Avaliação da reprogramação cardíaca usando análise de imagem de alto conteúdo

Resumo

Apresentamos um protocolo para quantificar células semelhantes a cardiomiócitos induzidas (iMCs) diretamente reprogramadas in vitro usando análise de imagem de alto conteúdo. Este método nos permite quantificar a eficiência da reprogramação cardíaca de forma automatizada e visualizar diretamente os iCMs.

Resumo

O objetivo deste protocolo é descrever um método para quantificar células induzidas semelhantes a cardiomiócitos (iMCs), que são diretamente reprogramadas in vitro por uma técnica de reprogramação. A reprogramação cardíaca fornece uma estratégia para gerar novos cardiomiócitos. Ao introduzir fatores de transcrição cardiogênicos centrais em fibroblastos; os fibroblastos podem ser convertidos em iCMs sem transição através do estado de células-tronco pluripotentes. No entanto, a taxa de conversão de fibroblastos em iMCs ainda permanece baixa. Assim, houve inúmeras abordagens adicionais para aumentar a eficiência da reprogramação cardíaca. A maioria desses estudos avaliou a eficiência da reprogramação cardíaca usando citometria de fluxo, ao mesmo tempo em que realizou imunocitoquímica para visualizar iCMs. Assim, pelo menos dois conjuntos separados de experimentos de reprogramação são necessários para demonstrar o sucesso da reprogramação do iCM. Em contraste, a análise automatizada de imagens de alto conteúdo fornecerá quantificação e qualificação da reprogramação do iCM com um número relativamente pequeno de células. Com este método, é possível avaliar diretamente a quantidade e a qualidade dos iCMs com um único experimento de reprogramação. Essa abordagem será capaz de facilitar futuros estudos de reprogramação cardíaca que requerem experimentos de reprogramação em larga escala, como triagem de fatores genéticos ou farmacológicos para aumentar a eficiência da reprogramação. Além disso, a aplicação do protocolo de análise de imagem de alto conteúdo não se limita à reprogramação cardíaca. Pode ser aplicado à reprogramação de outras linhagens celulares, bem como a quaisquer experimentos de imunocoloração que precisem de quantificação e visualização de células imunomarcadas.

Introdução

A reprogramação cardíaca tem sido desenvolvida como uma abordagem alternativa às abordagens mediadas por células-tronco para gerar novos cardiomiócitos. Dado que não faz a transição através do estado de células-tronco, tem um alto potencial para contornar algumas limitações herdadas nas abordagens mediadas por células-tronco. Foi demonstrado que a infecção viral de pelo menos três ou quatro fatores de transcrição cardiogênicos em fibroblastos pode converter fibroblastos em um destino cardíaco, eliminando programas de genes de fibroblastos e reconstruindo redes transcricionais cardiogênicas em fibroblastos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10^, 11,12,13,14,15,16,17.

Desde o primeiro estudo de referência demonstrando a reprogramação cardíaca in vitro¹, o protocolo de reprogramação cardíaca foi otimizado por inúmeros estudos 3,5,6,7,9,11,12,13,14,15,16,18 . Abordagens técnicas comuns para avaliar fenótipos cardíacos em fibroblastos após reprogramação cardíaca têm sido a análise de citometria de fluxo para quantificar células que expressam marcadores específicos de cardiomiócitos e imunocitoquímica para visualizar essas células em um único nível celular. Embora ambos os experimentos (ou seja, citometria de fluxo e imunocitoquímica) devam demonstrar a expressão de marcadores de cardiomiócitos usando os mesmos anticorpos, eles devem ser realizados separadamente. Além disso, a citometria de fluxo precisa de um número relativamente maior de células, aumentando assim a quantidade de reagentes necessários para o experimento. Alternativamente, as células positivas para marcadores de cardiomiócitos podem ser quantificadas por contagem manual após imunocitoquímica. No entanto, é muito trabalhoso e tende a ser menos preciso.

