척수 손상 다음 마우스에 있는 오줌 방광의 분자 분석을 위한 단 하나 세포 해리 접근

요약

이 프로토콜의 목표는 척수 손상의 마우스 모델에 최적화된 조직 해리 프로토콜을 적용하고 유동 세포측정에 의한 단일 세포 분석 접근법을 검증하는 것입니다.

초록

우리는 분리기 괄약근 dyssynergia, 기능성 방광 출구 방해 및 후속 방광 벽 리모델링을 유도하기 위하여 마우스에 있는 척수 손상의 구현을 기술합니다. 비부상 조절및 척수 손상마우스에서 방광벽의 세포구성평가를 용이하게 하기 위해 높은 세포 생존가능성을 지원하고 유동 세포측정에 의한 이산 하위집단의 검출을 가능하게 하는 최적화된 해리 프로토콜을 개발했습니다.

척수 손상은 흉부 척수의 완전한 transection에 의해 생성됩니다. 조직 수확 시, 동물은 깊은 마취 하에 인산염 완충식식염으로 침투하고 방광은 티로드의 완충제로 수확됩니다. 조직은 공개적으로 이용 가능한 유전자 발현 데이터베이스의 심문에 의해 결정된 마우스 방광의 콜라겐 함량에 기초하여 최적화된 소화 완충제에서 인큐베이션 하기 전에 다진다. 단일 세포 현탁액의 생성에 이어, 물질은 세포 생존가능성, 세포 수 및 특정 하위 집단의 평가를 위한 유동 세포측정에 의해 분석된다. 우리는 이 방법이 90% 이상의 생존력을 가진 세포 집단을 산출하고, 중간엽 및 상피 기원의 세포의 견고한 표현을 산출한다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 마우스 방광 및 잠재적으로 다른 장기에 있는 개별적인 세포 모형의 정확한 다운스트림 분석을 가능하게 할 것입니다.

서문

정상적인 오줌 방광 기능의 동요는 많은 개별을 위한 삶의 감소질로 이끌어 낼 수 있습니다. 부상이나 질병이 정상적인 방광 기능을 탈선하는 방법을 더 잘 이해하기 위해서는 방광 내의 세포의 정상적인 생물학적 상태와 실험적 동요 하에서 어떻게 변화하는지 조사하는 것이 중요합니다. 그러나 현재까지 오줌 방광 내에 거주하는 특정 세포 인구와 부상으로 어떻게 변하는지 는 불완전하게 특징지어지고 있습니다.

유동 세포형 또는 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)과 같은 단일 세포 프로파일링 방법은 방광 내의 특정 세포 유형에 빛을 비출 가능성이 있다. 그러나, 유익한 조직이 되는 이러한 접근법은 수확된 조직의 생존력, 유전자 발현 및 대표적인 세포 집단 비율에 영향을 미치지 않는 방식으로 소화되어야 한다. 효소 적 분리를 사용하는 프로토콜은 무차별 적인 프로테아제 활성^1을통해 표면 마커 발현에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 세포 측정에 의한 세포 식별에 영향을 미치는 반면, 해리 과정 자체는 반 덴 브링크 및 동료^2에의해 최근에 설명된 바와 같이 즉각적인 초기 유전자의 유도로 이어질 수 있다. 저자는 해리에 영향을 받은 하위 인구가 작더라도, 즉각적인 초기 유전자의 높은 발현 수준 때문에 대량 발현 연구 결과에 있는 강한 오염 신호를 시작할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 또한, 해리 프로토콜의 지속 기간은 일부 하위 집단에 고유한 것으로 나타난 유전자의 대량 발현 수준을 검출하는 데 영향을 미쳤다. 따라서, 해리 프로토콜의 영향을 고려하지 않고 생성된 단일 세포 데이터 세트는 근본적인 생물학과는 반대로 해리 방법으로부터 발생하는 유전자 발현 변화를 산출할 수 있다. 이러한 관측에 따르면 발표된 단일 세포 전사 데이터는 주의해서 해석되어야 하며, 그 결과는 독립적인 방법으로 검증되어야 합니다.

비록, 가혹하고 긴 해리 방법은 세포^2에서유전자 발현을 바꿀 수 있습니다; 세포의 효과적인 격리는 존재하는 세포 모형의 정확한 표현을 얻기 위하여 필수적입니다. 방광은 다중 세포 모형을 포함하는 복잡한 기관이기 때문에, 비뇨기과 또는 기질 세포와 같은 몇몇 인구는 세포외 매트릭스 안에 존재하는 섬유아세포와 같은 그밖 세포 모형이 상대적으로 과소 표현될 수 있고 격리하기 어려울 수 있습니다. 방광이 척수 손상^3,4 또는 방광 출구 방해^5,6에서관찰되는 것과 같은 상당한 리모델링 및 섬유증을 겪은 경우 해리는 더욱 어려워진다.

여기서는 척수 손상 마우스 방광에서 하류 단일 세포 분석을 위한 최적화된 조직 해리 방법을 설명합니다. 유동 세포측정을 사용하여, 우리는 단 하나 세포 현탁액을 산출하고, 세포 생존가능성을 지원하며, 세포 집단의 정확한 비율을 유지하는 그들의 능력을 위한 4개의 효소 소화 프로토콜을 비교했습니다. 이 분석에 기초하여, 우리는 세포 사멸, 세포 응집체, 비 세포 핵산 및 다운스트림 분석의 잠재적억제제를 최소화하는 것이 고품질 데이터를 달성하는 데 중요하다는 결론을 내립니다.

프로토콜

절차는 건강의 국가 학회의 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 지침에 있는 권고에 따라 엄격하게 행해졌습니다. 모든 실험은 보스턴 아동 병원의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다.

