脊髄損傷後のマウスにおける膀胱の分子解析のための単一細胞解離アプローチ

要約

このプロトコルの目的は、脊髄損傷のマウスモデルに最適化された組織解離プロトコルを適用し、フローサイトメトリーによる単一細胞分析のアプローチを検証することです。

要約

我々は、眼下切裂括約筋ジシナージア、機能的膀胱出口閉塞、およびそれに続く膀胱壁改修を引き出すマウスにおける脊髄損傷の実施について述べる。損傷を受けずコントロールマウスおよび脊髄損傷マウスにおける膀胱壁の細胞組成の評価を容易にするために、高い細胞生存率をサポートし、フローサイトメトリーによる離散亜集団の検出を可能にする最適化された解離プロトコルを開発した。

脊髄損傷は、胸部脊髄の完全な切除によって生じられます。組織収穫時に、動物は深い麻酔下でリン酸緩衝生理食塩基を透過させ、膀胱はタイロードの緩衝液に収穫される。組織は、一般に入手可能な遺伝子発現データベースの尋問によって決定されるマウス膀胱のコラーゲン含有量に基づいて最適化された消化バッファーのインキュベーションに先立って細かく刻まれる。単一細胞懸濁液の生成後、細胞生存率、細胞数および特定の亜集団の評価のために、物質をフローサイトメトリーによって分析する。我々は、この方法が90%以上の生存率を有する細胞集団を生み出し、間葉系および上皮起源の細胞を強く表していることを実証する。この方法は、マウス膀胱および潜在的に他の器官における離散細胞タイプの正確な下流分析を可能にする。

概要

正常な膀胱機能の摂動は、多くの個人の生活の質の低下につながることができます。傷害または疾患が正常な膀胱機能をどのように脱線させるかをよりよく理解するためには、膀胱内の細胞の正常な生物学的状態と、それらが実験的摂動の下でどのように変化するかを調べることが重要である。しかし、現在までに、尿膀胱内に存在する特定の細胞集団、およびそれらが傷害によってどのように変化するかを完全に特徴づけられてきた。

フローサイトメトリーや単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)などの単細胞プロファイリング法は、膀胱内の特定の細胞タイプに光を当てる可能性があります。しかし、これらのアプローチが有益な組織となるには、収穫された組織の生存率、遺伝子発現、および代表的な細胞集団の割合に影響を与えない方法で消化されなければならない。酵素分解を採用するプロトコルは、無差別プロテアーゼ活性¹を介して表面マーカー発現に影響を与え、それによってフローサイトメトリーによる細胞同定に影響を与える一方、解離プロセス自体は、Van den Brinkと同僚²が最近述べたように、即時初期遺伝子の誘導につながる可能性がある。著者らは、解離に影響を受けた亜集団は小さいが、即時初期遺伝子の発現レベルが高いため、バルク発現研究で強い汚染シグナルを引き起こす可能性があることを示した。さらに、解離プロトコルの影響を受けた持続時間は、いくつかの亜集団に固有であることが示された遺伝子のバルク発現レベルを検出した。したがって、解離プロトコルの影響を考慮せずに生成された単一細胞データセットは、基礎生物学とは対照的に、解離法から生じる遺伝子発現変化をもたらす可能性がある。これらの観察は、公開された単一細胞転写法データは慎重に解釈されるべきであり、結果は独立した方法によって検証されるべきであることを示唆している。

しかし、過酷で長い解離方法は、細胞²の遺伝子発現を変化させる可能性がある。細胞の効果的な分離は、存在する細胞型の正確な表現を得るために不可欠である。膀胱は複数の細胞タイプを含む複雑な器官であるため、尿路上皮細胞や間質細胞のようないくつかの集団は比較的過小表現され得るのに対し、線維芽細胞などの他の細胞タイプは細胞外マトリックス内に存在し、単離することは困難であり得る。膀胱が脊髄損傷^{3、4または}膀胱出口閉塞^5、6で観察されたような著しい改造および線維症を受けた場合、解離はさらに困難になる。

ここでは、脊髄損傷マウス膀胱における下流単細胞解析のための最適化された組織解離方法について述べている。フローサイトメトリーを用いて、4つの酵素消化プロトコルを比較し、単一細胞懸濁液を生成し、細胞生存率をサポートし、細胞集団の正しい割合を維持する能力を比較した。この分析に基づいて、我々は、細胞死、細胞凝集体、非細胞核酸および下流分析の潜在的な阻害剤を最小限に抑えることは、高品質のデータを達成するために重要であると結論付ける。

プロトコル

手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告に従って厳格に行われました。すべての実験は、ボストン小児病院の動物ケアと使用委員会によって承認されました。

注:マウスは、食べ物や水へのアドリビタムアクセスを備えたAAALAC認定動物施設に収容されました。8\u201212週齢の雌マウスをこれらの実験に用いた。傷害の性質を考えると、マウスの幸福を確保するために追加の栄養濃縮が提供された。

