	1.25 יחידות	כן	כן	-	-
פתרון ניתוק תאים	1 מ"ל	כן	-	כן	-
אנזים רקומביננטי	1 מ"ל	-	כן	-	כן

טבלה 2: רכיבים להכנת מאגר עיכול. הרכיבים המצוינים הם להכנת תערובת עיכול 2.5 מ"ל (1 U מזרז את הידרוליזה של 1 μmol מצע לדקה ב 37 מעלות צלזיוס. עיין בגיליון נתוני המוצר להגדרת יחידה של כל אנזים).

Discussion

מודל הפגיעה בחוט השדרה של העכבר המתואר כאן מספק שיטה לשחזור כדי ליצור חסימת שקע שלפוחית השתן תפקודית עקב אובדן קואורדינציה בין התכווצות שלפוחית השתן לבין הרפיה בספינקטר השופכה החיצוני. זה בתורו מעורר שיפוץ עמוק של דופן שלפוחית השתן כבר 2 שבועות לאחר פציעה המאופיינת על ידי הרחבת תאי שרירים urothelial וחלק. צעדים קריטיים ביישום מודל SCI במכרסמים כוללים (i) תשומת לב קפדנית לביטוי ידני של שלפוחית השתן במהלך תקופת ההלם בעמוד השדרה הנובעת במשך 10\u201214 ימים לאחר פציעה; (ii) העשרה תזונתית כדי למזער את הירידה במשקל; ו-(iii) צמצום הפוטנציאל לצירופ שתן במיוחד לניסויים המשתרעים מעבר להחזרת רפלקסים. מגבלות המודל כוללות את הפוטנציאל לחסימת השופכה בעכברים מקרישי דם במהלך תקופת המטוריה חולפת, ובנוסף בעכברים זכרים מזרע קוגולום לאחר שפיכה לאחור לאחר הניתוח.

גישת ניתוק הרקמות המתוארת כאן ממחישה את החשיבות של התחשבות בשינויים מבניים ברקמות הנובעים מהעלבון הניסיוני, במקרה זה שיפוץ רקמות משמעותי בעקבות SCI שעשוי להשפיע על ניתוחים במורד הזרם. עם העלייה בניתוחי תאים בודדים זה קריטי כדי להבטיח כי ההבדלים שנצפו ביטוי גנים אינם רק תוצאה של הפרעות הנגרמות על ידי דיסוציאציה, אבל הם מייצגים באמת של שינויים ביולוגיים הבסיסיים הרלוונטיים למודל המחלה. השימוש בנתוני ביטוי הזמינים לציבור איפשר לנו לשנות את ניסוח מאגרי העיכול כדי להבטיח עיכול יעיל של מטריצה חוץ-תאית תוך מקסום הכדאיות. שינויים נוספים שניתן לשקול ביישומים עתידיים כוללים תוספת של actinomycin D, כדי לעצור את שעתוק של גנים מוקדמים מיידית רגישים לפרוטוקול ניתוק¹⁵.

טכניקת Pipeting היא חיונית בעת ניתוק רקמות או העברת תאים שכבר נמצאים בהשעיה. כדי להפחית את הנזק הפיזי לתאים מכוחות גזירה, חשוב פיפטה בעדינות ולאט במהלך ההשעיה מחדש של התא. מומלץ בדרך כלל להשתמש טיפים פיפטה רחב נשא. אם משתמשים בטיפים סטנדרטיים, חשוב במיוחד להשעיית תאי פיפטה בעדינות, כדי למנוע כוחות גזירה שאחרת היו פוגעים בתאים. באמצעות מסנני תאים הוא בלתי נמנע בפרוטוקול זה, עם זאת, ריכוז התא יכול לרדת על ידי 20% או יותר, מלווה אובדן נפח של 100 μL או יותר. אנו ממליצים כי ריכוז התא ייקבע לאחר מאמץ כדי להבטיח ספירת תאים מדויקת.

ב cytometry זרימה, פקדי FMO לספק מידה של רקע עקב דימום דרך האות מפסגות פליטה חופפות. הם אינם מדד של כריכת נוגדנים לא ספציפית, או כתמי רקע שעשויים להיות נוכחים כאשר נוגדן נכלל בערוץ זה. כדי להסביר את איגוד הנוגדנים הלא ספציפי, יש לכלול בקרות isotype מתאימות; עבור כתמי הרקע, יש לכלול פקדים שליליים. יחד, פקדים אלה מבטיחים מדידה מדויקת של אוכלוסיות תאים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5 X Magnifying Loupes
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle	ETHICON	J546
70 μm Cell Strainer	Thermofisher	22363548
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA	Millipore	SCR005
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL)	VWR	89049-168
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL)	VWR	89049-168
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	118213
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11	BD Biosciences	564590
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-5172	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647-100G
CaCl2	Sigma	2115-250ML
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-6412	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue	Biorad	1450003
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G
Collagenase Type I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196
Collagenase Type III	Worthington Biochemical Corporation	LS004182
Collagenase, Type 6	Worthington Biochemical Corporation	LS005319
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI)	Thermofisher	V13241
Dispase II	Sigma	D4693-1G
DNase	Sigma	DN25-1G
Enrofloxacin (Baytril)	Bayer Health Care LLC,	NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP	2.27% Injectable Solution
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	352070
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	122505
Hyaluronidase from sheep testes, Type II	Sigma	H2126
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec, Inc.	130-110-917
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-5630	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Meloxicam	Patterson Veterinary	07-891-7959
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003119
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	115509	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified	BioLegend	100309	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified	BioLegend	100409	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	100709	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	108715	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified	BioLegend	116209	Dump Channel
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2	BD Biosciences	553141
RBC Lysis Buffer (10X)	BioLegend	420301
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x	Biolegend	420201
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml	VWR	89004-290
TC20 Automated Cell Counter	Biorad	1450102
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)	Patterson Veterinary	07-893-7216	skin protectant
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red	Thermofisher	A1217701
Vetropolycin eye ointment	Dechra Veterinary Products	NADA # 065-016. Approved by FDA.	protect eyes during anesthesia