참고: 생쥐는 음식과 물에 대한 광고 리비도 가있는 AAALAC 공인 동물 시설에 보관되었습니다. 8\u201212 주에 암컷 마우스는 이러한 실험을 위해 사용되었다. 부상의 특성을 감안할 때, 그들의 웰빙을 보장하기 위해 마우스에 추가 영양 농축이 제공되었다.

1. 쥐의 낮은 흉부 척수 편부

1. 척수 트랜섹션 전 준비
   참고 : 이 절차에 필요한 수술 기구는 마이크로 해부 스프링 가위, 마이크로 해부 집게, 마이크로 봉합 바늘 드라이버, hemostats, 및 7-0 폴리 글락틴 910 봉합사입니다. 수술용 커튼, 수술용 멸균 시트, 거즈 스폰지, 면팁 어플리케이터, 25G 바늘이 있는 1mL 주사기등이 필요합니다.
   1. 수술 전에 수술 기구와 소모품을 자동 클래브하십시오.
   2. 수술 부위와 가열 패드를 알코올 물티슈로 청소하십시오. 하나의 가열 패드는 수술 중에 사용되며 다른 하나는 수술 후 즉시 수술 후 기간 동안 전체 활동을 회복 할 때까지 동물의 체온을 유지합니다.
   3. 돋보기 루페 (2.5 배 이상)를 사용하여 수술 절차를 수행하십시오.
   4. 가열 패드, 광원 및 유리 비드 멸균기를 켜서 시술 중에 사용할 수 있습니다.
   5. 외과 커튼과 악기를 엽니다. 멸균 장갑을 사용하여 수술장을 드레이프하고 수술장에 장비를 배치하십시오.
2. 동물의 준비
   1. 마우스를 시술실로 가져와 척수 부상을 입은 마우스를 위한 깨끗한 케이지를 가져오십시오.
   2. 3.0% 설정된 이소플루란 유동체로 마우스를 유도 챔버에 배치하여 마취를 투여하고, 1L/min에서 산소 흐름, 발 핀치 응답이 없을 때까지 20 mmHg에서 흡입한다.
   3. 즉시 동물의 무게를 측정한 다음 동물을 가열 패드에 놓습니다.
   4. 마취 콘을 마우스코 위에 아늑하게 놓고 유도 챔버에서 코 콘으로 가스 흐름을 전환하고 이소플루란 흐름을 2 %로 설정하고 산소 흐름을 1 L /min으로 설정합니다.
   5. 발 핀치에 대한 반응이 없는 상태에서 동물이 적절하게 마취되어 있는지 확인합니다. 동물의 팔다리를 가열 패드에 테이프로 테이프로 바갑니다. 아래 가슴 아래에 압연 거즈 스폰지 조각을 놓고 아래 흉부 척추를 열고 플렉스를 엽니다.
   6. 안과 윤활유를 양쪽 눈에 바르게 발라주세요. 진통제 관리 (멜록시캠, 10 mg/kg, 피하) 및 항생제 (Enrofloxacin, 5 mg/ kg, 피하).
      참고: 최종 사용자는 현지 동물 관리 및 사용 위원회에서 권장하는 진통제와 항생제를 사용해야 합니다.
   7. 일반적으로 T13 가시 공정^7에해당하는 흉부 척추에서 가장 눈에 띄는 가시 공정을 palpate. 마우스 뒤쪽의 세로 사각형 영역을 하부 목에서 가장 눈에 띄는 가시 공정(T13) 바로 아래, 중간선 양쪽에 1cm 씩 면도합니다.
3. 수술
   1. 면도 부위에 10% 포비도네 요오드 용액과 70% 에탄올을 3번 또는 개절 부위에서 시작하여 외부로 작업한 다음 수술장을 덮고 중앙에 창문이 있는 멸균 4 x 4 거즈 스폰지로 동물을 덮는 원형 으로 세 번 준비하십시오.
   2. 가장 눈에 띄는 가위 과정 (T13)에서 끝나는 미세 가위를 사용하여 뒷면의 중간에 1.5cm 절개를합니다. 절개는 피부와 피상적 인 근심을 포함해야합니다. 가위를 사용하면 양쪽에 피부와 피상적 인 근막이 분리되어 가시 적 과정과 주변 의 패러가 나는 근육을 노출시합니다.
   3. 날카롭고 무딘 해부를 사용하면 근육을 회전 공정과 T9, T10 및 T11 척추의 라미네와 분리합니다.
   4. T9과 T10 사이의 간형 인대와 미세 한 가위를 사용하여 T10과 T11 사이에 간연 인대를 급격히 나눈 다음 T10의 가시 공정을 절제하고 조심스럽게 T10 라미케 절제술을 수행하여 척수를 노출시합니다. 라미네가 완전히 절제되었는지 확인합니다.
   5. 미세 가위를 사용하여 척수를 횡단합니다. 최소한의 출혈은 일반적으로 척수 혈관의 횡부로 인해이 시점에서 발생합니다. 멸균 면 팁 어플리케이터로 출혈 부위를 압축하여 hemostasis를 달성합니다. 완전한 hemostasis를 확인한 후 7-0 폴리글락틴 910 연속 봉합사로 피부를 닫습니다.
   6. 수술 후 탈수를 방지하기 위해 식염수 용액 1mL을 피하로 투여하십시오.
4. 수술 후 치료
   1. 완전한 회복이 발생할 때까지 동물을 가열 패드에 놓고 척수 부상 마우스만 케이지로 옮길 수 있습니다.
   2. 수술 후 관리는 매일 동물을 관찰하고 무게, 최대 7 일 동안 감염의 징후에 대한 절개 부위의 모니터링을 포함한다. 1 mL 식염수 용액, 진통제 (멜록시캠 10 mg /kg), 항생제 (enrofloxacin 5 mg / kg) 모든 피하 매일 3 일 동안 관리 하십시오.
      참고: 최종 사용자는 현지 동물 관리 및 사용 위원회에서 권장하는 진통제와 항생제를 사용해야 합니다.
   3. 동물이 스스로 소변을 볼 수있을 때까지 12 시간마다 수동 방광 발현 (Credé 기동)을 수행하십시오 (일반적으로 10 일에서 14 일). 한 손으로 동물을 잡고 다른 손으로 하복부를 마사지한 다음, 검지 손가락과 엄지 손가락으로 비하된 오줌 방광을 느끼고 부드럽게 압축하십시오. 부드러운 일시적인 압축은 휴식과 번갈아가 되어야 합니다. 수동 식에 따라, 수돗물로 하복부를 씻고 과도한 마찰없이 종이 타월로 부드럽게 건조하십시오.
      참고: 소변을 가진 하복부의 발현및 습윤의 시작 전에 방광의 작은 크기는 동물이 그 자체로 무효를 가진 기능을 얻었다는 표시입니다.
   4. 체중 감소를 최소화하기 위해, 영양 젤과 다른 영양 간식 (베이컨 소파, 과일 크런치 및 채소 물린)의 형태로 마우스에 영양 농축을 제공하여 쉽게 접근 할 수 있습니다 NOTE : 이 연구에서, 마우스가 PERfused및 방광은 SCI 다음 8 주에 조달되었다.
5. 수술 후 합병증
   1. 방광을 완전히 표현하지 않음으로써 과열된 수동 방광 발현으로 인한 방광 파열 가능성을 최소화하십시오.
   2. 수돗물로 회음 부위의 세척을 통해 무능한 괄약근에서 소변 드리블에 지속적으로 노출되는 회음 피부의 흥분을 방지합니다. 삼중 항생제 연고의 적용을 통해 염증을 최소화.
      참고: 일시적인 혈전 이나 남성 마우스의 역행 사정으로 인한 정액 응고의 기간 동안 혈액 응고로 인한 요도 방해는 척수 손상 후 발생할 수 있습니다. 남성 마우스에 있는 완전한 요도 방해는 방광 파열 및 죽음에서 수시로 절정합니다. 우리의 경험에서 죽음으로 이끌어 온 남성 마우스에 있는 요도 방해의 주파수는 10%이었습니다.

