הערכת תכנות מחדש של הלב באמצעות ניתוח הדמיה בתוכן גבוה

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לכימות תאים דמויי קרדיומיוציטים מושרים (iCMs) מתוכנתים מחדש ישירות במבחנה באמצעות ניתוח הדמיה בתוכן גבוה. שיטה זו מאפשרת לנו לכמת את היעילות של תכנות מחדש של הלב בצורה אוטומטית ולדמיין ישירות iCMs.

Abstract

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שיטה לכימות תאים דמויי קרדיומיוציטים מושרים (iCMs), אשר מתוכנתים מחדש ישירות במבחנה על ידי טכניקת תכנות מחדש. תכנות מחדש של הלב מספק אסטרטגיה ליצירת קרדיומיוציטים חדשים. על ידי הכנסת גורמי שעתוק קרדיוגניים ליבה לפיברובלסטים; ניתן להמיר פיברובלסטים ל-iCMs ללא מעבר דרך מצב תאי גזע פלוריפוטנטיים. עם זאת, שיעור ההמרה של פיברובלסטים ל-iCMs עדיין נשאר נמוך. בהתאם לכך, היו גישות רבות נוספות לשיפור יעילות התכנות מחדש של הלב. רוב המחקרים הללו העריכו את יעילות התכנות מחדש של הלב באמצעות זרימה ציטומטרית, ובמקביל ביצעו אימונוציטוכימיה כדי להמחיש iCMs. לפיכך, נדרשות לפחות שתי קבוצות נפרדות של ניסויי תכנות מחדש כדי להדגים את ההצלחה של תכנות מחדש של iCM. לעומת זאת, ניתוח הדמיה אוטומטי בתוכן גבוה יספק הן כימות והן הסמכה של תכנות מחדש של iCM עם מספר קטן יחסית של תאים. בשיטה זו, ניתן להעריך ישירות את הכמות והאיכות של iCMs באמצעות ניסוי תכנות מחדש יחיד. גישה זו תוכל להקל על מחקרי תכנות מחדש עתידיים של הלב הדורשים ניסויי תכנות מחדש בקנה מידה גדול כגון סינון גורמים גנטיים או פרמקולוגיים לשיפור יעילות התכנות מחדש. בנוסף, היישום של פרוטוקול ניתוח הדמיה בתוכן גבוה אינו מוגבל לתכנות מחדש של הלב. ניתן ליישם אותו על תכנות מחדש של שושלות תאים אחרות כמו גם על כל ניסויי צביעה חיסונית הזקוקים הן לכימות והן להדמיה של תאים מוכתמים חיסוניים.

Introduction

תכנות מחדש של הלב פותח כגישה חלופית לגישות בתיווך תאי גזע ליצירת קרדיומיוציטים חדשים. בהתחשב בכך שהוא אינו עובר דרך מצב תאי גזע, יש לו פוטנציאל גבוה לעקוף כמה מגבלות תורשתיות בגישות מתווכות תאי גזע. הוכח כי זיהום ויראלי של לפחות שלושה או ארבעה גורמי שעתוק קרדיוגניים לפיברובלסטים יכול להמיר פיברובלסטים לגורל לב על ידי ביטול תוכניות גנים פיברובלסטים ובנייה מחדש של רשתות שעתוק קרדיוגניות בפיברובלסטים 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10^, 11,12,13,14,15,16,17.

מאז המחקר הראשון המדגים תכנות מחדש של הלב במבחנה¹, פרוטוקול תכנות הלב עבר אופטימיזציה על ידי מחקרים רבים 3,5,6,7,9,11,12,13,14,15,16,18 . גישות טכניות נפוצות להערכת פנוטיפים לבביים בפיברובלסטים לאחר תכנות מחדש של הלב היו ניתוח ציטומטריית זרימה לכימות תאים המבטאים סמני קרדיומיוציטים ספציפיים ואימונוציטוכימיה להדמיית תאים אלה ברמת תא בודד. למרות ששני הניסויים (כלומר, ציטומטריית זרימה ואימונוציטוכימיה) נועדו להדגים ביטוי של סמני קרדיומיוציטים באמצעות אותם נוגדנים, יש לבצע אותם בנפרד. בנוסף, זרימה ציטומטרית זקוקה למספר גדול יחסית של תאים, ובכך מגדילה את כמות הריאגנטים הדרושים לניסוי. לחלופין, ניתן לכמת תאים חיוביים לסמן קרדיומיוציטים על ידי ספירה ידנית בעקבות אימונוציטוכימיה. עם זאת, זה מאוד עתיר עבודה ונוטה להיות פחות מדויק.