1. マウスの低胸部脊髄切除

1. 脊髄切除前の準備
   注:この手順に必要な手術器具は、春のはさみ、マイクロ解剖鉗子、マイクロ縫合針ドライバ、止頭、および7-0ポリグラクチン910縫合糸をマイクロ解剖する。他の外科用品は外科用カーテン、外科分野のための無菌シート、ガーゼスポンジ、綿先端の塗布器、および25 Gの針が付いている1 mLの注射器である。
   1. 手術前に手術器具と補給品をオートクレーブする。
   2. アルコール拭きで外科領域と加熱パッドをきれいにします。1つの加熱パッドは手術中に使用され、もう1つは完全な活動を取り戻すまで動物の体温を維持するために術後の即時期間に使用されます。
   3. 手術を行うために拡大ループ(2.5x以上)を使用してください。
   4. 加熱パッド、光源、およびガラスビーズ滅菌器をオンにして、手順中に使用できるようにしてください。
   5. 外科用ドレープと器具を開きます。手術場をドレープし、外科分野に器具を置くために無菌手袋を使用してください。
2. 動物の準備
   1. マウスを処置室に持ち込み、脊髄損傷マウス用の清潔なケージを持参します。
   2. イゾフルラン流量を3.0%に設定し、1 L/minで酸素流を、足ピンチ応答がなくなるまで20mmHgで吸引して、誘導室にマウスを配置して麻酔を行います。
   3. すぐに動物の重量を量り、次に加熱パッド上の傾向のある位置に動物を置きます。
   4. 麻酔コーンをマウスの鼻の上にぴったりと置き、誘導チャンバーからノーズコーンにガスの流れを切り替え、イソフルランの流れを2%に、酸素の流れを1 L/minに設定します。
   5. 動物が足ピンチに対する応答の欠如と適切に麻酔されていることを確認します。動物の手足を暖房パッドにテープで貼ります。下胸部の下にガーゼスポンジを巻いて、下胸椎骨を高めて屈曲します。
   6. 両眼に対して、眼用潤滑剤を塗布してください。鎮痛薬(メロキシカム、10mg/kg、皮下)および抗生物質(エンロフロキサシン、5mg/kg、皮下)を投与する。
      注:エンドユーザーは、地元の動物のケアと使用委員会が推奨する鎮痛薬と抗生物質を使用する必要があります。
   7. 胸椎において最も顕著な棘プロセスをpalpateすると、通常はT13棘プロセス⁷に対応する。マウスの背面にある縦方向の四角形領域を、最も顕著なスピンプロセス(T13)のすぐ下に、正中線の両側に1 cmずつ剃ります。
3. 手術
   1. 10%ポビドンヨウ素溶液と70%エタノールを3回、切開部位から外側に働く円形の方法で剃った領域を準備し、その後、外科分野の上に中央の窓で滅菌4 x 4ガーゼスポンジで動物をカバーします。
   2. 最も顕著な棘プロセス(T13)で終わる細かいはさみを使用して、背中の正中線に1.5cmの切開を行います。切開には皮膚と表面性筋膜が含まれるべきです。はさみを使用すると、両側の皮膚と表面性筋膜を分離し、棘のプロセスと周囲の麻痺性筋肉を露出させます。
   3. 鋭く鈍い解剖を使用して、T9、T10、およびT11椎骨の棘プロセスと層状から筋肉を分離する。
   4. T9とT10の間の間の間の緊張を細かいはさみを使用して鋭く分け、T10とT11の間で細かいはさみを使用して、T10の棘のプロセスを切除し、脊髄を露出させるために慎重にT10ラミネクトミーを両側で行う。ラミネートが完全に切除されていることを確認します。
   5. 細かいはさみを使用して脊髄をトランセクトします。最小の出血は通常、脊髄血管の切除のためにこの時点で起こる。止血を達成するために無菌綿先端アプリケーターで出血領域を圧縮します。完全な止軟症を確認した後、7-0ポリグラクチン910連続縫合糸で皮膚を閉じる。
   6. 術後脱水を防ぐために、1 mLの生理食前溶液を皮下に投与する。
4. 術後ケア
   1. 完全な回復が起こるまで動物を加熱パッドの上に置き、脊髄損傷マウスのケージに移します。
   2. 術後ケアには、動物を毎日観察し、計量すること、および感染の兆候を7日間まで切開部位の監視が含まれる。1 mL生理食液、鎮痛薬(メロキシカム10mg/kg)、抗生物質(エンロフロキサシン5mg/kg)を皮下に毎日3日間投与する。
      注:エンドユーザーは、地元の動物のケアと使用委員会が推奨する鎮痛薬と抗生物質を使用する必要があります。
   3. 動物が自ら(通常10〜14日で)排尿できるようになるまで、12時間ごとに手動膀胱発現(Credé操縦)を行う。片手で動物を保持し、もう一方の手で下腹部をマッサージし、その後、人差し指と親指で歪んだ尿膀胱を感じ、穏やかに圧縮します。穏やかな一過性の圧縮は緩和と交互にする必要があります。手動での表現に続いて、下腹部を水道水で洗い、過度にこすらずペーパータオルでやさしく乾かします。
      注:発現の開始前の膀胱の小さなサイズと尿で下腹部の濡れは、動物が単独で空隙する能力を得たことを示しています。
   4. 減量を最小限に抑えるために、栄養価の高いゲルおよび他の栄養価の高いお菓子(ベーコンソフト、フルーツクランチ、野菜咬傷)の形でマウスに栄養濃縮を提供し、ケージの床に置き、簡単にアクセスできます。
5. 術後合併症
   1. 膀胱を完全に発現しないことで、膀胱の破裂の可能性を最小限に抑えます。
   2. 管轄の括約筋からの尿への連続暴露から、会陰部の皮膚の排泄を水道水で包皮領域の洗浄を防ぐ。三重抗生物質軟膏の適用によって炎症を最小にする。
      注:一過性血尿の期間中の血栓による尿道閉塞または雄マウスの逆行性射精による精液凝固による尿道閉塞は、脊髄損傷後に起こり得る。雄マウスの完全な尿道閉塞は、しばしば膀胱破裂および死で最高潮に達する。我々の経験では、死に至った雄マウスの尿道閉塞の頻度は10%であった。