2. 관류 및 조직 조달

참고: 말초 조직에 있는 면역 세포와 같은 특정 세포 모형의 다운스트림 분석은 아래 설명된 것과 같이 조직 수확의 시간에 관류에 의하여 혈액을 제거하는 것이 유익합니다.

1. 외과 적 수술 (단계 2.2)에서 언급 한 바와 같이 마취를 관리하고 동물이 앞두피 핀치 반응없이 적절하게 마취되는지 확인합니다 (동물은 하반신 마비이므로 뒷다리가 감각을 감소시키고 힌발 핀치 반응이 무관해집니다).
2. 동물을 척추 위치에 놓고 복부와 가슴을 70% 에탄올로 면봉하여 모피를 적시어 수술장으로 들어가는 것을 방지합니다.
3. 골반에서 다이어프램까지 중간라인 복강경 절제술을 수행합니다. 갈비뼈에서 다이어프램을 잘라냅니다.
   참고 : 이 단계에 따라 흉부 압력 차가 더 이상 존재하지 않고 폐가 팽창 할 수 없기 때문에 속도가 중요합니다.
4. 흉골과 평행한 선에 뼈 연골 테두리다음 왼쪽과 오른쪽에있는 갈비뼈를 따라 열리는 흉부를 잘라, 다이어프램에서 시작하고 지금까지 첫 번째 갈비뼈까지 진행.
5. 동물의 머리 위에 완전한 전방 흉부 벽을 놓고 수건 클램프를 사용하여이 위치에 고정하십시오. 이 두 내부 흉부 동맥에서 심한 출혈을 일으킬 수 있기 때문에 전방 흉부 벽을 차단하지 마십시오.
6. 미세 한 가위를 사용하여 심낭을 잘라.
7. 관류 장치에 23 G 바늘을 연결한 다음 왼쪽 심실로 천천히 삽입하여 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오.
   참고: 관류 장치는 정맥 튜브에 연결된 관류 펌프 및 50mL 주사기를 포함한다.
8. 관류를 시작하고 신속하게 배수오른쪽 아트리움에 미세 가위 의 끝으로 작은 절단을합니다. 유체 주입 중에 기포를 도입하지 않도록주의하십시오.
9. 15mL/min에서 실행되는 인산염 완충식염(PBS) 용액으로 관류를 수행합니다. 배수가 명확하고 간색이 밝을 때 관류가 완료됩니다(도1).
   참고: 관류의 평균 시간은 3.5-4분이었습니다. 부적당한 관류는 조직의 희게의 느린 진행으로 명시되고 일반적으로 좌심실에 있는 바늘의 잘못된 위치 때문입니다. 바늘을 조정하고 1 에서 2 분 동안 관류의 기간을 연장하면 조직의 적절한 관류를 보장합니다.
10. 관류를 중단하고 혈관 페디클과 요도에서 방광을 해부하고 얼음 차가운 Tyrode의 용액을 포함하는 미세 센트 심분리기 튜브에 놓습니다.

