Beurteilung der kardialen Reprogrammierung mit High-Content-Bildgebungsanalyse

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll zur Quantifizierung direkt reprogrammierter induzierter Kardiomyozyten-ähnlicher Zellen (iCMs) in vitro unter Verwendung von High-Content-Bildgebungsanalysen vor. Diese Methode ermöglicht es uns, die Effizienz der kardialen Reprogrammierung automatisiert zu quantifizieren und iCMs direkt zu visualisieren.

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zur Quantifizierung von induzierten Kardiomyozyten-ähnlichen Zellen (iCMs) zu beschreiben, die in vitro durch eine Reprogrammierungstechnik direkt umprogrammiert werden. Die kardiale Reprogrammierung bietet eine Strategie zur Generierung neuer Kardiomyozyten. Durch die Einführung von kardiogenen Transkriptionsfaktoren in Fibroblasten; Fibroblasten können ohne Übergang durch den pluripotenten Stammzellzustand in iCMs umgewandelt werden. Die Umwandlungsrate von Fibroblasten in iCMs ist jedoch nach wie vor gering. Dementsprechend gibt es zahlreiche zusätzliche Ansätze, um die Effizienz der kardialen Reprogrammierung zu verbessern. Die meisten dieser Studien untersuchten die Effizienz der kardialen Reprogrammierung mittels Durchflusszytometrie, während gleichzeitig Immunzytochemie zur Visualisierung von iCMs durchgeführt wurde. Daher sind mindestens zwei separate Reihen von Reprogrammierungsexperimenten erforderlich, um den Erfolg der iCM-Reprogrammierung zu demonstrieren. Im Gegensatz dazu ermöglicht die automatisierte High-Content-Imaging-Analyse sowohl die Quantifizierung als auch die Qualifizierung der iCM-Reprogrammierung mit einer relativ kleinen Anzahl von Zellen. Mit dieser Methode ist es möglich, die Quantität und Qualität von iCMs mit einem einzigen Reprogrammierungsexperiment direkt zu beurteilen. Dieser Ansatz wird in der Lage sein, zukünftige kardiale Reprogrammierungsstudien zu erleichtern, die groß angelegte Reprogrammierungsexperimente erfordern, wie z. B. das Screening genetischer oder pharmakologischer Faktoren zur Steigerung der Reprogrammierungseffizienz. Darüber hinaus ist die Anwendung des High-Content-Imaging-Analyseprotokolls nicht auf die kardiale Reprogrammierung beschränkt. Es kann sowohl für die Reprogrammierung anderer Zelllinien als auch für Immunfärbeexperimente eingesetzt werden, die sowohl die Quantifizierung als auch die Visualisierung von immungefärbten Zellen erfordern.

Einleitung

Die kardiale Reprogrammierung wurde als alternativer Ansatz zu stammzellvermittelten Ansätzen zur Erzeugung neuer Kardiomyozyten entwickelt. Da es nicht durch den Stammzellzustand übergeht, hat es ein hohes Potenzial, einige vererbte Einschränkungen bei stammzellvermittelten Ansätzen zu umgehen. Es wurde gezeigt, dass eine Virusinfektion von mindestens drei oder vier kardiogenen Transkriptionsfaktoren in Fibroblasten Fibroblasten in ein kardiales Schicksal umwandeln kann, indem Fibroblasten-Genprogramme eliminiert und kardiogene Transkriptionsnetzwerke in den Fibroblasten 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10^, 11,12,13,14,15,16,17.

Seit der ersten bahnbrechenden Studie, die die kardiale Reprogrammierung in vitro demonstrierte¹, wurde das kardiale Reprogrammierungsprotokoll durch zahlreiche Studien optimiert 3,5,6,7,9,11,12,13,14,15,16,18 . Gängige technische Ansätze zur Beurteilung kardialer Phänotypen in Fibroblasten nach kardialer Reprogrammierung sind die Durchflusszytometrie-Analyse zur Quantifizierung von Zellen, die spezifische Kardiomyozytenmarker exprimieren, und die Immunzytochemie zur Visualisierung dieser Zellen auf Einzelzellebene. Obwohl beide Experimente (d.h. Durchflusszytometrie und Immunzytochemie) die Expression von Kardiomyozytenmarkern mit denselben Antikörpern nachweisen sollen, müssen sie getrennt voneinander durchgeführt werden. Darüber hinaus benötigt die Durchflusszytometrie eine relativ größere Anzahl von Zellen, wodurch die Menge der für das Experiment benötigten Reagenzien erhöht wird. Alternativ können Kardiomyozyten-Marker-positive Zellen durch manuelle Zählung nach Immunzytochemie quantifiziert werden. Es ist jedoch sehr arbeitsintensiv und tendenziell weniger genau.

