High Content Imaging Analysis를 사용한 심장 재프로그래밍 평가

요약

고함량 이미징 분석을 사용하여 in vitro에서 직접 재프로그래밍된 유도 심근세포 유사 세포(iCM)를 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 통해 자동화된 방식으로 심장 재프로그래밍의 효율성을 정량화하고 iCM을 직접 시각화할 수 있습니다.

초록

이 프로토콜의 목표는 재프로그래밍 기술에 의해 체외에서 직접 재프로그래밍되는 유도 심근세포 유사 세포(iCM)를 정량화하는 방법을 설명하는 것입니다. 심장 재프로그래밍은 새로운 심근세포를 생성하는 전략을 제공합니다. 섬유아세포에 핵심 심인성 전사 인자를 도입함으로써; 섬유아세포는 만능 줄기세포 상태를 거치지 않고 iCM으로 전환될 수 있습니다. 그러나 섬유아세포에서 iCM으로의 전환율은 여전히 낮습니다. 따라서 심장 재프로그래밍 효율성을 향상시키기 위한 수많은 추가 접근 방식이 있습니다. 이러한 연구의 대부분은 유세포 분석을 사용하여 심장 재프로그래밍 효율성을 평가하는 동시에 iCM을 시각화하기 위해 면역세포화학을 수행했습니다. 따라서 iCM 재프로그래밍의 성공을 입증하기 위해 적어도 두 개의 개별 재프로그래밍 실험 세트가 필요합니다. 대조적으로, 자동화된 High Content Imaging 분석은 상대적으로 적은 수의 세포로 iCM 재프로그래밍의 정량화와 적격성 평가를 모두 제공합니다. 이 방법을 사용하면 단일 재프로그래밍 실험으로 iCM의 양과 품질을 직접 평가할 수 있습니다. 이 접근 방식은 재프로그래밍 효율성을 높이기 위해 유전적 또는 약리학적 요인을 스크리닝하는 것과 같은 대규모 재프로그래밍 실험이 필요한 향후 심장 재프로그래밍 연구를 촉진할 수 있습니다. 또한 High Content Imaging Analysis 프로토콜의 적용은 심장 재프로그래밍에 국한되지 않습니다. 다른 세포 계통의 재프로그래밍뿐만 아니라 면역염색된 세포의 정량화와 시각화가 모두 필요한 모든 면역염색 실험에 적용할 수 있습니다.

서문

심장 재프로그래밍은 새로운 심근세포를 생성하기 위한 줄기세포 매개 접근법에 대한 대안적 접근법으로 개발되었습니다. 줄기세포 상태를 통해 전이되지 않는다는 점을 감안할 때, 줄기세포 매개 접근법에서 일부 유전적 한계를 우회할 수 있는 높은 잠재력을 가지고 있습니다. 섬유아세포에 적어도 3개 또는 4개의 심인성 전사 인자의 바이러스 감염은 섬유아세포 유전자 프로그램을 제거하고 섬유아세포에서 심인성 전사 네트워크를 재건함으로써 섬유아세포를 심장 운명으로 전환할 수 있는 것으로 나타났습니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10^, 11,12,13,14,15,16,17.

심장 재프로그래밍을 in vitro¹로 입증한 최초의 획기적인 연구 이후, 심장 재프로그래밍 프로토콜은 수많은 연구에 의해 최적화되었습니다 3,5,6,7,9,11,12,13,14,15,16,18 . 심장 재프로그래밍 후 섬유아세포의 심장 표현형을 평가하기 위한 일반적인 기술적 접근 방식은 특정 심근세포 마커를 발현하는 세포를 정량화하기 위한 유세포 분석과 단일 세포 수준에서 이러한 세포를 시각화하기 위한 면역세포화학(immunocytochemistry)입니다. 두 실험(즉, 유세포 분석 및 면역세포화학)은 동일한 항체를 사용하여 심근세포 마커의 발현을 입증하기 위한 것이지만 별도로 수행해야 합니다. 또한 유세포 분석에는 상대적으로 더 많은 수의 세포가 필요하므로 실험에 필요한 시약의 양이 증가합니다. 대안적으로, 심근세포 마커 양성 세포는 면역세포화학(immunocytochemistry)에 따른 수동 계수로 정량화할 수 있습니다. 그러나 매우 노동 집약적이며 정확도가 떨어지는 경향이 있습니다.