3. 관제및 척수 손상마우스에 있는 오줌 방광의 소화

참고: 마우스 오줌 방광에 맞는 효율적인 소화 혼합물을 제조하기 위해 콜라겐과 히알루론산과 같은 주요 세포 외 매트릭스 성분을 분해하는 데 사용되는 효소의 단위를 조정하고자 했습니다. 따라서, 당사는 공개적으로 이용 가능한 RNA 시퀀싱 데이터(BioProject: PRJNA66167)를 사용하여 100만 달러당 1킬로베이스당 판독을 추출하고 방광 내의 공간 발현 평가를 위해 타불라 무리스^8을 사용하였다. 콜라겐 1, 3 및 6은 42개의 상이한 콜라겐(도2A)중3개의 가장 높게 발현된 유전자였다. 그 콜라겐과 히알루로난 신체 1 (Has1)의 발현은 주로 방광 벽의 근육 세포 및 섬유 아세포에서 관찰되었다(도 2B).

1. 버퍼 및 솔루션 준비
   1. 깨끗한 500mL 병에 표 1당 티로드 나트륨 용액을 준비합니다. ddH₂O의 300mL를 추가합니다. 용액은 준비 후 산성입니다. NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. 이중 증류H_2O를사용하여 500mL로 부피를 가져온 다음 알리쿼트및 저장 -20°C에 저장합니다.
      참고: 이 버퍼는 소화 버퍼에서 pH 및 삼투압 균형을 유지하고 세포에 물과 필수 무기 이온을 제공합니다. 그것은 마그네슘을 포함, 에너지 원으로 포도 당 뿐만 아니라. 용액의 칼륨은 절연 된 세포 용액에서 전기 기계적 활동에 대한 보호 효과를 제공합니다. 가루 소금은 히스테리이며 습기로부터 보호되어야합니다. 믹스의 전체 내용은 준비 직후에 사용해야합니다. 침전물이 형성될 수 있으므로 농축염 용액을 준비하는 것은 권장되지 않습니다. 여과(0.22 μm 필터)를 이용한 멸균은 세포가 분석 후 배양될 경우 수행될 수 있다.
   2. 각성분(표 2)에권장되는 볼륨과 양을 추가하여 15mL 원문 튜브에서 효소 소화 용액을 준비합니다. 최대 2.5mL의 티로데 나트륨 용액을 추가합니다. 용해를 철저히 소용돌이.
      참고: 파파인은 카리카 파파야 라텍스의 설피드릴 프로테아제입니다. Papain은 광범위한 특이성을 가지며 대부분의 단백질 기판^9를저하시합니다. Papain는 세포 해리 프로토콜^10에서다른 프로테아제보다 덜 손상되고 더 효과적인 것으로 입증되었습니다. 표 2에서4개의 해리 프로토콜에 대한 세부 정보를 제공합니다. 가장 높은 생존력을 지원하기 위해 프로토콜 섹션 3(93%)을 관찰했습니다. 마우스 방광에서 제조 된 세포 현탁액.
2. 세포 현탁액의 해리 절차 및 준비
   1. 관류 후 마우스에서 방광을 수집합니다.
   2. 방광에 구멍을 뚫어 내용물들을 방출합니다.
   3. 티로드의 용액 100μL을 빈 1.5mL 원심분리기 튜브와 타레에 추가합니다. 방광을 튜브에 놓고 정확한 방광 무게를 결정하기 위해 다시 무게를 측정합니다.
   4. 방광을 10cm 페트리 접시에 얼음 위에 놓고 티로드의 다진 용액 100μL을 추가합니다.
   5. 수술 가위를 사용하여 방광 당 2 \u20123 분 이하로 밍징 시간을 최소화하면서 가능한 한 작은 조각을 잘라냅니다. 여러 동물에서 방광 조직을 풀링하는 경우 방광을 한 번에 다진다.
   6. 각 방광에 대한 소화 완충제의 2.5 mL로 넓은 보어 파이프 팁을 사용하여 다진 방광 조직을 전송합니다. 여러 방광이 풀리고 있는 경우 볼륨을 조정합니다. 40 분 동안 누이터 믹서에 인큐베이터에서 37 °C에서 소화 용액의 조직을 배양합니다.
   7. 인큐베이션 기간이 끝나면 인큐베이터에서 소화 튜브를 제거합니다. 1 분 동안 5 mL 파이펫을 사용하여 삼중 (위 아래 파이펫) 소화 용액.
   8. 4°C에서 350 x g에서 10분 동안 원심분리기. 상체를 제거하고 1 mL의 세포 분리 용액에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 37°C 인큐베이터에 10분 동안 누이터 믹서에 놓습니다.
   9. 4°C에서 350 x g에서 10분 동안 원심분리기. 상체를 제거하고 RBC 리시스 버퍼(1x)의 1mL에서 펠릿을 다시 분리한다. 1 분 동안 인큐베이션.
   10. RBC 버퍼를 희석하고 RBC 리시스를 중지하려면 9mL PBS를 추가합니다.
   11. 70 μm 세포 여과기를 통과하여 주사기의 플런저를 사용하여 셀 스트레이너를 가볍게 긁어 전체 세포 통로를 보장합니다. 스트레이너를 통과하지만 여과기 의 밑면에 잡힐 수 있습니다 액체를 수집해야합니다.
   12. 4°C에서 350 x g에서 10분 동안 원심분리기. 상체를 제거하고 200 μL의 셀 염색 버퍼(2% FBS를 가진 PBS)에서 펠릿을 다시 분리합니다.
   13. 셀을 계산합니다.
3. 유동 세포종에 대한 특정 세포의 면역 라벨링
   참고: 방광에서 다양한 유형의 세포를 감지하기 위해 다색 유동 세포측정패널을 설계했습니다. 보상을 수행하고 적절한 게이팅 전략을 고안하기 위해, 우리는 스테인드 및 형광을 뺀 하나의 (FMO) 제어를 포함한다. FMO 컨트롤은 특히 긍정적인 분수가 희미할 때 양성 모집단을 게이트하는 데 중요합니다. 염색 절차는 다음과 같습니다.
   1. 세포에 FcγRII/III 수용체 차단
      참고: 단일 클론 항Fc 수용체 항체 또는 재조합 Fc 단백질을 가진 세포의 사전 배양에 의해 단일 클론 항체의 비특이적 결합을 차단하는 것이 좋습니다.
      1. 4°C에서 5분 동안 350 x g에서 원심분리로 세포를 세척하고 셀 염색 버퍼를 추가합니다.
      2. 1:100의 희석시 세포 염색 완충제에 CD16 및 CD32 항체를 첨가하여 비특이적 항체 염색을 방지하기 위해 세포상응광및 FCγRII/III 수용체를 폐기하고 차단한다.
      3. 10 분 동안 얼음에 배양.
         참고 : 세포를 씻을 필요가 없습니다. 세포는 이 단계 후에 직접 염색될 수 있습니다.
   2. FMOs염색
      참고: 형광 마이너스 원(FMO) 컨트롤은 실험을 제외한 모든 형광을 포함하는 실험에 사용되는 모든 형광의 튜브입니다.
      1. 예를 들어, 4가지 형광(A, B C 및 D + 부속서 V 및 프로스티움 요오드(PI)이 있는 경우 FMO 튜브를 다음과 같이 준비한다. FMO 튜브 1: B, C, D 불소크롬 + (부속서 V 및 PI)와 결합된 항체; FMO 튜브 2: A, C, D 불소크롬 + (부속서 V 및 PI)와 결합된 항체; FMO 튜브 3: A, B, C 불소크롬 + (부속서 V 및 PI)와 결합된 항체; FMO 튜브 4: A, B, C, D 불소크롬 + (부속서 V)와 결합된 항체; FMO 튜브 5: A, B, C, D 불소크롬 + (PI)와 결합된 항체.
      2. 부속서 V 항체에 대한 공자 형광의 특성을 고려하십시오.
   3. 원하는 항체로 막힌 세포를 염색