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את השיטה שיכולה לכמת ולדמיין iCMs על ידי ניסוי צביעה חיסונית יחיד באמצעות ניתוח הדמיה אוטומטי בתוכן גבוה. זה דורש מספר קטן יחסית של תאי התחלה מכיוון שפרוטוקול זה מבוצע בבאר של צלחת של 24 בארות. ניתן להשתמש בעד שלושה סמנים שונים בו זמנית. ניתן לכמת אוטומטית תאים חיוביים בודדים, כפולים ומשולשים. בנוסף לכימות של תאים מוכתמים חיסוניים, ניתוח הדמיה בתוכן גבוה מספק תמונות אובייקטיביות באיכות גבוהה פי 2-100. במידת הצורך, ניתן לעשות שימוש חוזר באותם תאים מוכתמים חיסוניים המשמשים בניתוח הדמיה בעל תכולה גבוהה למחקרי הדמיה נוספים, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא מספק לא רק כימות בלתי מוטה של iCMs עם מספר קטן בהרבה של תאים, אלא גם הדמיה של iCMs. יתר על כן, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה להערכת תכנות מחדש של שושלת שאינה לבבית (למשל, iPSC, נוירונים ותכנות מחדש של הפטוציטים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט.

1. יצירת רטרו-וירוס ותכנות מחדש של הלב במבחנה

1. תרבית תאי פלטינום E ב-DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין ו-10 מיקרוגרם/מ"ל בלסטיצידין עד שהמפגש של תאי פלטינה E מגיע ל-70%-80%.
2. ביום הראשון, זרע ~0.55 x 10⁶ תאים (באר ראשונה) ו~0.18 x 10⁶ תאים (באר שנייה) לשתי בארות נפרדות של צלחת 12 בארות עם 1 מ"ל DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין יום לפני הטרנספקציה הראשונה.
   הערה: ניתן להשתמש בגדלים שונים של צלחות תרבית בהתאם לכמות המדיה הוויראלית הדרושה לניסויים. עיין בטבלה 1 לסולמות אחרים של ניסויים.
3. ביום השני, העבירו את המבנה הרטרו-ויראלי M-G-T-H המרובע המקודד Mef2c, Gata4, Tbx5 ו-Hand2 שתואר במחקר הקודם⁹ או וקטור ריק לתאי פלטינה E של הבאר הראשונה. הוסף 3 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה ל-30 מיקרוליטר של מדיה מופחתת בסרום. חמש דקות לאחר מכן, הוסף מבנה רטרו-ויראלי של 1 מיקרוגרם או את הווקטור הריק לתערובת של מגיב טרנספקציה ומדיה מופחתת בסרום. לאחר 20 דקות דגירה בטמפרטורת החדר, מוסיפים את התערובת לתאי פלטינה E.
4. ביום השלישי, 16-20 שעות לאחר הטרנספקציה, הסירו את החומר וחידשו את מלאי ה-DMEM הטרי בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
5. ביום השלישי, 24 שעות לאחר הטרנספקציה הראשונה, בצע את הטרנספקציה השנייה לבאר השנייה שבה תאי פלטינה E צופו ביום 1 כמתואר בשלב 1.3).
6. ביום השלישי, זרעים ~ 5 x 10⁴ פיברובלסטים עובריים קפואים של עכברים (MEFs) בודדו מעכברים מדווחים של טיטין-GFP¹⁹ לבאר של צלחת של 24 בארות. בסך הכל יש צורך בשתי בארות של צלחת 24 בארות (כלומר, בקרה לא נגועה וזיהום M-G-T-H).
   הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את מספר ה-MEFs המצופים, מכיוון שקצב ההתאוששות של MEFs קפואים יכול להשתנות בהתאם לתנאי הקפאת התאים. כ-10% מפגש ביום לאחר זריעת התאים מספיק לתכנות מחדש. ניתן לשפר את יעילות התכנות מחדש באמצעות MEFs טריים לא קפואים.
7. ביום הרביעי, 16-20 שעות לאחר הטרנספקציה השנייה, הסירו את המדיה וחידשו את מלאי ה-DMEM הטרי בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
8. ביום הרביעי, 48 שעות לאחר הטרנספקציה הראשונה, אסוף את המדיה הנגיפית בבאר הראשונה של תאי פלטינה E באמצעות מזרק של 5 מ"ל וסנן אותם דרך מסנן ממברנה של 0.45 מיקרומטר פוליאתרסולפון (PES). הסר את אמצעי הגידול הפיברובלסטים על MEFs, והחלף אותם במדיה הנגיפית בתוספת פוליברן ב-6 מיקרוגרם/מ"ל (זיהום ראשון).
9. ביום החמישי, 48 שעות לאחר הטרנספקציה השנייה, בצע את הזיהום השני באמצעות המדיה הנגיפית בבאר השנייה כמתואר בשלב 1.8).
10. ביום השישי, 24 שעות לאחר ההדבקה השנייה, המדיה הנגיפית מוחלפת במצע אינדוקציה לבבי המורכב מ-DMEM/199 (4:1), 10% FBS, 5% סרום סוסים, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 1% חומצות אמינו חיוניות, 1% B-27, 1% אינסולין-סלניום-טרנספרין, 1% תערובת ויטמינים ו-1% נתרן פירובט, 1 מיקרומטר SB431542 ו-0.5 מיקרומטר A83-01. החלף את אמצעי השראת הלב כל שלושה ימים עד לקצירת התאים.

