ハイコンテントイメージング解析を用いた心臓リプログラミングの評価

要約

ハイコンテントイメージング解析を使用して、in vitroで直接再プログラムされた誘導心筋細胞様細胞(iCM)を定量するプロトコルを提示します。この方法により、心臓のリプログラミングの効率を自動的に定量化し、iCMを直接可視化することができます。

要約

このプロトコルの目標は、リプログラミング技術によってin vitroで直接再プログラムされる誘導心筋細胞様細胞(iCM)を定量化する方法を説明することです。心臓のリプログラミングは、新しい心筋細胞を生成するための戦略を提供します。コア心原性転写因子を線維芽細胞に導入することにより。線維芽細胞は、多能性幹細胞の状態を遷移することなくiCMに変換することができます。しかし、線維芽細胞からiCMへの変換率は依然として低いままです。したがって、心臓のリプログラミング効率を高めるための多くの追加のアプローチがあります。これらの研究のほとんどは、フローサイトメトリーを使用して心臓のリプログラミング効率を評価すると同時に、免疫細胞化学を実行してiCMを視覚化しました。したがって、iCMのリプログラミングの成功を実証するには、少なくとも2つの別々のリプログラミング実験セットが必要です。対照的に、自動化されたハイコンテントイメージング解析では、比較的少数の細胞でiCMリプログラミングの定量化と適格性評価の両方を行うことができます。この手法では、1回のリプログラミング実験でiCMの量と質を直接評価することが可能です。このアプローチにより、リプログラミング効率を高めるための遺伝的要因や薬理学的要因のスクリーニングなど、大規模なリプログラミング実験を必要とする将来の心臓リプログラミング研究を促進することができます。さらに、ハイコンテントイメージング解析プロトコルの適用は、心臓のリプログラミングに限定されません。これは、他の細胞系譜のリプログラミングや、免疫染色細胞の定量化と可視化の両方を必要とする免疫染色実験にも適用できます。

概要

心臓リプログラミングは、幹細胞を介したアプローチに代わるアプローチとして開発され、新しい心筋細胞を作製しています。幹細胞の状態に移行しないことを考えると、幹細胞を介したアプローチにおけるいくつかの遺伝的制限を回避する可能性が高くなります。少なくとも3つまたは4つの心原性転写因子がウイルス感染すると、線維芽細胞遺伝子プログラムを排除し、線維芽細胞の心原性転写ネットワークを再構築することにより、線維芽細胞を心臓の運命に変換できることが示されています1,2,3,4,5,6,7,8,9,10^{、11、12、13、14、15、16、17}。

in vitro¹で心臓のリプログラミングを実証した最初の画期的な研究以来、心臓のリプログラミングプロトコルは、数多くの研究によって最適化されてきました3,5,6,7,9,11,12,13,14,15,16,18 .心臓のリプログラミング後の線維芽細胞の心表現型を評価するための一般的な技術的アプローチは、特定の心筋細胞マーカーを発現する細胞を定量化するためのフローサイトメトリー分析と、それらの細胞を単一細胞レベルで視覚化するための免疫細胞化学です。フローサイトメトリーと免疫細胞化学の2つの実験は、同じ抗体を用いて心筋細胞マーカーの発現を実証するためのものですが、別々に行う必要があります。さらに、フローサイトメトリーは比較的多くの細胞を必要とするため、実験に必要な試薬の量が増加します。あるいは、心筋細胞マーカー陽性細胞は、免疫細胞化学に続く手動カウントによって定量化できます。ただし、非常に手間がかかり、精度が低下する傾向があります。