      1. 인큐베이트는 빛으로부터 보호되는 얼음에 20 분 동안 원하는 단백질에 대해 형광소 접합 항체의 적절한 마스터 혼합으로 세포를 차단했습니다. FmOs를 포함해야 합니다.
      2. 각 튜브에 1mL의 세포 염색 버퍼를 추가한 다음 10°C에서 5분 동안 350 x g에서 다시 원심분리기를 세척합니다.
      3. 상체를 버리고 세포 염색 버퍼의 200 μL에서 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 유동 세포계를 사용하여 형광 데이터를 획득할 수 있을 때까지 얼음을 유지하십시오.
   4. 부속서 V/ PI 얼룩을 적용합니다.
      1. 죽은 세포 세포 세포 사멸 키트에 대한 제조업체의 프로토콜에 설명된 바와 같이 1x 부속제 결합 버퍼에서 PI(100 μg/mL)의 작업 용액을 준비한다.
      2. 셀 밀도를 결정하고 저장되는 버퍼 및 볼륨을 기록합니다.
      3. 원심분리기 샘플은 350 x g에서 5분 동안, 1x 부속품 버퍼에서 셀을 100 μL의 부피로 ~1 x 10⁶ 셀/mL의 밀도로 폐기한다.
      4. 제조업체의 프로토콜에 설명된 대로 FITC-Annexin V(5 μL) 및 PI 작업 용액(1 μL)을 각 샘플(100 μL)에 추가하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
      5. 1x 부속서 결합 버퍼 400μL을 샘플에 넣고 반전으로 섞고 혈류 세포측정이 될 때까지 얼음을 유지합니다.
4. FACS 교정
   1. 유동 세포측정 및 순도 제어
      1. 세포 형태와 불소 크롬의 골짜기를 묘사하기 위해 스테인드 세포를 측정하여 흐름 세포 분석을 시작합니다.
      2. 각 형광 파라미터의 전압을 수정하여 측면 분산(SSC) 및 전방 분산(FSC)을 조정합니다. 530nm(부속서 V) 및 >575 nm(PI)에서 형광 방출을 측정합니다.
      3. 각 점 플롯의 그리드를 사용하여 처음 10년 동안 음수 집단을 정의합니다. 각 FMO 컨트롤을 사이토미터에 배치하고 음수 및 양성 집단 중앙값이 정렬될 때까지 스펙트럼 중첩을 수정합니다.
      4. 100,000개의 이벤트를 측정합니다. 특정 마커로 염색된 세포를 측정하고 관심 있는 세포 집단을 위한 게이트를 만듭니다.
5. 데이터 분석
   1. 흐름 사이토미터에서 데이터를 수집합니다. 소프트웨어를 열어 분석을 위한 작업 영역을 시각화합니다.
   2. 작업 공간 만들기
      1. FCS 파일을 작업 공간으로 드래그하여 가져옵니다. 파일은 작업 영역의 샘플 및 그룹 섹션에 표시됩니다. 샘플 이름을 두 번 클릭하여 파일을 엽니다.
      2. x축(그림3A)에대한 y축 및 전방 분산 영역(FSC-A)에 측면 분산 영역(SSC-A)을 사용합니다. 다각형 게이팅아이콘을 클릭합니다.
      3. 게이트 노드를 클릭한 다음 셀 모집단을 계속 클릭하여 점 플롯에 관심 있는 셀 채우기 주위에 게이트를 만든 다음 완료될 때까지 셀 채우기를 계속 클릭합니다. 두 번 클릭하여 게이트를 닫습니다.
      4. 캡처된 인구(예: "모든 셀")에 따라 게이트이름을 지정하고 확인을 클릭합니다.
         참고: "모든 셀" 게이트 내에서 두 번 클릭하면 "모든 셀"에 포함된 이벤트만 보여주는 새 그래프 창이 열립니다.
      5. 새 도트 플롯의 y축을 검정 화살표를 클릭하여 SSC-H(측면 분산 높이)로 조정하고 y축을 변경하도록 선택합니다.
         참고: 단일 셀(singlets)에 대한 이 게이트는 이중 또는 더 큰집계(그림 3B)를제외합니다. 단일 세포는 비례 폭과 길이를 가지고 있기 때문에 대각선에 있는 집단으로 표현되어야 합니다. 이 대각선 게이트 바깥에 떨어지는 세포는 이중 또는 더 큰 골재입니다.
      6. 회향(PI 양성), 조기 세포멸(부속서 V 양성, PI-음성) 및 후기 세포(부속서 V 양성, PI-음성)세포(그림 3C)를분석하기 위해 게이트를 두 번 클릭한다.
      7. x축을 부속서 V로, y축을 PI로 레이블을 지정합니다.
         참고: 신호 강도가 낮은 경우에, 세포 인구는 배경에 대한 보정의 결과로, 부정적인 형광 값을 가지고 있는 것처럼 보일 수 있습니다. 이 경우 이중 지수 변환을 수행하는 것이 좋습니다. 이렇게 하려면 y축 옆의 T를 클릭하고 축 사용자 지정을 선택합니다. 새 창에서 비익수면(Biex)으로 축을 변경하여 너비 기준을 늘리고 적용을 클릭합니다. 이렇게 하면 신호 강도가 낮은 이벤트의 해상도가 향상됩니다.
      8. 데이터를 카운트 플롯으로 표시합니다. x축 바로 아래에 있는 옵션 탭을 사용하고 메뉴에서 카운터 플롯을 선택합니다.
      9. 플롯에 콰트 게이트를 그려 4개의 개별 대상 모집단을 정의합니다.
      10. 레이아웃 편집기를 클릭하고 각 개별 영역으로 채우기를 드래그하여 레이아웃 편집기를 엽니다.
      11. 작업 영역에서 채우기를 끌어내어 레이아웃 편집기 창으로 삭제하여 플롯을 레이아웃 편집기에 배치합니다.
   3. 히스토그램을 사용하여 시각화
      1. 옵션 탭에서 히스토그램을 선택합니다.
      2. 문 적용하여 부속서 V 양성 셀을 선택합니다. 또는 양수 및 음수 집단은 바이섹터 도구를 사용하여 정의할 수 있습니다. 이제 샘플 섹션에 형식이 있는 다른 인구와 계층 구조가 표시되어야 합니다.
      3. 샘플을 비교하려면, 서로의 상단에있는 모든 히스토그램을 드래그; 히스토그램을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 히스토그램에서 스태거 오프셋을선택합니다.
   4. 통계 분석 추가
      1. 관심 있는 인구를 두 번 클릭하여 통계 탭을 엽니다. 적용할 함수와 관련된 매개 변수를 선택합니다.
      2. 시그마 아이콘을 인구 이름으로 드래그하여 다른 채우기와 반복합니다.
      3. 관심 있는 샘플에서 게이팅 전략을 선택하고 관심 마커(예: Annexin V)에 의해 정의된 그룹으로 드래그하여 모든 샘플에 분석을 적용합니다.
      4. FMO 제어 샘플에서 게이트를 만들고 음수 및 양수 모집단을 정의합니다. 이 게이팅 전략은 전체 실험에 적용됩니다(그림 3D\u2012F).
         참고: 각 샘플을 개별적으로 확인하여 게이팅이 올바른지 확인하고 필요한 경우 수정합니다.
      5. 세포가 마커 항체(예를 들어, CD45)로 염색된 경우 그에 따라 해당 FMO 및 게이트를 사용한다.
      6. 레이아웃을 내보려면 파일 | 클릭합니다. 이미지 | 내보내기 파일 형식(예: jpg, pdf)을 선택합니다.
      7. 테이블 만들기를 클릭하여 테이블의 최종 버전으로 창을 엽니다.
      8. 파일 | 선택하여 테이블 내보내기 | 저장 파일 이름.

