Оценка перепрограммирования сердца с помощью высокосодержательного визуализационного анализа

Резюме

Мы представляем протокол для количественной оценки непосредственно перепрограммированных индуцированных кардиомиоцитоподобных клеток (iCMs) in vitro с использованием анализа изображений с высоким содержанием. Этот метод позволяет количественно оценить эффективность перепрограммирования сердца в автоматическом режиме и непосредственно визуализировать iCM.

Аннотация

Целью данного протокола является описание метода количественного определения индуцированных кардиомиоцитарных подобных клеток (iCMs), которые напрямую перепрограммируются in vitro с помощью метода перепрограммирования. Перепрограммирование сердца обеспечивает стратегию для генерации новых кардиомиоцитов. Путем введения в фибробласты основных кардиогенных факторов транскрипции; Фибробласты могут быть преобразованы в iCM без перехода через состояние плюрипотентных стволовых клеток. Тем не менее, скорость преобразования фибробластов в iCM все еще остается низкой. Соответственно, существует множество дополнительных подходов к повышению эффективности перепрограммирования сердца. В большинстве этих исследований оценивалась эффективность перепрограммирования сердца с помощью проточной цитометрии, в то же время проводилась иммуноцитохимия для визуализации iCM. Таким образом, для демонстрации успешности перепрограммирования iCM требуется как минимум два отдельных набора экспериментов по перепрограммированию. В отличие от этого, автоматизированный анализ изображений с высоким содержанием обеспечит как количественную оценку, так и квалификацию перепрограммирования iCM с относительно небольшим числом ячеек. С помощью этого метода можно напрямую оценить количество и качество iCM с помощью одного эксперимента по перепрограммированию. Этот подход сможет облегчить будущие исследования по перепрограммированию сердца, которые требуют крупномасштабных экспериментов по перепрограммированию, таких как скрининг генетических или фармакологических факторов для повышения эффективности перепрограммирования. Кроме того, применение протокола визуализационного анализа с высоким содержанием не ограничивается перепрограммированием сердца. Он может быть применен для перепрограммирования других клеточных линий, а также для любых экспериментов по иммуноокрашиванию, которые требуют как количественной оценки, так и визуализации иммуноокрашенных клеток.

Введение

Перепрограммирование сердца было разработано в качестве альтернативного подхода к опосредованным стволовыми клетками подходам к генерации новых кардиомиоцитов. Учитывая, что он не переходит из одного состояния в состояние стволовых клеток, он обладает высоким потенциалом для обхода некоторых наследственных ограничений в подходах, опосредованных стволовыми клетками. Показано, что вирусная инфекция по меньшей мере трех или четырех кардиогенных факторов транскрипции в фибробласты может преобразовывать фибробласты в сторону сердечной судьбы путем элиминации генных программ фибробластов и восстановления кардиогенных транскрипционных сетей в фибробластах 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10^, 11,12,13,14,15,16,17.

С момента первого знакового исследования, демонстрирующего перепрограммирование сердца in^{vitro 1}, протокол перепрограммирования сердца был оптимизирован многочисленными исследованиями 3,5,6,7,9,11,12,13,14,15,16,18 . Общими техническими подходами к оценке фенотипов сердца в фибробластах после перепрограммирования сердца являются анализ проточной цитометрии для количественного определения клеток, экспрессирующих специфические маркеры кардиомиоцитов, и иммуноцитохимия для визуализации этих клеток на уровне одной клетки. Хотя оба эксперимента (т.е. проточная цитометрия и иммуноцитохимия) должны продемонстрировать экспрессию кардиомиоцитарных маркеров с использованием одних и тех же антител, они должны быть выполнены отдельно. Кроме того, проточная цитометрия требует относительно большего количества клеток, тем самым увеличивая количество реагентов, необходимых для эксперимента. В качестве альтернативы, кардиомиоцитарные маркер-положительные клетки могут быть количественно определены путем ручного подсчета после иммуноцитохимии. Однако он очень трудоемкий и, как правило, менее точен.