2. 灌流と組織調達

注:末梢組織の免疫細胞などの特定の細胞タイプの下流の分析のために、以下に説明するように、組織の収穫時に灌流によって血液を除去することが有益である。

1. 外科的処置(ステップ2.2)で述べたように麻酔を投与し、動物が前足ピンチ応答なしで十分に麻酔されていることを確認する(したがって、後肢は感覚を減少させ、ヒンパピンチ応答は無関係になる)。
2. 動物を腹腔の位置に置き、腹部と胸部を70%エタノールで綿棒で覆い、毛皮を濡らして手術部位に入るのを防ぎます。
3. 骨盤から横隔膜までの中線腹腔摘出術を行う。横隔膜を肋骨から切り取ります。
   注:このステップに続いて、胸部圧差がもはや存在しなくなり、肺が膨張しなくなるので、動物は窒息し始めるので、速度は重要です。
4. 胸骨と平行線上の骨軟骨の境界線に沿って胸部を左右の肋骨に沿って切り開き、横隔膜で始まり、最初の肋骨まで進みます。
5. 完全な胸部壁を動物の頭の上に置き、タオルクランプを使用してこの位置に固定します。これは2つの胸部動脈からの重度の出血を引き起こすので、前胸部壁を切断しないでください。
6. 細かいはさみを使って心膜を切り取ります。
7. 23G針を灌流装置に接続し、左心室に挿入し、ゆっくりと大大ターに入れ、穿刺しないように注意します。
   注:灌流装置は、静脈内チューブに接続された灌流ポンプおよび50 mLシリンジを備える。
8. 灌流を開始し、すぐに排水のための右のアトリウムで細かいはさみの先端で小さなカットを行います。液剤の注入時に気泡を導入しないように注意してください。
9. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液を15 mL/minで流して灌流を行います。灌流は、排液が透明で、肝臓の明るい色が達成されると完了する(図1)。
   注:灌流の平均時間は3.5〜4分でした。不十分な灌流は、組織のブランチングの進行が遅いと現れ、通常、左心室の針の誤った位置に起因する。針を調整し、灌流の持続時間を1〜2分間延長することで、組織の十分な灌流が保証されます。
10. 灌流を中止し、血管ペディクルと尿道から自由に膀胱を解剖し、氷冷タイローデの溶液を含むマイクロ遠心チューブに入れる。

3. コントロールおよび脊髄損傷マウスにおける膀胱の消化

注:マウスの尿膀胱に合わせた効率的な消化混合物を処方するために、コラーゲンやヒアルロン酸などの主要な細胞外マトリックス成分を分解するために使用される酵素の単位を調整しようとしました。そこで、マウスENCODEプロジェクト(BioProject:PRJNA66167)で生成された一般に入手可能なRNAシーケンシングデータを使用して、100万人当たりの読み取り値を100万(RPKM)およびタブラ・ムリス⁸に抽出して膀胱内の空間発現を評価しました。コラーゲン1、3および6は、42種類のコラーゲンのうち3つの最も高発現遺伝子であった(図2A)。これらのコラーゲンおよびヒアルロンシンターゼ1(Has1)の発現は、主に膀胱壁の筋細胞および線維芽細胞において観察された(図2B)。