결과

수술
흉부 척수 흉부의 성공은 여러 매개 변수의 평가에 의해 결정되며, 그 중 가장 명백한 것은 뒷다리 마비입니다. 동물은 앞다리를 사용하여 뒷다리를 드래그합니다. 그렇지 않으면 수유, 그루밍 및 경보를 포함한 활동 수준은 일반적으로 정상입니다. 또한, 동물은 12시간마다 조사관이 수동 방광 발현을 필요로 하는 의지에 따라 10~14일 후에 반사 블렌딩이 반환될 때까지 의지에 따라 방광 조절을 잃게 된다. 안락사 다음, 부상의 성공의 추가 징후는 주로 방광 대 체중 비율의 증가와 관련이, 조직 리모델링의 표시. 조직학적 분석은 비뇨기과 민원 근육 구획³내의 증식을 나타낸다.

단일 셀 서스펜션 의 준비
공개적으로 이용 가능한 발현 데이터를 사용하여 세포외 매트릭스 단백질용 방광 조직의농축(도 2)을결정하고 소화 믹스의 제형을 알리는 데 사용하였다. 콜라겐은^{방광벽(11,12)의}핵심 성분이기 때문에, 먼저 마우스 ENCODE^{프로젝트(13)에}의해 생성된 RNA 프로파일링 데이터 세트를 사용하여 마우스 방광에서 가장 풍부한 콜라겐(들)을 결정하기 위해 노력했다. 우리의 분석은 콜라겐 1A1, 콜라겐 3A1, 콜라겐 1A2 및 콜라겐 6A1이 마우스 방광 내의 가장 풍부한 콜라겐 유형임을 보여주었다(그림 2A). 우리는 또한 타불라 무리스 (마우스 (무스 무큘러스)에서 단일 세포 전사 데이터의^보상)을 사용하여 콜라겐 1, 3, 6 및 히알루로난의 mRNA 발현 수준을 결정했습니다. 데이터는 조직 사이에서 공유된 세포 모형에 있는 유전자 발현의 직접 그리고 통제된 비교를 허용합니다. 이 분석은 이러한 세포외 매트릭스 성분의 발현이 비뇨기과(도2B)가아닌 중간엽 세포 유형에서 더 널리 퍼진 것으로 나타났다.