Целью данного протокола является описание метода, который позволяет количественно оценить и визуализировать iCM с помощью одного эксперимента по иммуноокрашиванию с использованием автоматизированного анализа изображений с высоким содержанием вируса. Для этого требуется относительно небольшое количество исходных ячеек, поскольку этот протокол выполняется в лунке с 24-луночным планшетом. Одновременно можно использовать целых три разных маркера. Одинарные, двойные и тройные положительные ячейки могут быть автоматически количественно определены. В дополнение к количественному определению иммуноокрашенных клеток, визуализационный анализ с высоким содержанием обеспечивает высококачественные объективные изображения с 2-100 разами. При необходимости те же иммуноокрашенные клетки, которые используются в визуализационном анализе с высоким содержанием, могут быть повторно использованы для дальнейших визуализирующих исследований, таких как конфокальная микроскопия. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он обеспечивает не только несмещенную количественную оценку iCMs с гораздо меньшим количеством клеток, но и визуализацию iCM. Кроме того, этот протокол может быть использован для оценки несердечного перепрограммирования линий (например, перепрограммирование iPSC, нейронов и гепатоцитов).

протокол

Все процедуры на животных были проведены с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию в Медицинском центре Университета Вандербильта.

1. Генерация ретровируса и перепрограммирование сердца in vitro

1. Культивирование клеток платины Е в DMEM с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина, 1 мкг/мл пуромицина и 10 мкг/мл бластицидина до тех пор, пока слияние платиновых клеток Е не достигнет 70%–80%.
2. В 1-й день высейте ~0,55 x 10⁶ клеток (первая лунка) и ~0,18 x 10⁶ клеток (вторая лунка) в две отдельные лунки 12-луночного планшета с 1 мл DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина за день до первой трансфекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества вирусной среды, необходимой для экспериментов, можно использовать чашки для культур разных размеров. Другие масштабы экспериментов см. в таблице 1 .
3. На 2-й день трансфектируйте четырехцистроническую ретровирусную конструкцию M-G-T-H, кодирующую Mef2c, Gata4, Tbx5 и Hand2, описанную в предыдущем исследовании⁹ , или пустой вектор в клетки Platinum E первой лунки. Добавьте 3 мкл трансфекционного реагента к 30 мкл восстановленной среды сыворотки. Через пять минут добавьте 1 г ретровирусной конструкции или пустой вектор в смесь реагента для трансфекции и восстановленной сыворотки среды. После 20 мин инкубации при комнатной температуре добавьте смесь к платиновым Е-клеткам.
4. На 3-й день, через 16–20 ч после трансфекции, удалить среду и пополнить свежий ДМЭМ, дополненный 10% FBS и 1% пенициллином/стрептомицином.
5. На 3-й день, через 24 ч после первой трансфекции, выполните вторую трансфекцию во вторую лунку, в которую были помещены платиновые Е-клетки в 1-й день, как описано в шаге 1.3).
6. На 3-й день семена ~5 x 10⁴ замороженных эмбриональных фибробластов мышей (MEF), выделенных из репортеров Titin-GFP, выбили мышей¹⁹ в лунку с 24-луночным планшетом. Всего необходимо две лунки с 24-луночным планшетом (т.е. неинфицированный контроль и инфекция M-G-T-H).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество покрытых MEF может потребоваться скорректировать, потому что скорость восстановления замороженных MEF может варьироваться в зависимости от условий замораживания клеток. Около 10% конфлюенции в сутки после посева клеток достаточно для перепрограммирования. Эффективность перепрограммирования может быть повышена с помощью свежих размороженных MEF.
7. На 4-е сутки, через 16–20 ч после второй трансфекции, удалить среду и пополнить свежий ДМЭМ, дополненный 10% FBS и 1% пенициллином/стрептомицином.
8. На 4-й день, через 48 ч после первой трансфекции, соберите вирусную среду в первой лунке платиновых клеток Е с помощью шприца объемом 5 мл и отфильтруйте их через мембранный фильтр из полиэфирсульфона (PES) 0,45 мкм. Удалите питательную среду фибробластов на МЭФ и замените их вирусной средой с добавлением полибрена в концентрации 6 мкг/мл (первая инфекция).
9. На 5-й день, через 48 ч после второй трансфекции, проведите вторую инфекцию с использованием вирусных сред во второй лунке, как описано в шаге 1.8).
10. На 6-й день, через 24 ч после второй инфекции, вирусные среды заменяются сердечными индукционными средами, состоящими из DMEM/199 (4:1), 10% FBS, 5% лошадиной сыворотки, 1% пенициллина/стрептомицина, 1% заменимых аминокислот, 1% заменимых аминокислот, 1% незаменимых аминокислот, 1% B-27, 1% инсулин-селен-трансферрина, 1% витаминной смеси и 1% пирувата натрия, 1 мкМ SB431542 и 0,5 мкм A83-01. Меняйте сердечную индукционную среду каждые три дня до тех пор, пока клетки не будут собраны.