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, die Methode zu beschreiben, mit der iCMs durch ein einzelnes Immunfärbeexperiment unter Verwendung einer automatisierten High-Content-Imaging-Analyse quantifiziert und visualisiert werden können. Es wird eine relativ kleine Anzahl von Startzellen benötigt, da dieses Protokoll in einer Vertiefung mit einer 24-Well-Platte durchgeführt wird. Es können bis zu drei verschiedene Marker gleichzeitig verwendet werden. Einfache, doppelt und dreifach positive Zellen können automatisch quantifiziert werden. Neben der Quantifizierung immungefärbter Zellen liefert die High-Content-Imaging-Analyse qualitativ hochwertige objektive Bilder mit dem 2- bis 100-fachen Gehalt. Bei Bedarf können dieselben immungefärbten Zellen, die in der High-Content-Bildgebung verwendet werden, für weitere bildgebende Studien, wie z. B. die konfokale Mikroskopie, wiederverwendet werden. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es nicht nur eine unverzerrte Quantifizierung von iCMs mit einer viel geringeren Anzahl von Zellen ermöglicht, sondern auch die Visualisierung von iCMs. Darüber hinaus kann dieses Protokoll zur Beurteilung der Reprogrammierung nicht-kardialer Abstammungslinien (z. B. iPS-, Neuronen- und Hepatozyten-Reprogrammierung) verwendet werden.

Protokoll

Alle Eingriffe an den Tieren wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee des Vanderbilt University Medical Center durchgeführt.

1. Retrovirusgenerierung und kardiale In-vitro-Reprogrammierung

1. Kultur von Platin-E-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 μg/ml Puromycin und 10 μg/ml Blasticidin, bis die Konfluenz der Platin-E-Zellen 70 % bis 80 % erreicht.
2. An Tag 1 werden ~0,55 x 10⁶ Zellen (erste Vertiefung) und ~0,18 x 10⁶ Zellen (zweite Vertiefung) in zwei separate Vertiefungen mit einer 12-Well-Platte mit 1 ml DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin, einen Tag vor der ersten Transfektion, ausgesät.
   HINWEIS: Je nach Menge des für die Experimente benötigten viralen Mediums können unterschiedliche Größen von Kulturschalen verwendet werden. Weitere Skalen von Experimenten finden Sie in Tabelle 1 .
3. An Tag 2 transfiziert das quad-cistronische retrovirale M-G-T-H-Konstrukt, das für Mef2c, Gata4, Tbx5 und Hand2 kodiert, das in der vorherigen Studie⁹ beschrieben wurde, oder einen leeren Vektor in Platin-E-Zellen der ersten Vertiefung. Fügen Sie 3 μl Transfektionsreagenz zu 30 μl reduziertem Serummedium hinzu. Fünf Minuten später fügen Sie 1 μg retrovirales Konstrukt oder den leeren Vektor in die Mischung aus Transfektionsreagenz und reduziertem Serummedium hinzu. Nach 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur die Mischung in die Platin-E-Zellen geben.
4. Am Tag 3, 16–20 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie das Medium und füllen Sie frisches DMEM auf, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt wird.
5. Führen Sie an Tag 3, 24 h nach der ersten Transfektion, die zweite Transfektion in die zweite Vertiefung durch, in der Platin-E-Zellen an Tag 1 plattiert wurden, wie in Schritt 1.3 beschrieben).
6. An Tag 3 säen ~5 x 10⁴ gefrorene embryonale Mausfibroblasten (MEFs), die aus Titin-GFP-Reporter-Knock-in-Mäusen¹⁹ isoliert wurden, in eine Vertiefung mit einer 24-Well-Platte. Insgesamt werden zwei Vertiefungen mit einer 24-Well-Platte benötigt (d. h. nicht infizierte Kontrolle und M-G-T-H-Infektion).
   HINWEIS: Die Anzahl der plattierten MEFs muss möglicherweise angepasst werden, da die Wiederfindungsrate von eingefrorenen MEFs je nach den Einfrierbedingungen der Zelle variieren kann. Etwa 10% Konfluenz pro Tag nach der Aussaat der Zellen ist ausreichend für die Reprogrammierung. Die Effizienz der Neuprogrammierung könnte durch die Verwendung frischer, nicht gefrorener MEFs verbessert werden.
7. Entfernen Sie am 4. Tag, 16–20 Stunden nach der zweiten Transfektion, das Medium und füllen Sie frisches DMEM auf, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt wird.
8. An Tag 4, 48 h nach der ersten Transfektion, sammeln Sie die viralen Medien in der ersten Vertiefung der Platin-E-Zellen mit einer 5-ml-Spritze und filtrieren Sie sie durch einen 0,45 μm Polyethersulfon (PES)-Membranfilter. Entfernen Sie die Fibroblasten-Wachstumsmedien auf MEFs und ersetzen Sie sie durch die viralen Medien, die mit Polybren bei 6 μg/ml (erste Infektion) ergänzt sind.
9. Führen Sie am 5. Tag, 48 h nach der zweiten Transfektion, die zweite Infektion mit den viralen Medien in der zweiten Vertiefung durch, wie in Schritt 1.8 beschrieben).
10. Am Tag 6, 24 h nach der zweiten Infektion, werden die viralen Medien durch kardiale Induktionsmedien ersetzt, die aus DMEM/199 (4:1), 10 % FBS, 5 % Pferdeserum, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % essentiellen Aminosäuren, 1 % B-27, 1 % Insulin-Selen-Transferrin, 1 % Vitaminmischung und 1 % Natriumpyruvat, 1 μM SB431542 und 0,5 μm A83-01 bestehen. Wechseln Sie das kardiale Induktionsmedium alle drei Tage, bis die Zellen geerntet sind.