이 프로토콜의 목적은 자동화된 High Content Imaging 분석을 사용하여 단일 면역염색 실험으로 iCM을 정량화하고 시각화할 수 있는 방법을 설명하는 것입니다. 이 프로토콜은 24웰 플레이트의 웰에서 수행되기 때문에 상대적으로 적은 수의 시작 세포가 필요합니다. 최대 3개의 서로 다른 마커를 동시에 사용할 수 있습니다. 단일, 이중 및 삼중 양성 세포를 자동으로 정량화할 수 있습니다. 면역염색된 세포의 정량화 외에도 High Content Imaging 분석은 고품질 2-100x 대물렌즈 이미지를 제공합니다. 필요한 경우, High Content 이미징 분석에 사용된 것과 동일한 면역염색 세포를 컨포칼 현미경 검사와 같은 추가 이미징 연구에 재사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 훨씬 적은 수의 셀로 iCM의 편향되지 않은 정량화를 제공할 뿐만 아니라 iCM의 시각화를 제공한다는 것입니다. 또한, 이 프로토콜은 비심장 계통 재프로그래밍(예: iPSC, 뉴런 및 간세포 재프로그래밍)을 평가하는 데 활용될 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 시술은 밴더빌트 대학 의료 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 수행되었습니다.

1. 레트로바이러스 생성 및 체외 심장 재프로그래밍

1. 백금 E 세포 포화도가 70%–80%에 도달할 때까지 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1μg/mL 퓨로마이신 및 10μg/mL 블라스티시딘을 보충한 DMEM에서 백금 E 세포를 배양합니다.
2. 1일차에 ~0.55 x 10⁶ 세포(첫 번째 웰) 및 ~0.18 x 10⁶ 세포(두 번째 웰)를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 1mL의 DMEM이 함유된 12웰 플레이트의 별도 웰 2개에 첫 번째 트랜스펙션 하루 전에 시딩합니다.
   참고: 실험에 필요한 바이러스 배지의 양에 따라 다양한 크기의 배양 접시를 사용할 수 있습니다. 다른 실험 규모에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
3. 2일차에 이전 연구⁹ 에서 설명한 Mef2c, Gata4, Tbx5 및 Hand2를 인코딩하는 쿼드-시스트로닉 M-G-T-H 레트로바이러스 구조체를 형질주입하거나 빈 벡터를 첫 번째 웰의 백금 E 세포로 형질주입합니다. 3 μL의 transfection 시약을 30 μL의 감소된 혈청 배지에 추가합니다. 5분 후, 1μg의 레트로바이러스 구조체 또는 빈 벡터를 transfection 시약과 감소된 혈청 배지의 혼합물에 추가합니다. 실온에서 20분 동안 배양한 후 혼합물을 Platinum E cell에 첨가합니다.
4. 3일차, 형질주입 후 16-20시간 후에 배지를 제거하고 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 새로운 DMEM을 보충합니다.
5. 3일차에, 첫 번째 형질주입 후 24시간 후, 1.3단계에서 설명한 바와 같이 1일차에 백금 E 세포가 도말된 두 번째 웰로 2차 형질주입을 수행합니다.
6. 3일차에 Titin-GFP 리포터에서 분리된 ~5 x 10⁴ 냉동 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 24웰 플레이트의^{웰에 넉} 인합니다. 총 2개의 24웰 플레이트가 필요합니다(즉, 감염되지 않은 대조군 및 M-G-T-H 감염).
   참고: 동결된 MEF의 회수율은 세포 동결 조건에 따라 달라질 수 있으므로 도금된 MEF의 수를 조정해야 할 수 있습니다. 세포를 파종한 후 하루에 약 10%의 포화도는 재프로그래밍에 적합합니다. 재프로그래밍 효율성은 고정되지 않은 새로운 MEF를 사용하여 향상될 수 있습니다.
7. 4일차, 두 번째 형질주입 후 16-20시간 후에 배지를 제거하고 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 새로운 DMEM을 보충합니다.
8. 첫 번째 transfection 후 48시간 후인 4일차에 5mL 주사기를 사용하여 Platinum E cell의 첫 번째 well에서 바이러스 배지를 수집하고 0.45μm 폴리에테르설폰(PES) 멤브레인 필터를 통해 여과합니다. MEF에서 섬유아세포 성장 배지를 제거하고 6μg/mL(첫 번째 감염)에서 폴리브레렌이 보충된 바이러스 배지로 교체합니다.
9. 5일째, 두 번째 형질주입 후 48시간 후, 1.8단계에서 설명한 대로 두 번째 웰의 바이러스 배지를 사용하여 두 번째 감염을 수행합니다.
10. 두 번째 감염 후 24시간 후인 6일째에 바이러스 배지는 DMEM/199(4:1), 10% FBS, 5% 말 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산, 1% 필수 아미노산, 1% B-27, 1% 인슐린-셀레늄-트랜스페린, 1% 비타민 혼합물 및 1% 피루브산 나트륨, 1μM SB431542 및 0.5μm A83-01로 구성된 심장 유도 배지로 교체됩니다. 세포가 수확될 때까지 3일마다 심장 유도 배지를 교체하십시오.