2. Иммуноокрашивание

1. Через 14–15 дней после инфицирования зафиксировать клетки на 24-луночном планшете с 2% параформальдегидом на 15 минут.
2. Пермеабилизируйте неподвижные клетки пермеабилизационным буфером (0,05% Triton-X в PBS) путем трехкратной промывания клеток пермеабилизационным буфером каждые 5 минут.
3. Инкубируйте клетки с универсальным блокирующим буфером в течение 45 минут.
4. Инкубируйте клетки с мышиным α-актинином (разведение 1:400) и антителами GFP у курицы (разведение 1:400) в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
   Примечание: Около 150 мкл раствора антитела может покрыть всю площадь лунки 24-луночного планшета.
5. Промойте клетки пермеабилизационным буфером в течение 5 мин три раза.
6. Инкубируйте клетки с вторичными антителами против мышей Alexa-555 и Alexa-488 против курицы (разведение 1:400) в течение 1 ч при комнатной температуре
7. Промойте клетки пермеабилизационным буфером в течение 5 мин три раза.
8. Добавьте 2,5 мкл раствора DAPI в 250 мкл пермеабилизационного буфера.

3. Изображение с высоким содержанием

1. Включите систему формирования изображений.
2. Откройте соответствующее программное обеспечение.
3. Войдите в систему.
4. На панели задач выберите «Запустить пластину».
5. Нажмите на кнопку «Открыть дверцу-извлечь пластину », чтобы открыть дверцу на машине и вставить пластину. Убедитесь, что пластина находится в правильном направлении. Нажмите на кнопку «Закрыть дверцу-нагрузочную пластину », чтобы закрыть дверь.
6. Нажмите на Настройки нагруженной пластины. Выберите протокол шаблона и нажмите кнопку «Загрузить из базы данных».
7. Нажмите « Настройка приобретения».
8. В диалоговом окне Plate Acquisition Setup нажмите кнопку Настроить.
9. На вкладке «Объектив и камера » выберите объектив 10x.
10. На вкладке Планшет выберите планшет с 24 лунками.
11. На вкладке «Сайты для посещения » в параметрах сайта выберите «Фиксированное количество сайтов», чтобы определить количество сайтов обработки изображений, выбрав количество в столбцах и строках. Всего используется 36 сайтов визуализации путем выбора 6 в столбцах и 6 в строках. Выберите Расстояние между каждым участком съемки (т. е. 500 мкм).
12. На вкладке Acquisition (Получение ) установите число длин волн равным 3.
13. На вкладке «Длины волн» в разделе «Освещение» выберите DAPI, FITC или Texas Red для каждой длины волны отдельно.
14. Перейдите на вкладку «Выполнить », а затем настройте «Имя папки» и «Имя пластины» для пластины.  Щелкните лунки на диаграмме пластин для получения изображения, а затем нажмите кнопку Рассчитать , чтобы настроить смещение фокуса для каждой длины волны. Сначала настройте смещение фолков для DAPI. Нажмите « Автоэкспонирование », чтобы автоматически настроить время экспозиции для каждой длины волны. Затем нажмите « Получить пластину », чтобы начать визуализацию выбранных участков.