2. Immunfärbung

1. 14–15 Tage nach der Infektion fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang auf einer 24-Well-Platte mit 2 % Paraformaldehyd.
2. Permeabilisieren Sie die fixierten Zellen mit Permeabilisierungspuffer (0,05% Triton-X in PBS), indem Sie die Zellen alle 5 Minuten dreimal mit Permeabilisierungspuffer waschen.
3. Inkubieren Sie die Zellen mit universellem Blockierungspuffer für 45 min.
4. Inkubieren Sie die Zellen mit Maus-α-Actinin (1:400 Verdünnung) und Hühner-GFP-Antikörpern (1:400 Verdünnung) für 1,5 h bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Etwa 150 μl Antikörperlösung können den gesamten Bereich einer Vertiefung einer 24-Well-Platte abdecken.
5. Waschen Sie die Zellen dreimal 5 Minuten lang mit Permeabilisierungspuffer.
6. Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-Maus-Sekundärantikörpern Alexa-555 und Anti-Hühner-Alexa-488 (1:400 Verdünnung) für 1 h bei Raumtemperatur
7. Waschen Sie die Zellen dreimal 5 Minuten lang mit Permeabilisierungspuffer.
8. Geben Sie 2,5 μl DAPI-Lösung in 250 μl Permeabilisierungspuffer.