1. バッファとソリューションの準備
   1. 洗浄した500mLボトルに 、表1 に従ってタイローデナトリウム溶液を調製します。ddH₂Oの300 mLを加えます。溶液は、調製後酸性である。NaOH を使用して pH を 7.4 に調整します。ダブル蒸留_H2Oを使用して500 mLにボリュームを持って、その後アリコートし、-20°Cで保存します。
      注:このバッファーは、消化バッファーのpHと浸透量のバランスを維持し、細胞に水と必須の無機イオンを提供します。それはエネルギー源として、マグネシウムだけでなく、グルコースが含まれています。溶液中のカリウムは、単離された細胞溶液中の電気機械活動に対する保護効果を提供します。粉末塩は吸湿性であり、湿気から保護する必要があります。ミックスの内容全体は、準備の直後に使用する必要があります。沈殿物が形成される可能性があるため、濃縮塩溶液を調製することは推奨されない。細胞が分析後に培養される場合は、濾過(0.22 μmフィルター)を用いた殺菌を行うことができます。
   2. 各成分に推奨される体積と量を加えて、15 mL円錐管で酵素消化溶液を調製する(表2)。2.5 mLまでチローデナトリウム溶液を加えます。溶解する渦を徹底的に。
      注意:パパインはカリカパパイヤラテックスのスルフヒドリルプロテアーゼです。パパインは広い特異性を有し、ほとんどのタンパク質基質を分解する⁹.パパインは、細胞解離プロトコル¹⁰における他のプロテアーゼよりも損傷が少なく、より効果的であることが証明されている。4 つの解離プロトコルの詳細については 、表 2に示します。最高の生存率をサポートするプロトコルセクション3を観察した(93%)マウス膀胱から調製された細胞懸濁液の。
2. 細胞懸濁液の解離手順と調製
   1. マウスの灌流後から膀胱を収集します。
   2. もしもしも、もしも、内容物を放出するために膀胱を穿刺する。
   3. Tyrodeの溶液を100 μLの空の1.5 mL遠心分離チューブと風に加えます。膀胱をチューブに入れ、再び体重を量って正確な膀胱の体重を決定します。
   4. 氷の上に10cmのペトリ皿に膀胱を置き、チローデの溶液を100 μL加えてミンチにします。
   5. 手術用ハサミを使用して、切り取り時間を膀胱あたり2\u20123分以下に最小限に抑えながら、できるだけ小さく切る。複数の動物から膀胱組織をプールする場合は、膀胱を一度にミンチします。
   6. 広ボアピペットチップを使用してひき肉の膀胱組織を各膀胱の2.5 mLの消化バッファーに移します。複数の膀胱がプールされている場合は、音量を調整します。ヌテーターミキサーのインキュベーターで37°Cの消化液中の組織を40分間インキュベートします。
   7. インキュベーション期間の終わりに、インキュベーターから消化管を取り除きます。5 mL ピペットを使用して 1 分間の消化液(ピペットを上下にピペット)にトリチュレートします。
   8. 遠心分離機は4°Cで350×gで10分間 上清を取り除き、細胞脱離液の1 mLでペレットを再懸濁します。ヌテタミキサーに37°Cインキュベーターを10分間置きます。
   9. 遠心分離機は4°Cで350×gで10分間 上清を取り除き、RBCのライシスバッファー(1x)の1 mLでペレットを再懸濁します。1分間インキュベートします。
   10. RBCバッファーを希釈し、RBC溶出を停止するために9 mL PBSを追加します。
   11. 70 μmの細胞ストレーナーを通して50 mL円錐形チューブに入れ、シリンジのプランジャーを使用して細胞ストレーナーを軽く削り取り、完全な細胞通路を確保します。ストレーナーを通過するが、ストレーナーの下側にキャッチされる可能性がある液体を収集することを確認してください。
   12. 遠心分離機は4°Cで350×gで10分間 上清を取り除き、細胞染色バッファー(2%FBSのPBS)の200 μLでペレットを再懸濁します。
   13. セルをカウントします。
3. フローサイトメトリーに対する特定細胞の免疫標識
   注:膀胱内の異なるタイプの細胞を検出するために、我々は多色フローサイトメトリーパネルを設計しました。補償を行い、適切な格言戦略を考案するために、染色されていない蛍光から1(FMO)コントロールを含めます。FMO コントロールは、特に正の分数が薄い場合に、正の母集団をゲートする上で重要です。染色手順は以下の通りである。
   1. 細胞上のFcγRII/III受容体を遮断する
      注:モノクローナル抗Fc受容体抗体、または組換えFcタンパク質を用いた細胞のプレインキュベーションにより、モノクローナル抗体の非特異的結合を遮断することをお勧めします。
      1. 4°Cで5分間350xgで遠心分離して細胞を洗浄し、細胞染色バッファーを追加します。
      2. 上清を捨て、細胞上のFcγRII/III受容体をブロックし、1:100の希釈時に細胞染色バッファーにCD16およびCD32抗体を添加して非特異的抗体染色を防止する。
      3. 氷の上で10分間インキュベートします。
         メモ:細胞を洗浄する必要はありません。細胞は、この段階の直後に染色することができます。
   2. FMOの染色
      注:蛍光マイナス1(FMO)コントロールは、1つを除くすべての蛍光色素を含む実験で使用されるすべての蛍光色素のチューブです。
      1. 例えば、4種類のフッ素クロム(A、BCおよびD+アネキジンVおよびヨウ化プロピジウム(PI))がある場合、FMOチューブを以下のように調製する。FMOチューブ1:B、C、Dフルオロクロム+(アネキシンVおよびPI)と共役する抗体。FMOチューブ2:A、C、Dフルオロクロム+(アネキシンVおよびPI)と共役する抗体。FMOチューブ3:A、B、Cフルオロクロム+(アネキシンVおよびPI)と共役する抗体。FMOチューブ4:A、B、C、Dフルオロクロム+(アネキシンV)と共役する抗体;FMOチューブ5:A、B、C、Dフルオロクロム+(PI)と共役した抗体。
      2. アネキシンV抗体に対する共役フルオロクロムの性質を考えてみましょう。
   3. ブロックされた細胞を所望の抗体で染色する
      1. 光から保護された氷上で20分間、目的のタンパク質に対するフルオロフォア共役抗体の適切なマスターミックスでブロックされた細胞をインキュベートします。FMO を含める必要があります。
      2. 各チューブに1mLの細胞染色バッファーを加えた細胞を洗浄し、10°Cで5分間350 x g で再び遠心分離機を洗浄します。
      3. 上清を捨て、細胞ペレットを200μLの細胞染色バッファーに再懸濁します。フローサイトメーターを使用して蛍光データを取得できるまで氷の上に保管してください。
   4. アネキシンV/PI染色を適用します。