4. Анализ изображений с высоким содержанием

1. После завершения визуализации с высоким содержанием нажмите меню «Скрининг» и выберите «Просмотреть данные пластины », чтобы выбрать пластину для анализа.
2. Нажмите на Select Plate. В диалоговом окне « Выбрать табличку для просмотра » откройте папку и выберите пластину, сохраненную в базе данных, а затем нажмите «Выбрать».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы отобразить изображения, выберите DAPI, FITC и Texas Red в поле Длины волн. В поле Сайты выберите Все сайты. Нажмите на сайт среди выбранных 36 сайтов, чтобы отобразить его в каждом окне изображения длины волны, а затем нажмите на Таблицу поиска , чтобы выбрать цвет для длины волны. Используйте клавишу «Print Screen » на клавиатуре и вставьте изображение в программное обеспечение для редактирования фотографий (например, Paint и Photoshop), чтобы сохранить его.
3. Нажмите « Запустить анализ» и выберите настройку шаблона.
4. Нажмите « Настроить параметры », а затем « Количество длин волн». Выберите три длины волны ( т.е. DAPI для окрашивания ядер, Teaxs Red для α-актинина и FITC для Titin-GFP).
5. С помощью инструмента «Линия » на панели инструментов измерьте ширину по короткой оси ячейки. Основываясь на измеренной ширине ячеек, установите параметры «Приблизительная минимальная ширина» и «Приблизительная максимальная ширина», чтобы включить большую часть ячеек в выбранном месте визуализации.
6. Нажмите на кнопку «Предварительный просмотр », чтобы проверить, выбраны ли почти все ядра. Выбранные ядра имеют белый цвет, в то время как невыбранные ядра остаются синими (окрашены DAPI). При необходимости внесите корректировки для параметров "Приблизительная минимальная ширина" и "Приблизительная максимальная ширина".
7. Чтобы задать параметр «Интенсивность выше локального фона», поместите курсор мыши внутрь и за пределы ячейки. Значение интенсивности отображается в нижней части окна. Немного уменьшите интенсивность тусклой ячейки, чтобы равномерно проявить интенсивность по всей площади каждой клетки. Определите это значение интенсивности как значение Интенсивность выше локального фона . Это значение нужно задавать отдельно для каждого канала.
8. Щелкните меню Screening и выберите Plate Data Utilities. В диалоговом окне Plate Data Utilities нажмите кнопку Run Analysis , чтобы выбрать пластину.
9. В поле Настройки выберите сохраненную настройку для анализа; выберите «Добавить в список автозапуска», а затем нажмите « ОК», чтобы запустить анализ.
10. После завершения анализа нажмите на меню «Экранирование » и выберите «Утилиты для обработки данных пластин». Затем в диалоговом окне Plate Data Utilities нажмите Export Measurements , чтобы экспортировать результаты анализа.
11. Нажмите «Измерения ячеек и изображений», а затем нажмите «OK».
12. На странице Мастер экспорта измерений - Шаг 1 выберите пластину и нажмите кнопку Далее.
13. На странице Мастер экспорта измерений - Шаг 2 нажмите кнопку Готово.
14. На странице "Настройка экспорта данных" выберите типы данных (т. е. имя скважины, общее количество ячеек, промежуточное количество ячеек для DAPI⁺, промежуточное количество ячеек для Texas Red⁺, промежуточное количество ячеек для FITC⁺, промежуточное количество ячеек для DAPI⁺Texas Red⁺, промежуточное количество ячеек для DAPI^+FITC+Texas Red⁺, процент ячеек DAPI⁺, процент ячеек DAPI⁺Texas Red⁺, процент ячеек DAPI⁺FITC⁺ и процент ячеек DAPI⁺Texas Red^+FITC+), а затем нажмите OK.
15. На странице Экспорт как текстовый файл выберите место назначения для сохранения файла и нажмите OK.
16. Откройте файл в Microsoft Excel. Результаты будут представлены по каждому сайту (Таблица 2). На одну скважину приходится 36 участков. Используя инструмент анализа, сводную таблицу, суммируйте данные по 36 сайтам (т. е. суммы номеров ячеек и средние значения указанного процента ячеек во всех 36 сайтах) (Таблица 3).

Результаты

После экспериментов по перепрограммированию мы количественно определили iCM с помощью анализа изображений с высоким содержанием контента, как описано выше. Составные изображения 36 участков визуализации, которые были использованы для анализа изображений с высоким со...

Обсуждение

В предыдущих исследованиях по перепрограммированию оценивалась эффективность перепрограммирования с помощью проточной цитометрии и было продемонстрировано структурное качество iCMs с использованием иммуноцитохимии в двух отдельных экспериментах. Анализ проточно?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
anti-chicken Alexa 488	Thermofisher	A11039
anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262
anti-mouse Alexa 555	Thermofisher	A21422
anti-α-actinin antibody	Sigma	A7811
DAPI solution	Vector labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Insulin-Transferrin-SeleniumG supplement	Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM vitamin solution	Invitrogen	11120-052
MetaXpress software	Molecular device
Micro XL automated cell imagining system	Molecular device
Minimal essential amino acid solution	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
PES filter (0.45 µm)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E cells	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Universal blocking buffer	BiogeneX	HK083-50K