방광에서 고립 된 세포의 생존에 해리의 효과
유동 세포측정 분석은 4가지 프로토콜을 이용한 효소 소화가 각각 83%, 86%, 93% 또는 90%의 생존가능성을 산출한 것으로 나타났다. 따라서 프로토콜 섹션 3은 세포 생존가능성을 보존하는 데 가장 중요한 것으로 간주되었다. 또한 세포의 약 4%가 괴사(PI +/부속서^V-)(도 4A)인것을 관찰하였다. 이러한 관찰은 소화 프로토콜의 효율성과 세포 생존가능성에 대한 후속 이점을 강조합니다.

방광에 있는 세포의 다른 인구에 척수 손상의 효력
우리는 대조군에 비해 SCI 마우스의 방광에 있는 총 세포 수에 있는 중요한 증가를 관찰했습니다. SCI 방광에서 얻은 점 플롯의 패턴은 또한 척수 손상으로 인한 지속적인 장기 리모델링과 약간 달랐다(그림 4B: 첫 번째 컬럼). 대조군과 비교하여 SCI 동물의 방광은 CD45 양성 세포의 상당한 증가를 보였습니다.

그림 1: 간의 밝은 색상으로 대표적인 관류 완료. (A)관류의 시작 부분에 간 색을 보여줍니다. (B)관류의 끝에 밝은 간 색을 표시합니다. 마우스 (A)는 관류 2 주 전에 척수 트란담을 가지고 있었고, 그 결과 척수 손상이없는 마우스 (B)에서 마우스와 달리 골반에서 방광 비대 및 돌출이 발생했습니다. 이 경우 방광은 작고 골반에 숨겨져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 마우스 방광에서 세포외 매트릭스(ECM) 성분의 전사적 발현. (A)43가지 콜라겐 타입의 바 차트. 표현은¹⁴(데이터는 BioProject: PRJNA66167)에서 수집된 백만 개의 매핑된 읽기당 1킬로베이스당 읽기에 의해 명시된다. (B)미생물액액액액계 3'-엔드계에서 수득된 세포 유형의 유전자 발현의 바이올린 플롯은 남성과 여성의 소화 된 오줌 방광 샘플(남성과 여성)의 풀에서 계산된다. 카운트는 백만 ln (CPM +1)⁸당 1 + 카운트의 천연 logarithm을 사용하여 각 셀에 대해 로그 정규화되었다. 로개스텀을 복용하기 전에 CPM 1의 의사 수가 추가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 게이팅 전략 및 FMO 제어를 통해 형광 확산을 결정합니다. (A)세포 집단의 선택. (B)싱글을 위한 게이팅 전략. (C)괴사용 게이팅, PI 및 부속서 V 항체를 이용한 초기 및 후기 세포. (D\u2012F) 다색 유동 세포측정의 회로도 플롯(예를 들어, A, B, C, D 불소크롬 +와 결합된 항체(부속서 V 및 PI). 이는 염색되지 않은 대조군과 비교하여 FMO 대조군에 의해 나타난 형광 A 채널로 항체로 확산되는 형광을 나타낸다. 주황색 점선은 빨간색의 얼룩지지 않은 경계에 비해 FMO 게이팅 경계를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 방광에 있는 다른 세포 모형의 혈투 세포측정. (A)부속서 V/PI 더블 염색 흐름 차트. 각 프로토콜에 사용되는 효소와 화학 물질의 상이한 조합은 해당 생존성 플롯 앞에 표현된다. 이러한 데이터는 프로토콜 섹션 3에서 가장 높은 생존력을 얻었다는 것을 보여줍니다. (B)단일 채널에서 검출된 라이-6A/E(Sca-1) 및 CD326(Ep-CAM)의 강도를 보여주는 대표적인 히스토그램. (C)마우스 방광의 세포 집단에 대한 SCI의 효과. 상부 패널은 대조군 비수술용 마우스로부터 얻어진 3개의 해리된 방광에 염색의 결과를 보여주고 낮은 패널은 SCI를 가진 3개의 동물에 염색의 결과를 보여줍니다. 첫 번째 열은 총 세포 집단입니다. 두 번째 열에는 단일 게이팅 선택이 표시됩니다. 세 번째 컬럼은 B 세포, T 세포 및 NK 셀에 대해 부정적인 살아있는 세포의 하위 집단을 보여줍니다. 네 번째 열은 CD45에 대해 양성 라이브 셀에 대한 염색을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

구성 요소	양(500mL용)	어러지니
Nacl	4.091 g	140 mM
KCl	0.186 g	5 mM
MgCl2	0.0476 g	1 mM
D-포도당	0.9 g	10mM
헤페스	1.19 g	10mM

표 1: Tyrode의 솔루션을 준비하기 위한 구성 요소입니다. 표시된 구성 요소는 500mL Tyrode의 솔루션을 준비하기 위한 것입니다.