3. High-Content-Bildgebung

1. Schalten Sie das Imaging-System ein.
2. Öffnen Sie die zugehörige Software.
3. Melden Sie sich im System an.
4. Wählen Sie auf der Taskleiste die Option Platte ausführen aus.
5. Klicken Sie auf Türauswurfplatte öffnen , um die Tür an der Maschine zu öffnen und die Platte einzusetzen. Stellen Sie sicher, dass die Platte in die richtige Richtung zeigt. Klicken Sie auf Türladeplatte schließen , um die Tür zu schließen.
6. Klicken Sie auf Lastplatteneinstellungen. Wählen Sie ein Vorlagenprotokoll aus und klicken Sie dann auf Aus DB laden.
7. Klicken Sie auf Akquisitionseinrichtung.
8. Klicken Sie im Dialogfeld "Plate Acquisition Setup " auf "Konfigurieren".
9. Wählen Sie auf der Registerkarte "Objektiv und Kamera " die Option "10-faches Ziel" aus.
10. Wählen Sie auf der Registerkarte Platte eine 24-Well-Platte aus.
11. Wählen Sie auf der Registerkarte "Zu besuchende Sites " in den Site-Optionen die Option "Feste Anzahl von Sites" aus, um die Anzahl der Imaging-Sites zu bestimmen, indem Sie die Anzahl in Spalten und Zeilen auswählen. Insgesamt werden 36 Bildgebungsstellen verwendet, indem 6 in Spalten und 6 in Zeilen ausgewählt werden. Wählen Sie den Abstand zwischen den einzelnen Bildgebungsstellen (d. h. 500 μm).
12. Legen Sie auf der Registerkarte Erfassung die Anzahl der Wellenlängen auf 3 fest.
13. Wählen Sie auf der Registerkarte Wellenlängen unter Beleuchtung für jede Wellenlänge separat DAPI, FITC oder Texas Red aus.
14. Klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen und richten Sie dann den "Ordnernamen" und den "Plattennamen" für die Platte ein.  Klicken Sie auf die Vertiefungen im Plattendiagramm für die Bildgebung und dann auf Berechnen , um den Fokusversatz für jede Wellenlänge festzulegen. Richten Sie zuerst den Foucs-Offset für DAPI ein. Klicken Sie auf Auto Exposé , um die Belichtungszeit automatisch für jede Wellenlänge einzustellen. Klicken Sie dann auf Acquire Plate , um mit dem Imaging der ausgewählten Stellen zu beginnen.

4. Analyse von High-Content-Imaging

1. Sobald die High-Content-Bildgebung abgeschlossen ist, klicken Sie auf das Menü Screening und wählen Sie Plattendaten überprüfen , um eine Platte für die Analyse auszuwählen.
2. Klicken Sie auf Platte auswählen. Öffnen Sie im Dialogfeld Platte zur Überprüfung auswählen den Ordner, wählen Sie die in der Datenbank gespeicherte Platte aus und klicken Sie dann auf Auswählen.
   HINWEIS: Um die Bilder anzuzeigen, wählen Sie DAPI, FITC und Texas Red im Feld Wellenlängen aus. Wählen Sie im Feld Sites die Option All Sites aus. Klicken Sie auf eine der ausgewählten 36 Websites, um sie in jedem Wellenlängen-Bildfenster anzuzeigen, und klicken Sie dann auf Nachschlagetabelle , um eine Farbe für die Wellenlänge auszuwählen. Verwenden Sie die Taste "Bildschirm drucken " auf der Tastatur und fügen Sie das Bild in eine Fotobearbeitungssoftware (z. B. Paint und Photoshop) ein, um es zu speichern.
3. Klicken Sie auf Analyse ausführen und wählen Sie eine Vorlageneinstellung aus.
4. Klicken Sie auf Einstellungen konfigurieren und dann auf Anzahl der Wellenlängen. Wählen Sie drei Wellenlängen aus (d. h. DAPI für die Kernfärbung, Teaxs Red für α-Actinin und FITC für Titin-GFP).
5. Messen Sie mit dem Linienwerkzeug in der Symbolleiste die Breite über die kurze Achse einer Zelle. Legen Sie basierend auf den gemessenen Breiten der Zellen die Werte "Ungefähre minimale Breite" und "Ungefähre maximale Breite" so fest, dass die meisten Zellen an der ausgewählten Bildgebungsstelle eingeschlossen werden.
6. Klicken Sie auf Vorschau , um zu überprüfen, ob fast alle Kerne ausgewählt sind. Die selektierten Zellkerne sind weiß gefärbt, während die nicht selektierten Zellkerne blau bleiben (DAPI gefärbt). Nehmen Sie ggf. Anpassungen für "Ungefähre minimale Breite" und "Ungefähre maximale Breite" vor.
7. Um die Intensität über dem lokalen Hintergrund festzulegen, platzieren Sie einen Mauszeiger innerhalb und außerhalb einer Zelle. Der Intensitätswert wird am unteren Rand des Fensters angezeigt. Verringern Sie die Intensität einer schwachen Zelle leicht, um die Intensität gleichmäßig über den gesamten Bereich jeder Zelle anzuzeigen. Definieren Sie diesen Intensitätswert als Wert für Intensität über lokalem Hintergrund . Dieser Wert muss für jeden Kanal separat eingestellt werden.
8. Klicken Sie auf das Menü "Screening" und wählen Sie "Plate Data Utilities". Klicken Sie im Dialogfeld Plate Data Utilities auf Analyse ausführen , um das Blech auszuwählen.
9. Wählen Sie im Feld Einstellungen die gespeicherte Einstellung für die Analyse aus. Wählen Sie Zur Liste der automatischen Ausführungen hinzufügen aus, und klicken Sie dann auf OK , um die Analyse auszuführen.
10. Nachdem die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf das Menü "Screening " und wählen Sie "Plate Data Utilities". Klicken Sie dann im Dialogfeld Plate Data Utilities auf Messungen exportieren , um die Analyseergebnisse zu exportieren.
11. Klicken Sie auf Zell- und Bildmessungen und dann auf OK.
12. Wählen Sie auf der Seite Assistent zum Exportieren von Messungen - Schritt 1 die Platte aus und klicken Sie auf Weiter.
13. Klicken Sie auf der Seite Messassistent exportieren - Schritt 2 auf Fertig stellen.
14. Wählen Sie auf der Seite Datenexport konfigurieren die Datentypen aus (d. h. Well-Name, Gesamtzellennummer, Zwischensummen-Zellnummer für DAPI⁺, Zwischensummen-Zellnummer für Texas Red⁺, Zwischensummen-Zellnummer für FITC⁺, Zwischensummen-Zellnummer für DAPI⁺Texas Red⁺, Zwischensummen-Zellnummer für DAPI⁺FITC⁺, Zwischensummen-Zellzahl für DAPI⁺FITC⁺Texas Red⁺, Prozentsatz der DAPI⁺ -Zellen, Prozentsatz der DAPI⁺Texas Red⁺ -Zellen, Prozentsatz der DAPI⁺FITC⁺ -Zellen und Prozentsatz der DAPI⁺Texas Red⁺FITC⁺ -Zellen) und klicken Sie dann auf OK.
15. Wählen Sie auf der Seite Als Textdatei exportieren das Ziel aus, an dem die Datei gespeichert werden soll, und klicken Sie auf OK.
16. Öffnen Sie die Datei in Microsoft Excel. Die Ergebnisse werden von den einzelnen Standorten vorgestellt (Tabelle 2). Es gibt 36 Standorte pro Brunnen. Fassen Sie mit dem Analysewerkzeug Pivot-Tabelle die Daten der 36 Standorte zusammen (d. h. die Summen der Zellzahlen und die Durchschnittswerte des angegebenen Zellprozentsatzes an allen 36 Standorten) (Tabelle 3).