      1. 死細胞アポトーシスキットの製造業者のプロトコルに記載されているように、1xアネキシン結合バッファーにPI(100 μg/mL)の作業溶液を準備します。
      2. セル密度を決定し、格納されているバッファーとボリュームをメモします。
      3. 遠心分離機サンプルを350 x g で5分間、上清を捨て、1xアネキシン結合バッファー内の細胞を100 μLの体積で1x10⁶ 細胞/mLの密度に再懸濁します。
      4. FITC-Annexin V(5 μL)およびPIワーキングソリューション(1μL)を各サンプル(100 μL)に加え、メーカーのプロトコルに記載されているように、室温で15分間インキュベートします。
      5. サンプルに400 μLの1xアネシン結合バッファーを加え、反転によって混合し、フローサイトメトリーまで氷の上に保管します。
4. FACSキャリブレーション
   1. フローサイトメトリーと純度制御
      1. 不染色細胞を測定して、細胞の形態とフルオロクロムのトラフを線引きすることにより、フローサイトメトリー解析を開始します。
      2. 各蛍光パラメータの電圧を変更して、側面散乱(SSC)とフォワードスキャッタ(FSC)を調整します。530 nm(アネキシンV)および>575 nm(PI)で蛍光放出を測定します。
      3. 各ドット プロットのグリッドを使用して、最初の 10 年間の負の母集団を定義します。各 FMO コントロールをサイトメーターに配置し、負と正の母集団中央値が揃うまでスペクトルの重なりを補正します。
      4. 100,000 のイベントを測定します。特定のマーカーで染色されたセルを測定し、対象となるセル集団のゲートを作成します。
5. データ分析
   1. フローサイトメーターからデータを収集します。ソフトウェアを開いて、解析用のワークスペースを視覚化します。
   2. ワークスペースの作成
      1. FCS ファイルをワークスペースにドラッグしてインポートします。ワークスペースのサンプルセクションとグループセクションにファイルが表示されます。サンプル名をダブルクリックしてファイルを開きます。
      2. Y 軸には側面散布 (SSC-A) を、x 軸には前方散布 (FSC-A) を使用します (図 3A)。ポリゴン の格言のアイコンをクリックします。
      3. ドット プロットの対象となるセルの母集団の周囲にゲートを作成するには、ゲート ノードをクリックして、完了するまでセルの母集団の周囲をクリックし続けます。ダブルクリックしてゲートを閉じます。
      4. 取得した人口に応じてゲートに名前を付け(「すべてのセル」など )、[OK]をクリックします。
         注:"すべてのセル"のゲート内をダブルクリックすると、「すべてのセル」に含まれるイベントのみを表示する新しいグラフウィンドウが開きます。
      5. 黒い矢印をクリックして、新しいドットプロットのY軸をSSC-H(側面の散乱高さ)に調整し、Y軸を変更するように選択します。
         注: このゲートは単一セル (シングルト) 用で、ダブレット以上の集計は除外されます (図 3B)。単一セルの幅と長さは比例しているため、対角線上の母集団として表す必要があります。この対角ゲートの外側に落ちるセルは、二重または大きな集合体です。
      6. ゲートをダブルクリックして壊死(PI陽性)、早期アポトーシス(アネキシンV陽性、PI陰性)および後期アポトーシス(アネキシンV陽性、PI陰性)細胞を分析する(図3C)。
      7. X 軸にアネキシン V、y 軸に PI というラベルを付けます。
         注: シグナル強度が低い場合、バックグラウンドの補正の結果として、細胞集団が負の蛍光値を持っているように見える場合があります。この場合、二重指数変換を実行することをお勧めします。これを行うには、Y 軸の横にある [T] をクリックし、[ 軸のカスタマイズ] を選択します。新しいウィンドウで、スケールを二乗指数 (Biex) に変更し、幅の基準を増やして軸に負の値を追加し、 [適用] をクリックします。これにより、低信号強度のイベントの分解能が向上します。
      8. データをカウント プロットとして表示します。X 軸のすぐ下にある オプション タブを使用して、メニューから カウンタ プロット を選択します。
      9. プロット上に Quat ゲートを描画して、4 つの離散ターゲット集団を定義します。
      10. ウィンドウの上部をクリックしてレイアウトエディタを開き、レイアウトエディタで[ レイアウトエディタ ]をクリックし、人口を各エリアにドラッグします。
      11. ワークスペースからレイアウト エディタ ウィンドウに母集団をドラッグ アンド ドロップして、レイアウト エディタにプロットを配置します。
   3. ヒストグラムを使用した視覚化
      1. [オプション]タブからヒストグラムを選択します。
      2. アネキシンV陽性細胞を選択するためのゲートを適用します。また、正母母集団と負母集団は 、2 等分法 ツールを使用して定義できます。サンプル セクションには、フォームと階層の異なる母集団が表示されます。
      3. サンプルを比較するには、すべてのヒストグラムを重ねてドラッグします。ヒストグラムを右クリックし、 ヒストグラム から [スタッガーオフセット]を選択します。
   4. 統計分析の追加
      1. 対象の人口をダブルクリックして、[ 統計 ] タブを開きます。適用する関数と関連するパラメータを選択します。
      2. 他の集団と同じ手順を繰り返し、 シグマ アイコンを母集団名にドラッグします。
      3. 対象サンプルから採座戦略を選択し、目的のマーカーによって定義されたグループ(例えば、Annexin V)にドラッグして、すべてのサンプルに解析を適用します。
      4. FMO 制御サンプルでゲートを作成し、負と正の母集団を定義します。このギャティングストラテジーは実験全体に適用されます (図 3D\u2012F)。
         注: 各サンプルを個別にチェックして、正しい場所にゲージが設定されていることを確認し、必要に応じて変更します。
      5. 細胞がマーカー抗体で染色されている場合(例えば、CD45)は、それに応じて対応するFMOとゲートを使用する。
      6. レイアウトをエクスポートするには、[ファイル]をクリック |イメージ|のエクスポートファイル形式 (jpg、pdfなど)を選択します。
      7. [テーブルの作成] をクリックして、最終バージョンのテーブルを含むウィンドウを開きます。
      8. [ファイル] |を選択してテーブル をエクスポートします。|として保存ファイル名。