구성 요소	금액	프로토콜 섹션 1	프로토콜 섹션 2	프로토콜 섹션 3	프로토콜 섹션 4
Bsa	5 mg	예	예	예	예
CaCl2	0.03 mM	예	예	예	예
콜라게나아제 타입 I	132.5대	예	예	예	예
콜라게나아제 타입 III	96.4대	예	예	예	예
콜라게나제 타입 VI	50대	-	-	예	-
드나스	10대	예	예	예	-
파파인	115대	-	-	예	예
팬 콜라게나제	50대	-	-	예	예
히알루로니다제	10.5 대	-	-	예	예
디스파스 II	1.25 대	예	예	-	-
세포 해리 솔루션	1 mL	예	-	예	-
재조합 효소	1 mL	-	예	-	예

표 2: 소화 버퍼를 준비하기 위한 구성 요소입니다. 표시된 성분은 2.5mL 소화 믹스의 제조를 위한 것입니다(1 U는 37°C에서 분당 기질 1 μmol의 가수분해를 촉매한다. 각 효소의 단위의 정의를 위한 제품 데이터 시트를 참조하십시오).

토론

여기에 설명된 마우스 척수 손상 모델은 방광 수축과 외부 요도 괄약근 이완 사이의 협착로 인한 기능성 방광 출구 장애물을 만드는 재현 가능한 방법을 제공한다. 이것은 차례로 비뇨기과 매끄러운 근육 구획의 확장에 의해 특징지어진 상해 후에 2 주 초에 방광 벽의 심오한 리모델링을 연상시킵니다. 설치류에서 SCI 모델의 구현에 중요한 단계는 (i) 부상 후 10\u201214 일 동안 계속되는 척추 충격의 기간 동안 수동 방광 발현에 엄격한 주의를 포함한다; (ii) 체중 감량을 최소화하기 위한 영양 농축; 및 (iii) 소변 비열의 반환을 넘어 확장 실험에 대한 특히 소변 확장에 대한 잠재력의 완화. 모델의 한계는 일시적인 혈뇨 기간 동안 혈전에서 마우스에 요도 폐색에 대한 잠재력을 포함, 그리고 추가로 수술 후 역행 사정 다음 정액 응고에서 남성 마우스에서.

여기에 설명된 조직 해리 접근법은 실험적 모욕에서 발생하는 조직의 구조적 변화를 고려하는 것의 중요성을 보여 주며, 이 경우 다운스트림 분석에 영향을 미칠 수 있는 SCI에 따라 중요한 조직 리모델링이 있을 수 있다. 단일 세포 분석의 증가로 유전자 발현에서 관찰된 차이는 단순히 해리 유발 된 동요의 결과가 아니라 질병 모델과 관련된 근본적인 생물학적 변화를 진정으로 대표하는 것이 중요합니다. 공개적으로 이용 가능한 식 데이터의 사용은 우리가 생존가능성을 극대화하면서 세포외 매트릭스의 효과적인 소화를 보장하기 위해 소화 버퍼의 공식을 수정할 수 있었습니다. 향후 응용 분야에서 고려될 수 있는 추가 수정은 해리^{프로토콜(15)에}민감한 즉각적인 초기 유전자의 전사를 중단하기 위해 actinomycin D의 첨가를 포함한다.

파이프팅 기술은 조직을 해리하거나 이미 현탁액에있는 세포를 전송 할 때 중요합니다. 전단력으로 인한 세포의 물리적 손상을 줄이기 위해 세포 재서스펜션 중에 부드럽고 천천히 피펫하는 것이 중요합니다. 일반적으로 와이드 보어 파이펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 표준 팁을 사용하는 경우 세포를 손상시키는 전단 력을 피하기 위해 피펫 셀 서스펜션을 부드럽게 피하는 것이 특히 중요합니다. 이 프로토콜에서는 세포 스트레이너를 사용하는 것이 불가피하지만, 세포 농도는 100 μL 이상의 부피 손실과 함께 20% 이상 감소할 수 있다. 정확한 세포 수를 보장하기 위해 긴장 후 세포 농도를 결정하는 것이 좋습니다.

흐름 세포면에서 FMO 컨트롤은 중복방출 피크에서 신호의 출혈로 인해 배경의 측정을 제공합니다. 그(것)들은 항체가 그 채널에 포함될 때 존재할 수 있는 비특이적인 항체 결합, 또는 배경 염색의 측정이 아닙니다. 비특이적 항체 결합을 고려하기 위해, 하나는 적절한 등류형 제어를 포함해야 한다; 배경 염색의 경우 음수 컨트롤을 포함해야 합니다. 이러한 컨트롤을 종합하여 세포 집단을 정확하게 측정할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5 X Magnifying Loupes
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle	ETHICON	J546
70 μm Cell Strainer	Thermofisher	22363548
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA	Millipore	SCR005
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL)	VWR	89049-168
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL)	VWR	89049-168
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	118213
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11	BD Biosciences	564590
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-5172	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647-100G
CaCl2	Sigma	2115-250ML
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-6412	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue	Biorad	1450003
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G
Collagenase Type I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196
Collagenase Type III	Worthington Biochemical Corporation	LS004182
Collagenase, Type 6	Worthington Biochemical Corporation	LS005319
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI)	Thermofisher	V13241
Dispase II	Sigma	D4693-1G
DNase	Sigma	DN25-1G
Enrofloxacin (Baytril)	Bayer Health Care LLC,	NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP	2.27% Injectable Solution
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	352070
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	122505
Hyaluronidase from sheep testes, Type II	Sigma	H2126
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec, Inc.	130-110-917
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-5630	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Meloxicam	Patterson Veterinary	07-891-7959
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003119
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	115509	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified	BioLegend	100309	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified	BioLegend	100409	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	100709	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	108715	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified	BioLegend	116209	Dump Channel
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2	BD Biosciences	553141
RBC Lysis Buffer (10X)	BioLegend	420301
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x	Biolegend	420201
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml	VWR	89004-290
TC20 Automated Cell Counter	Biorad	1450102
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)	Patterson Veterinary	07-893-7216	skin protectant
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red	Thermofisher	A1217701
Vetropolycin eye ointment	Dechra Veterinary Products	NADA # 065-016. Approved by FDA.	protect eyes during anesthesia