2. צביעה חיסונית

1. לאחר 14-15 ימים לאחר ההדבקה, יש לקבע את התאים על צלחת של 24 בארות עם 2% פרפורמלדהיד למשך 15 דקות.
2. לחדור את התאים הקבועים עם מאגר חדירות (0.05% Triton-X ב-PBS) על ידי שטיפת התאים שלוש פעמים עם מאגר חדירות כל 5 דקות.
3. דגרו את התאים עם מאגר חוסם אוניברסלי למשך 45 דקות.
4. דגרו את התאים עם נוגדנים α-אקטינין של עכבר (דילול של 1:400) ונוגדני GFP של עוף (דילול של 1:400) למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר.
   הערה: כ-150 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים יכולה לכסות את כל השטח של באר של צלחת 24 בארות.
5. שוטפים את התאים עם מאגר חדירה למשך 5 דקות שלוש פעמים.
6. דגרו את התאים עם נוגדנים משניים נגד עכבר Alexa-555 ואנטי עוף Alexa-488 (דילול 1:400) למשך שעה בטמפרטורת החדר
7. שוטפים את התאים עם מאגר חדירה למשך 5 דקות שלוש פעמים.
8. הוסף 2.5 מיקרוליטר של תמיסת DAPI לתוך 250 מיקרוליטר של מאגר חדירה.