2. 면역염색

1. 감염 후 14-15일째에 2% 파라포름알데히드가 함유된 24웰 플레이트에 세포를 15분 동안 고정합니다.
2. 투과화 완충액(PBS의 경우 0.05% Triton-X)으로 5분마다 투과화 완충액으로 세포를 3회 세척하여 고정된 세포를 투과화합니다.
3. universal blocking buffer로 세포를 45분 동안 배양합니다.
4. 마우스 α-액티닌(1:400 희석) 및 닭 GFP 항체(1:400 희석)로 실온에서 1.5시간 동안 세포를 배양합니다.
   참고: 약 150μL의 항체 용액이 24웰 플레이트의 웰 전체 영역을 덮을 수 있습니다.
5. 투과화 완충액으로 세포를 5분 동안 3회 세척합니다.
6. 항-마우스 Alexa-555 및 항-닭 Alexa-488 2차 항체(1:400 희석)로 세포를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
7. 투과화 완충액으로 세포를 5분 동안 3회 세척합니다.
8. 2.5μL의 DAPI 용액을 250μL의 투과화 완충액에 추가합니다.

3. 고함량 이미징

1. 이미징 시스템을 켭니다.
2. 연결된 소프트웨어를 엽니다.
3. 시스템에 로그인합니다.
4. 작업 표시줄에서 Run a Plate(플레이트 실행)를 선택합니다.
5. Open Door-Eject Plate를 클릭하여 기계의 도어를 열고 플레이트를 넣습니다. 플레이트가 올바른 방향에 있는지 확인하십시오. Close Door-Load Plate를 클릭하여 도어를 닫습니다.
6. Load Plate Settings를 클릭합니다. 템플릿 프로토콜을 선택한 다음 Load From DB를 클릭합니다.
7. Acquisition Setup(획득 설정)을 클릭합니다.
8. Plate Acquisition Setup 대화 상자에서 Configure를 클릭합니다.
9. Objective and Camera(목표 및 카메라) 탭에서 10x objective(10x 대물렌즈)를 선택합니다.
10. 플레이트 탭에서 24웰 플레이트를 선택합니다.
11. Site Options(사이트 옵션)의 Sites to Visit(방문해야 할 사이트) 탭에서 "Fixed number of sites(고정 사이트 수)"를 선택하고 열과 행에서 숫자를 선택하여 이미징 사이트의 수를 결정합니다. 총 36개의 이미징 부위를 열에 6개, 행에 6개를 선택하여 사용합니다. 각 이미징 부위 사이의 간격(즉, 500μm)을 선택합니다.
12. Acquisition 탭에서 파장 수를 3으로 설정합니다.
13. 조명의 파장 탭에서 각 파장에 대해 개별적으로 DAPI, FITC 또는 Texas Red를 선택합니다.
14. 실행 탭을 클릭한 다음 플레이트의 "폴더 이름" 및 "플레이트 이름"을 설정합니다.  이미징을 위해 플레이트 다이어그램에서 well을 클릭한 다음 Calculate(계산)를 클릭하여 각 파장에 대한 초점 오프셋을 설정합니다. 먼저 DAPI에 대한 foucs 오프셋을 설정합니다. Auto Expose를 클릭하여 각 파장에 대한 노출 시간을 자동으로 설정합니다. 그런 다음 Acquire Plate를 클릭하여 선택한 부위의 이미징을 시작합니다.

4. 고함량 이미징 분석

1. 고함량 이미징이 완료되면 스크리닝 메뉴를 클릭하고 Review Plate Data 를 선택하여 분석할 플레이트를 선택합니다.
2. Select Plate(플레이트 선택)를 클릭합니다. Select Plate for Review 대화 상자에서 폴더를 열고 데이터베이스에 저장된 플레이트를 선택한 다음 Select를 클릭합니다.
   참고: 이미지를 표시하려면 파장 필드에서 DAPI, FITC 및 Texas Red를 선택합니다. 사이트 입력란에서 모든 사이트를 선택합니다. 선택한 36개 사이트 중 사이트를 클릭하여 각 파장 이미지 창에 표시한 다음 Look-Up Table을 클릭하여 파장의 색상을 선택합니다. 키보드의 Print Screen 키를 사용하여 사진 편집 소프트웨어(예: Paint 및 Photoshop)에 이미지를 붙여넣어 저장합니다.