O objetivo deste protocolo é descrever o método que pode quantificar e visualizar iCMs por um único experimento de imunocoloração usando análise automatizada de imagem de alto conteúdo. Requer um número relativamente pequeno de células iniciais porque este protocolo é realizado em um poço de placa de 24 poços. Até três marcadores diferentes podem ser usados ao mesmo tempo. Células positivas, simples e duplas podem ser quantificadas automaticamente. Além da quantificação de células imunomarcadas, a análise de imagem de alto conteúdo fornece imagens objetivas de 2 a 100x de alta qualidade. Se necessário, as mesmas células imunomarcadas usadas na análise de imagem de alto conteúdo podem ser reutilizadas para outros estudos de imagem, como microscopia confocal. A principal vantagem deste protocolo é que ele fornece não apenas quantificação imparcial de iCMs com um número muito menor de células, mas também visualização de iCMs. Além disso, este protocolo pode ser utilizado para avaliar a reprogramação de linhagens não cardíacas (por exemplo, iPSC, reprogramação de neurônios e hepatócitos).

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Vanderbilt University Medical Center.

1. Geração de retrovírus e reprogramação cardíaca in vitro

1. Cultive células Platinum E em DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1 μg/mL de puromicina e 10 μg/mL de blasticidina até que a confluência das células Platinum E atinja 70% a 80%.
2. No Dia 1, semeie ~ 0,55 x 10⁶ células (primeiro poço) e ~ 0,18 x 10⁶ células (segundo poço) em dois poços separados de placa de 12 poços com 1 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina um dia antes da primeira transfecção.
   NOTA: Diferentes tamanhos de placas de cultura podem ser usados dependendo da quantidade de mídia viral necessária para os experimentos. Consulte a Tabela 1 para outras escalas de experimentos.
3. No dia 2, transfecte a construção retroviral quad-cistrônica MGTH que codifica Mef2c, Gata4, Tbx5 e Hand2 descrito no estudo anterior⁹ ou vetor vazio em células Platinum E do primeiro poço. Adicione 3 μL de reagente de transfecção a 30 μL de meio de soro reduzido. Cinco minutos depois, adicione 1 μg de construção retroviral ou o vetor vazio na mistura de reagente de transfecção e meio de soro reduzido. Após 20 min de incubação à temperatura ambiente, adicione a mistura às células Platinum E.
4. No dia 3, 16–20 h após a transfecção, remova o meio e reabasteça o DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina.
5. No dia 3, 24 h após a primeira transfecção, realize a segunda transfecção no segundo poço no qual as células Platinum E foram plaqueadas no dia 1, conforme descrito na etapa 1.3).
6. No dia 3, semeie ~ 5 x 10⁴ fibroblastos embrionários de camundongos congelados (MEFs) isolados de camundongos repórter Titin-GFP knock-in¹⁹ em um poço de placa de 24 poços. São necessários dois poços de placa de 24 poços (ou seja, controle não infectado e infecção por MGTH).
   NOTA: O número de MEFs plaqueados pode precisar ser ajustado, porque a taxa de recuperação de MEFs congelados pode variar dependendo das condições de congelamento das células. Cerca de 10% de confluência por dia após a semeadura das células é adequada para a reprogramação. A eficiência da reprogramação pode ser aprimorada usando MEFs frescos e descongelados.
7. No dia 4, 16–20 h após a segunda transfecção, remova o meio e reabasteça o DMEM fresco suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina.
8. No dia 4, 48 h após a primeira transfecção, coletar os meios virais no primeiro poço de células Platinum E usando uma seringa de 5 mL e filtrá-los através de um filtro de membrana de polietersulfona (PES) de 0,45 μm. Remova os meios de crescimento de fibroblastos nos MEFs e substitua-os pelos meios virais suplementados com polibreno a 6 μg / mL (primeira infecção).
9. No dia 5, 48 h após a segunda transfecção, realizar a segunda infecção usando o meio viral no segundo poço conforme descrito na etapa 1.8).
10. No dia 6, 24 h após a segunda infecção, os meios virais são substituídos por meios de indução cardíaca compostos por DMEM/199 (4:1), 10% de FBS, 5% de soro de cavalo, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de aminoácidos essenciais, 1% de B-27, 1% de insulina-selênio-transferrina, 1% de mistura de vitaminas e 1% de piruvato de sódio, 1 μM de SB431542 e 0,5 μm de A83-01. Troque os meios de indução cardíaca a cada três dias até que as células sejam colhidas.