Ergebnisse

Nach Reprogrammierungsexperimenten haben wir iCMs mit Hilfe der High-Content-Imaging-Analyse, wie oben beschrieben, quantifiziert. In Abbildung 1 sind zusammengesetzte Bilder von 36 Bildgebungsstellen dargestellt, die für die High-Content-Bildgebungsanalyse verwendet wurden. iCMs werden in diesen Experimenten als doppelt-positive Zellen (α-Actinin⁺Titin-eGFP⁺) definiert. High-Content-Imaging-Analysen zeigen, dass ~26% der Zellen nach ...

Diskussion

In den vorangegangenen Reprogrammierungsstudien wurde die Reprogrammierungseffizienz mittels Durchflusszytometrie untersucht und die strukturelle Qualität von iCMs mittels Immunzytochemie in zwei separaten Experimenten nachgewiesen. Die Durchflusszytometrie-Analyse erfordert eine viel größere Anzahl von Startzellen, wodurch der Umfang der Experimente erhöht wird. Im Gegensatz dazu kann die High-Content-Imaging-Analyse sowohl die Qualität als auch die Quantität der iCM-Reprogrammier...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
anti-chicken Alexa 488	Thermofisher	A11039
anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262
anti-mouse Alexa 555	Thermofisher	A21422
anti-α-actinin antibody	Sigma	A7811
DAPI solution	Vector labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Insulin-Transferrin-SeleniumG supplement	Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM vitamin solution	Invitrogen	11120-052
MetaXpress software	Molecular device
Micro XL automated cell imagining system	Molecular device
Minimal essential amino acid solution	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
PES filter (0.45 µm)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E cells	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Universal blocking buffer	BiogeneX	HK083-50K