3. Run Analysis(분석 실행)를 클릭하고 템플릿 설정을 선택합니다.
4. Configure Settings(설정 구성)를 클릭한 다음 Number of Wavelengths(파장 수)를 클릭합니다. 3개의 파장(즉, 핵 염색을 위한 DAPI, α-actinin을 위한 Teaxs Red, Titin-GFP를 위한 FITC)을 선택합니다.
5. 도구 모음의 Line 도구를 사용하여 셀의 짧은 축에 걸친 너비를 측정합니다. 측정된 셀 너비를 기반으로 "Approximate min width(대략적인 최소 너비)" 및 "Approximate max width(대략적인 최대 너비)"를 설정하여 선택한 이미징 부위에 있는 대부분의 세포를 포함합니다.
6. 미리보기를 클릭하여 거의 모든 핵이 선택되었는지 확인합니다. 선택된 핵은 흰색을 나타내는 반면 선택되지 않은 핵은 파란색(DAPI 염색)으로 유지됩니다. 필요한 경우 "Approximate min width" 및 "Approximate max width"를 조정합니다.
7. Intensity Above Local Background를 설정하려면 셀 내부와 외부에 마우스 커서를 놓습니다. intensity 값이 창 아래쪽에 나타납니다. 어두운 셀의 강도를 약간 줄여 각 셀의 전체 영역에 걸쳐 강도를 고르게 표시합니다. 이 강도 값을 Intensity Above Local Background 값으로 정의합니다. 이 값은 각 채널에 대해 별도로 설정해야 합니다.
8. 스크리닝 메뉴를 클릭하고 Plate Data Utilities를 선택합니다. Plate Data Utilities 대화 상자에서 Run Analysis를 클릭하여 플레이트를 선택합니다.
9. Settings 필드에서 분석을 위해 저장된 설정을 선택합니다. Add to Auto Run List(자동 실행 목록에 추가)를 선택한 다음 OK(확인)를 클릭하여 분석을 실행합니다.
10. 분석이 완료되면 스크리닝 메뉴를 클릭하고 플레이트 데이터 유틸리티를 선택합니다. 그런 다음 Plate Data Utilities 대화 상자에서 Export Measurements 를 클릭하여 해석 결과를 내보냅니다.
11. Cell and Image Measurements(셀 및 이미지 측정)를 클릭한 다음 OK(확인)를 클릭합니다.
12. Export Measurements Wizard - Step 1 페이지에서 플레이트를 선택하고 Next를 클릭합니다.
13. Export Measurements Wizard - Step 2 페이지에서 Finish를 클릭합니다.
14. Configure Data Export(데이터 내보내기 구성) 페이지에서 데이터 유형(예: 웰 이름, 총 셀 번호, DAPI⁺의 소계 셀 번호, Texas Red⁺의 소계 셀 번호, FITC⁺의 소계 셀 번호, DAPI⁺Texas Red⁺의 소계 셀 번호, DAPI⁺FITC⁺의 소계 셀 번호, DAPI⁺FITC⁺Texas Red⁺의 소계 셀 번호, DAPI⁺ 셀의 백분율, DAPI⁺Texas Red⁺ 세포의 백분율, DAPI⁺FITC⁺ 세포의 백분율 및 DAPI⁺Texas Red⁺FITC⁺ 세포의 백분율)을 클릭한 다음 확인을 클릭합니다.
15. Export as text file(텍스트 파일로 내보내기) 페이지에서 파일을 저장할 대상을 선택하고 OK(확인)를 클릭합니다.
16. Microsoft Excel에서 파일을 엽니다. 결과는 각 사이트에서 제시됩니다(표 2). 유정당 36개의 사이트가 있습니다. 분석 도구인 Pivot Table을 사용하여 36개 사이트의 데이터(즉, 36개 사이트 모두에서 표시된 셀 비율의 합계 및 평균)를 요약합니다(표 3).