3. הדמיה בתוכן גבוה

1. הפעל את מערכת ההדמיה.
2. פתח את התוכנה המשויכת.
3. היכנס למערכת.
4. בשורת המשימות, בחר הפעל לוחית.
5. לחץ על לוחית הוצאת דלת פתוחה כדי לפתוח את הדלת במכונה ולהכניס את הצלחת. ודא שהצלחת בכיוון הנכון. לחץ על סגור לוחית עומס דלת כדי לסגור את הדלת.
6. לחץ על טען הגדרות לוחית. בחר פרוטוקול תבנית ולאחר מכן לחץ על טען ממסד נתונים.
7. לחץ על הגדרת רכישה.
8. בתיבת הדו-שיח Plate Acquisition Setup , לחץ על הגדר.
9. בלשונית מטרה ומצלמה , בחר מטרה פי 10.
10. בכרטיסייה צלחת , בחר צלחת של 24 בארות.
11. בכרטיסיה אתרים לביקור באפשרויות אתר, בחר "מספר קבוע של אתרים" כדי לקבוע את מספר אתרי ההדמיה על-ידי בחירת המספר בעמודות ובשורות. בסך הכל נעשה שימוש ב-36 אתרי הדמיה על ידי בחירת 6 בעמודות ו-6 בשורות. בחר את המרווח בין כל אתר הדמיה (כלומר, 500 מיקרומטר).
12. בכרטיסייה רכישה , הגדר את מספר אורך הגל כ- 3.
13. בכרטיסייה אורכי גל בתאורה, בחר DAPI, FITC או Texas Red עבור כל אורך גל בנפרד.
14. לחץ על הכרטיסייה הפעלה ואז הגדר את "שם התיקיה" ו"שם הצלחת" עבור הצלחת.  לחץ על הבארות בתרשים הלוח להדמיה ולאחר מכן על חשב כדי להגדיר את היסט המיקוד עבור כל אורך גל. הגדר תחילה את היסט ה-foucs עבור DAPI. לחץ על חשיפה אוטומטית כדי להגדיר את זמן החשיפה באופן אוטומטי עבור כל אורך גל. לאחר מכן, לחץ על Acquire Plate כדי להתחיל לצלם את האתרים שנבחרו.