2. Imunocoloração

1. Aos 14 a 15 dias após a infecção, fixe as células em uma placa de 24 poços com paraformaldeído a 2% por 15 min.
2. Permeabilize as células fixas com tampão de permeabilização (0,05% Triton-X em PBS) lavando as células três vezes com tampão de permeabilização a cada 5 min.
3. Incubar as células com tampão de bloqueio universal durante 45 min.
4. Incube as células com α-actinina de camundongo (diluição 1:400) e anticorpos GFP de galinha (diluição 1:400) por 1,5 h em temperatura ambiente.
   NOTA: Cerca de 150 μL de solução de anticorpos podem cobrir toda a área de um poço de placa de 24 poços.
5. Lave as células com tampão de permeabilização por 5 min três vezes.
6. Incube as células com anticorpos secundários Alexa-555 anti-camundongo e Alexa-488 anti-frango (diluição 1:400) por 1 h em temperatura ambiente
7. Lave as células com tampão de permeabilização por 5 min três vezes.
8. Adicione 2,5 μL de solução de DAPI a 250 μL de tampão de permeabilização.

3. Imagem de alto conteúdo

1. Ligue o sistema de imagem.
2. Abra o software associado.
3. Faça login no sistema.
4. Na barra de tarefas, selecione Executar uma placa.
5. Clique em Abrir Placa de Ejeção da Porta para abrir a porta da máquina e colocar a placa. Certifique-se de que a placa esteja na direção certa. Clique em Fechar placa de carregamento da porta para fechar a porta.
6. Clique em Configurações da placa de carga. Selecione um protocolo de modelo e clique em Carregar do banco de dados.
7. Clique em Configuração de aquisição.
8. Na caixa de diálogo Configuração de aquisição de placa , clique em Configurar.
9. Na guia Objetivo e câmera , selecione Objetivo 10x.
10. Na guia Placa , selecione uma placa de 24 poços.
11. Na guia Sites a serem visitados em Opções do site, escolha "Número fixo de sites" para determinar o número de sites de imagem escolhendo o número em colunas e linhas. Um total de 36 locais de imagem são usados selecionando 6 em colunas e 6 em linhas. Selecione o espaçamento entre cada local de imagem (ou seja, 500 μm).
12. Na guia Aquisição , defina o número de comprimento de onda como 3.
13. Na guia Comprimentos de onda em Iluminação, selecione DAPI, FITC ou Texas Red para cada comprimento de onda separadamente.
14. Clique na guia Executar e configure o "Nome da pasta" e o "Nome da placa" para a placa.  Clique nos poços no diagrama de placas para obter imagens e, em seguida, em Calcular para configurar o deslocamento de foco para cada comprimento de onda. Configure o deslocamento de focos para DAPI primeiro. Clique em Auto Expose para configurar o tempo de exposição automaticamente para cada comprimento de onda. Em seguida, clique em Adquirir placa para iniciar a imagem dos locais selecionados.