結果

手術
胸部脊髄切除の成功は、多くのパラメータの評価によって決定され、その中で最も明白なのは後肢麻痺である。動物は前肢のみを使用して動き、後肢をドラッグします。それ以外の場合は、摂食、グルーミング、覚醒を含む活動レベルは通常正常です。さらに、動物は、損傷後10〜14日で反射空隙が戻るまで、12時間ごとに研究者による手動膀胱発現の必要性をもたらす意志膀胱制御を失う。安楽死後、傷害の成功の追加徴候は、主に膀胱と体重の増加に関連し、組織のリモデリングを示す。組織学的分析は、尿路上皮および平滑筋区画³の両方の内の過形成を明らかにする。

単細胞懸濁液の調製
一般に公開された発現データを用いて、細胞外マトリックスタンパク質に対する膀胱組織の濃縮を決定し(図2)、消化ミックスの処方を知らせるために使用した。コラーゲンは膀胱壁^11,12の主要成分であるため^、まずMouse ENCODEプロジェクト¹³によって生成されたRNAプロファイリングデータセットを用いて、マウス膀胱内で最も豊富なコラーゲンを特定することを求めた。我々の分析は、コラーゲン1A1、コラーゲン3A1、コラーゲン1A2およびコラーゲン6A1がマウス膀胱内で最も豊富なコラーゲン型であることを示した(図2A)。また、Tabula Muris(マウス(Musmusculus)からの単一細胞転写体データのコンペンディウム⁾⁸を使用して、コラーゲン1、3、6およびヒアルロナンのmRNA発現レベルを決定しました。このデータにより、組織間で共有される細胞タイプの遺伝子発現を直接および制御した比較が可能になります。この分析により、これらの細胞外マトリックス成分の発現は、ウロテリウムではなく間葉系細胞タイプにおいてより一般的であることを明らかにした(図2B)。