4. ניתוח הדמיה בתוכן גבוה

1. לאחר השלמת הדמיה בעלת תוכן גבוה, לחץ על תפריט הקרנה ובחר סקירת נתוני לוחית כדי לבחור לוחית לניתוח.
2. לחץ על בחר לוחית. בתיבת הדו-שיח בחר לוחית לסקירה , פתח את התיקייה ובחר את הלוחית שנשמרה במסד הנתונים ולאחר מכן לחץ על בחר.
   הערה: כדי להציג את התמונות, בחר DAPI, FITC ו - Texas Red בשדה אורכי גל . בשדה אתרים , בחר כל האתרים. לחץ על אתר מבין 36 האתרים שנבחרו כדי להציג אותו בכל חלון תמונה באורך גל, ולאחר מכן לחץ על טבלת חיפוש כדי לבחור צבע עבור אורך הגל. השתמש במקש Print Screen במקלדת והדבק את התמונה בתוכנה לעריכת תמונות (לדוגמה, Paint ו-Photoshop) כדי לשמור אותה.
3. לחץ על הפעל ניתוח ובחר הגדרת תבנית.
4. לחץ על קביעת תצורה של הגדרות ולאחר מכן על מספר אורכי גל. בחר שלושה אורכי גל (כלומר, DAPI עבור צביעת גרעינים, Teaxs Red עבור α-אקטינין ו-FITC עבור Titin-GFP).
5. בעזרת הכלי קו בסרגל הכלים, מדדו את הרוחב לאורך הציר הקצר של התא. בהתבסס על רוחבי התאים הנמדדים, הגדר את "רוחב מינימלי משוער" ו"רוחב מרבי משוער" כך שיכללו את רוב התאים באתר ההדמיה שנבחר.
6. לחץ על תצוגה מקדימה כדי לבדוק אם כמעט כל הגרעינים נבחרו. הגרעינים שנבחרו מציגים צבע לבן, בעוד שהגרעינים שלא נבחרו נשארים כחולים (מוכתמים DAPI). במידת הצורך, בצע התאמות עבור "רוחב מינימלי משוער" ו"רוחב מרבי משוער".
7. לקביעת עוצמה מעל רקע מקומי, מקם את סמן העכבר בתוך התא ומחוצה לו. ערך העוצמה מופיע בתחתית החלון. הפחיתו מעט את העוצמה של תא עמום כדי להציג באופן שווה את העוצמה בכל השטח של כל תא. הגדר ערך עוצמה זה כערך עוצמה מעל רקע מקומי . יש להגדיר ערך זה בנפרד עבור כל ערוץ.
8. לחץ על תפריט הסינון ובחר כלי עזר לנתוני לוחות. בתיבת הדו-שיח Plate Data Utilities , לחץ על הפעל ניתוח כדי לבחור את הלוחית.
9. בשדה הגדרות , בחר את ההגדרה השמורה לניתוח; בחר הוסף לרשימת הפעלה אוטומטית ולאחר מכן לחץ על אישור כדי להפעיל את הניתוח.
10. לאחר השלמת הניתוח, לחץ על תפריט סינון ובחר כלי עזר לנתוני לוחות. לאחר מכן, בתיבת הדו-שיח Plate Data Utilities , לחץ על Export Measurements כדי לייצא את תוצאות הניתוח.
11. לחץ על מדידות תאים ותמונה ולאחר מכן על אישור.
12. בדף אשף ייצוא מדידות - שלב 1 , בחר את הלוח ולחץ על הבא.
13. בדף אשף ייצוא מדידות - שלב 2 , לחץ על סיום.
14. בדף קביעת תצורה של ייצוא נתונים , בחר את סוגי הנתונים (כלומר, שם באר, מספר תא כולל, מספר תא סכום ביניים עבור ^DAPI+, מספר תא סכום ביניים עבור Texas Red⁺, מספר תא סכום ביניים עבור FITC⁺, מספר תא סכום ביניים עבור ^DAPI+Texas Red⁺, מספר תא סכום ביניים עבור DAPI⁺FITC⁺, מספר תא סכום ביניים עבור DAPI⁺FITC⁺Texas Red⁺, אחוז תאי ^DAPI+ , אחוז תאי ^DAPI+טקסס אדום⁺ , אחוז תאי ^DAPI+FITC⁺ ואחוז תאי DAPI⁺טקסס אדום⁺FITC⁺ ) ולאחר מכן לחץ על אישור.
15. בדף ייצוא כקובץ טקסט , בחר את היעד לשמירת הקובץ ולחץ על אישור.
16. פתח את הקובץ ב- Microsoft Excel. התוצאות יוצגו על ידי כל אתר (טבלה 2). ישנם 36 אתרים לכל באר. באמצעות כלי הניתוח, Pivot Table, סכם את הנתונים של 36 האתרים (כלומר, סכומי מספרי התאים והממוצעים של אחוז התאים המצוין בכל 36 האתרים) (טבלה 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

לאחר ניסויי תכנות מחדש, כימתנו iCMs באמצעות ניתוח הדמיה בתוכן גבוה כמתואר לעיל. תמונות מורכבות של 36 אתרי הדמיה ששימשו לניתוח הדמיה בתוכן גבוה הוצגו באיור 1. iCMs מוגדרים כתאים חיוביים כפולים (α-actinin⁺Titin-eGFP⁺) בניסויים אלה. ניתוח הדמיה בעל תוכן גבוה מר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מחקרי התכנות מחדש הקודמים העריכו את יעילות התכנות מחדש באמצעות ציטומטריית זרימה והדגימו את האיכות המבנית של iCMs באמצעות אימונוציטוכימיה בשני ניסויים נפרדים. ניתוח ציטומטריית זרימה דורש מספר גדול בהרבה של תאי התחלה, ובכך מגדיל את היקף הניסויים. לעומת זאת, ניתוח הדמיה בתו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
anti-chicken Alexa 488	Thermofisher	A11039
anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262
anti-mouse Alexa 555	Thermofisher	A21422
anti-α-actinin antibody	Sigma	A7811
DAPI solution	Vector labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Insulin-Transferrin-SeleniumG supplement	Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM vitamin solution	Invitrogen	11120-052
MetaXpress software	Molecular device
Micro XL automated cell imagining system	Molecular device
Minimal essential amino acid solution	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
PES filter (0.45 µm)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E cells	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Universal blocking buffer	BiogeneX	HK083-50K