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결과

재프로그래밍 실험에 이어 위에서 설명한 대로 고함량 이미징 분석을 사용하여 iCM을 정량화했습니다. High Content 이미징 분석에 사용된 36개 이미징 부위의 복합 이미지가 그림 1에 나와 있습니다. iCM은 이러한 실험에서 이중 양성 세포(α-actinin⁺Titin-eGFP⁺)로 정의됩니다. High Content Imaging 분석에 따르면 M-G-T-H 형질도입 후 세포의 ~26%가 두...

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토론

이전의 리프로그래밍(reprogramming) 연구에서는 유세포분석을 사용하여 리프로그래밍(reprogramming) 효율을 평가하고 두 개의 별도 실험에서 면역세포화학(immunocytochemistry)을 사용하여 iCM의 구조적 품질을 입증했습니다. 유세포 분석에는 훨씬 더 많은 수의 시작 세포가 필요하므로 실험 규모가 커집니다. 대조적으로, High Content Imaging 분석은 상대적으로 적은 수의 세포를 사용한...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
anti-chicken Alexa 488	Thermofisher	A11039
anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262
anti-mouse Alexa 555	Thermofisher	A21422
anti-α-actinin antibody	Sigma	A7811
DAPI solution	Vector labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Insulin-Transferrin-SeleniumG supplement	Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM vitamin solution	Invitrogen	11120-052
MetaXpress software	Molecular device
Micro XL automated cell imagining system	Molecular device
Minimal essential amino acid solution	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
PES filter (0.45 µm)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E cells	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Universal blocking buffer	BiogeneX	HK083-50K