膀胱からの単離細胞の生存可能性に及ぼす解離の影響
フローサイトメトリー分析は、4つの異なるプロトコルを用いた酵素消化が、それぞれ83%、86%、93%または90%の生存率をもたらすことを実証した。したがって、プロトコルセクション3は、細胞生存率の保存にとって最も価値があると考えられた。また、細胞の約4%が壊死的であることを観察した(PI⁺/Annexin V^-) (図4A)。これらの観察は、消化プロトコルの効率と細胞生存率に関するその後の利益を強調する。

膀胱内の細胞の異なる集団に及ぼす脊髄損傷の影響
我々は、対照と比較してSCIマウスの膀胱における総細胞数の有意な増加を観察した。SCI膀胱から得られたドットプロットのパターンも、脊髄損傷による進行中の臓器改修と若干異なっていた(図4B:第1列)。対照と比較して、SCI動物からの膀胱はCD45陽性細胞の有意な増加を示した。

図1:肝臓の明るい色での代表的な灌流完了。(A) 灌流の開始時に肝臓の色を示す。(B)は、灌流終了時の明るい肝臓色を示す。(A)中のマウスは、膀胱肥大を生じ、脊髄損傷を有していない(B)のマウスとは異なり、骨盤から突出した膀胱肥大および突出を生じる2週間前に脊髄切除を有していた。この場合、膀胱は小さく、骨盤に隠されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:マウス膀胱における細胞外マトリックス(ECM)成分の転写発現。(A)43種類のコラーゲンタイプの棒グラフ。この式は、100 万回のマッピング済み読み取り (RPKM) あたりのトランスクリプトのキロベースあたりの読み取りによって記述されます (データは BioProject から収集されます: PRJNA66167)¹⁴.(B) 男性と女性の解離尿膀胱サンプル(男性と女性)のプールでマイクロ流体液滴ベースの3'末端カウントから得られた細胞タイプにおける遺伝子発現のバイオリンプロット。カウントは、100万ln(CPM+1)⁸あたり1+カウントの自然対数を使用して、各セルに対して対数正規化された。対数を取る前に、1 CPM の疑似カウントが追加されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:Gating戦略及びFMO制御により、蛍光の広がりを判定する。(A) 細胞集団の選択(B) シングルトのガッティング戦略。(C)壊死細胞のガッティング、PIおよびアネキシンV抗体を用いた早期および後期のアポトーシス細胞。(D\u2012F)多色流細胞測定の模式ドットプロット(例えば、A、B、C、Dフルオロクロム+(アネキシンVおよびPI)と共役する抗体)。これは、FMO制御によって示された蛍光膜Aチャネルを用いて、染色されていない対照と比較して、抗体に広がった蛍光を示す。オレンジ色の点線は、赤で染色されていない境界と比較してFMO格数境界を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:膀胱内の異なる細胞タイプのフローサイトメトリー。(A) アネキシン V/PI 二重染色フローチャート.各プロトコルに使用される酵素と化学の異なる組み合わせは、対応する生存率プロットの前に表されます。これらのデータは、プロトコルセクション3で最も高い生存率を示す。(B)単一チャネルで検出されたLy-6A/E(Sca-1)およびCD326(Ep-CAM)の強度を示す代表的なヒストグラム。(C) マウス膀胱の細胞集団に対するSCIの影響上パネルは、コントロール非外科的マウスおよび下パネルから得られた3つの解離された膀胱の染色の結果を示し、SCIを有する3つの動物に染色した結果を示す。最初の列は、セルの総母集団です。2 番目の列は、単一の格紙の選択を示しています。3番目の列は、B細胞、T細胞およびNK細胞に対して負の生細胞のサブ集団を示している。4番目の列は、CD45に陽性の生細胞の染色を示しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

コンポーネント	金額(500mL)	モルリティ
塩化 ナトリウム	4.091 g	140mM
Kcl	0.186 g	5 mM
MgCl2	0.0476 g	1 mM
D-グルコース	0.9 g	10mM
Hepes	1.19 g	10mM

表1:タイロードの溶液の準備のためのコンポーネント。 示されたコンポーネントは、500 mLタイローデの溶液の調製用です。

コンポーネント	量	プロトコルセクション 1	プロトコルセクション 2	プロトコルセクション 3	プロトコルセクション 4
Bsa	5 mg	はい	はい	はい	はい
CaCl2	0.03 mM	はい	はい	はい	はい
コラゲナーゼタイプI型	132.5単位	はい	はい	はい	はい
コラゲナーゼ III型	96.4単位	はい	はい	はい	はい
コラゲナーゼ型VI型	50単位	-	-	はい	-
DNase	10台	はい	はい	はい	-
パパイン	115台	-	-	はい	はい
パン コラゲナーゼ	50単位	-	-	はい	はい
ヒアルロニダーゼ	10.5単位	-	-	はい	はい
ディスパーゼII	1.25単位	はい	はい	-	-
細胞解離解	1 mL	はい	-	はい	-
組換え酵素	1 mL	-	はい	-	はい