4. Análise de imagens de alto conteúdo

1. Depois que a imagem de alto conteúdo for concluída, clique no menu Triagem e selecione Revisar dados da placa para selecionar uma placa para análise.
2. Clique em Selecionar placa. Na caixa de diálogo Selecionar placa para revisão , abra a pasta e selecione a placa salva no banco de dados e clique em Selecionar.
   NOTA: Para exibir as imagens, selecione DAPI, FITC e Texas Red no campo Comprimentos de onda. No campo Sites , selecione Todos os sites. Clique em um local entre os 36 locais selecionados para exibi-lo em cada janela de imagem de comprimento de onda e, em seguida, clique em Tabela de pesquisa para selecionar uma cor para o comprimento de onda. Use a tecla Print Screen no teclado e cole a imagem em um software de edição de fotos (por exemplo, Paint e Photoshop) para salvá-la.
3. Clique em Executar Análise e selecione uma configuração de modelo.
4. Clique em Definir configurações e depois em Número de comprimentos de onda. Selecione três comprimentos de onda (ou seja, DAPI para coloração de núcleos, Teaxs Red para α-actinina e FITC para Titina-GFP).
5. Usando a ferramenta Linha na barra de ferramentas, meça a largura no eixo curto de uma célula. Com base nas larguras medidas das células, defina a "Largura mínima aproximada" e a "Largura máxima aproximada" para incluir a maioria das células no local de imagem selecionado.
6. Clique em Visualizar para verificar se quase todos os núcleos estão selecionados. Os núcleos selecionados exibem a cor branca, enquanto os núcleos não selecionados permanecem azuis (corados com DAPI). Se necessário, faça ajustes para "Largura mínima aproximada" e "Largura máxima aproximada".
7. Para definir a Intensidade acima do plano de fundo local, coloque o cursor do mouse dentro e fora de uma célula. O valor de intensidade aparece na parte inferior da janela. Reduza ligeiramente a intensidade de uma célula escura para exibir uniformemente a intensidade em toda a área de cada célula. Defina esse valor de intensidade como Intensidade acima do valor de plano de fundo local . Esse valor precisa ser definido separadamente para cada canal.
8. Clique no menu Triagem e selecione Utilitários de dados de placas. Na caixa de diálogo Utilitários de dados de placa, clique em Executar análise para selecionar a placa.
9. No campo Configurações , selecione a configuração salva para análise; selecione Adicionar à Lista de Execução Automática e clique em OK para executar a análise.
10. Após a conclusão da análise, clique no menu Triagem e selecione Utilitários de dados de placa. Em seguida, na caixa de diálogo Utilitários de dados de placa, clique em Exportar medidas para exportar os resultados da análise.
11. Clique em Medidas de células e imagens e depois em OK.
12. Na página Assistente de exportação de medidas - Etapa 1 , selecione a placa e clique em Avançar.
13. Na página Assistente de exportação de medidas - Etapa 2 , clique em Concluir.
14. Na página Configurar exportação de dados, selecione os tipos de dados (ou seja, nome do poço, número total da célula, número da célula subtotal para DAPI⁺, número da célula subtotal para Texas Red⁺, número da célula subtotal para FITC⁺, número da célula subtotal para DAPI⁺Texas Red⁺, número da célula subtotal para DAPI⁺FITC⁺, número da célula subtotal para DAPI⁺FITC⁺Texas Red⁺, porcentagem de células DAPI⁺, porcentagem de células DAPI⁺Texas Red⁺, porcentagem de células DAPI⁺FITC⁺ e porcentagem de células DAPI⁺Texas Red⁺FITC⁺) e clique em OK.
15. Na página Exportar como arquivo de texto, selecione o destino para salvar o arquivo e clique em OK.
16. Abra o arquivo no Microsoft Excel. Os resultados serão apresentados por cada local (Tabela 2). Existem 36 locais por poço. Usando a ferramenta de análise, Tabela Dinâmica, resuma os dados dos 36 locais (ou seja, as somas dos números de células e as médias da porcentagem de células indicada em todos os 36 locais) (Tabela 3).

Resultados

Após experimentos de reprogramação, quantificamos iCMs usando análise de imagem de alto conteúdo, conforme descrito acima. Imagens compostas de 36 locais de imagem que foram usados para análise de imagem de alto conteúdo foram mostradas na Figura 1. Os iCMs são definidos como células duplamente positivas (α-actinina⁺Titina-eGFP⁺) nesses experimentos. A análise de imagem de alto conteúdo mostra que ~ 26% das células exibiram...

Discussão

Os estudos de reprogramação anteriores avaliaram a eficiência da reprogramação usando citometria de fluxo e demonstraram a qualidade estrutural dos iCMs usando imunocitoquímica em dois experimentos separados. A análise por citometria de fluxo requer um número muito maior de células iniciais, aumentando assim a escala dos experimentos. Em contraste, a análise de imagem de alto conteúdo pode avaliar a qualidade e a quantidade de reprogramação do iCM por um único experimento c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
anti-chicken Alexa 488	Thermofisher	A11039
anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262
anti-mouse Alexa 555	Thermofisher	A21422
anti-α-actinin antibody	Sigma	A7811
DAPI solution	Vector labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Insulin-Transferrin-SeleniumG supplement	Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM vitamin solution	Invitrogen	11120-052
MetaXpress software	Molecular device
Micro XL automated cell imagining system	Molecular device
Minimal essential amino acid solution	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
PES filter (0.45 µm)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E cells	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Universal blocking buffer	BiogeneX	HK083-50K