表2:消化バッファーの調製のためのコンポーネント。 示された成分は、2.5 mLの消化混合(1 Uは37°Cで1分間に1μmol基質の加水分解を触媒する)の調製用である。 各酵素の単位の定義については、製品データシートを参照)。

ディスカッション

ここで説明するマウス脊髄損傷モデルは、膀胱収縮と外尿道括約筋弛緩との間の協調性の喪失による機能的な膀胱出口閉塞を作成する再現性のある方法を提供する。これは、尿路上皮および平滑筋コンパートメントの拡張を特徴とする傷害の早い時期に膀胱壁の深い改造を呼び起こす。げっ歯類のSCIモデルの実装における重要なステップには、(i)損傷後10\u201214日続く脊髄ショックの期間中の手動膀胱発現への厳格な注意が含まれる。(ii) 減量を最小限に抑える栄養豊かさ;(iii)特に反射的な空虚の復帰を超えて広がる実験のために尿のスケーリングの可能性の軽減。このモデルの制限には、一過性血尿中の血栓からのマウスの尿道閉塞の可能性、および手術後の逆行性射精後の精液凝固からの雄マウスの可能性が含まれる。

ここで説明する組織解離アプローチは、実験的侮辱から生じる組織の構造変化を考慮することの重要性を示している。単一細胞分析の増加に伴い、遺伝子発現に見られる違いは、単に解離誘発摂動の結果ではなく、疾患モデルに関連する根本的な生物学的変化を真に代表することが重要です。一般に公開されている発現データを使用することで、消化バッファーの配合を変更して、生存率を最大化しながら細胞外マトリックスの効果的な消化を確保することができました。将来のアプリケーションで考慮され得る追加の修正は、放放基菌Dの添加を含む、解離プロトコル¹⁵に敏感である即時初期遺伝子の転写を停止する。

ピペット技術は、組織を解離したり、すでに懸濁状態にある細胞を移す際に重要です。剪断力による細胞への物理的損傷を軽減するには、細胞の再懸濁時に穏やかにゆっくりとピペットすることが重要です。一般的に、広孔ピペットチップを使用することをお勧めします。標準的なヒントを使用する場合、そうでなければ細胞を損傷するせん断力を避けるために、穏やかに細胞懸濁液をピペット細胞懸濁液することが特に重要です。しかし、このプロトコルでは細胞ストレーナーを使用することは避けられませんが、細胞濃度は20%以上低下し、100μL以上の体積損失を伴います。正確な細胞数を確保するために、緊張した後に細胞濃度を決定することをお勧めします。

フローサイトメトリーでは、FMOコントロールは、重複する放出ピークからの信号のブリードスルーによるバックグラウンドの尺度を提供します。それらは、非特異的抗体結合の尺度ではなく、抗体がそのチャネルに含まれるときに存在し得るバックグラウンド染色である。非特異的抗体結合を説明するには、適切なアイソタイプコントロールを含める必要があります。背景染色の場合、負のコントロールを含める必要があります。これらのコントロールを組み合わせることで、細胞集団の正確な測定が保証されます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5 X Magnifying Loupes
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle	ETHICON	J546
70 μm Cell Strainer	Thermofisher	22363548
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA	Millipore	SCR005
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL)	VWR	89049-168
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL)	VWR	89049-168
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	118213
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11	BD Biosciences	564590
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-5172	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647-100G
CaCl2	Sigma	2115-250ML
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-6412	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue	Biorad	1450003
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G
Collagenase Type I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196
Collagenase Type III	Worthington Biochemical Corporation	LS004182
Collagenase, Type 6	Worthington Biochemical Corporation	LS005319
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI)	Thermofisher	V13241
Dispase II	Sigma	D4693-1G
DNase	Sigma	DN25-1G
Enrofloxacin (Baytril)	Bayer Health Care LLC,	NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP	2.27% Injectable Solution
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	352070
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	122505
Hyaluronidase from sheep testes, Type II	Sigma	H2126
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec, Inc.	130-110-917
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-5630	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Meloxicam	Patterson Veterinary	07-891-7959
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003119
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	115509	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified	BioLegend	100309	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified	BioLegend	100409	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	100709	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	108715	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified	BioLegend	116209	Dump Channel
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2	BD Biosciences	553141
RBC Lysis Buffer (10X)	BioLegend	420301
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x	Biolegend	420201
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml	VWR	89004-290
TC20 Automated Cell Counter	Biorad	1450102
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)	Patterson Veterinary	07-893-7216	skin protectant
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red	Thermofisher	A1217701
Vetropolycin eye ointment	Dechra Veterinary Products	NADA # 065-016. Approved by FDA.	protect eyes during anesthesia