このプロトコールの目的は、自動化されたハイコンテントイメージング解析を使用して、単一の免疫染色実験でiCMを定量および視覚化できる方法を説明することです。このプロトコルは24ウェルプレートのウェルで行われるため、比較的少数の開始細胞が必要です。同時に使用できるマーカーは3種類までです。シングル、ダブル、トリプルポジティブセルは自動的に定量化できます。免疫染色細胞の定量に加えて、ハイコンテントイメージング解析により、高品質の2-100倍の対物画像が得られます。必要に応じて、ハイコンテントイメージング解析で使用したのと同じ免疫染色細胞を、共焦点顕微鏡などのさらなるイメージング研究に再利用することができます。このプロトコルの主な利点は、はるかに少ない細胞数でiCMを偏りなく定量するだけでなく、iCMの可視化も提供することです。さらに、このプロトコルは、非心臓系譜のリプログラミング(例えば、iPSC、ニューロン、および肝細胞のリプログラミング)の評価に利用することができる。

プロトコル

すべての動物処置は、ヴァンダービルト大学医療センターの施設内動物管理および使用委員会の承認を得て行われました。

1. レトロウイルスの作製とin vitro心臓リプログラミング

1. Platinum E細胞をDMEMで培養し、10% FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1 μg/mLピューロマイシン、および10 μg/mLブラストシジンを添加して、Platinum E細胞の密度が70%〜80%に達するまで培養します。
2. 1日目に、最初のトランスフェクションの前日に、~0.55 x 10⁶ 細胞(ファーストウェル)と~0.18 x 10⁶ セル(セカンドウェル)を12ウェルプレートの2つの別々のウェルに播種し、10% FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した1mLのDMEMを添加します。
   注:実験に必要なウイルス培地の量に応じて、異なるサイズの培養皿を使用することができます。実験の他の尺度については、 表1 を参照してください。
3. 2日目に、前の研究⁹ または空のベクターに記載されているMef2c、Gata4、Tbx5、およびHand2をコードするクワッドシストロニックM-G-T-Hレトロウイルスコンストラクトを最初のウェルのプラチナE細胞にトランスフェクションします。3 μLのトランスフェクション試薬を30 μLの還元血清培地に加えます。5分後、1 μgのレトロウイルスコンストラクトまたは空のベクターをトランスフェクション試薬と還元血清培地の混合物に加えます。室温で20分間インキュベートした後、混合物をPlatinum E細胞に加えます。
4. トランスフェクションの3日目、16〜20時間後に培地を取り出し、10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した新鮮なDMEMを補充します。
5. 3日目、最初のトランスフェクションの24時間後に、ステップ1.3で説明したように、1日目にPlatinum E細胞を播種した2番目のウェルへの2回目のトランスフェクションを行います。
6. 3日目に、Titin-GFPレポーターノックインマウス¹⁹から単離された~5 x 10⁴凍結マウス胚性線維芽細胞(MEFs)を24ウェルプレートのウェルに播種します。24ウェルプレートの合計2ウェルが必要です(すなわち、非感染コントロールとMG-T-H感染)。
   注:凍結したMEFの回収率は細胞の凍結条件によって異なる可能性があるため、めっきされるMEFの数を調整する必要がある場合があります。細胞を播種した翌日の約10%のコンフルエントは、リプログラミングに十分です。再プログラミングの効率は、凍結されていない新鮮なMEFを使用して向上させることができます。
7. 4日目、2回目のトランスフェクションから16〜20時間後に培地を取り出し、10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した新鮮なDMEMを補充します。
8. 最初のトランスフェクションから48時間後の4日目に、5 mLシリンジを使用してPlatinum E細胞の最初のウェルでウイルス培地を回収し、0.45 μmポリエーテルスルホン(PES)メンブレンフィルターでろ過します。MEF上の線維芽細胞増殖培地を取り出し、ポリブレンを6 μg/mLで補充したウイルス培地と交換します(初回感染)。
9. 5日目、2回目のトランスフェクションの48時間後に、ステップ1.8で説明したように、2番目のウェル内のウイルス培地を使用して2回目の感染を行います。
10. 2回目の感染から24時間後の6日目に、ウイルス培地はDMEM/199(4:1)、10%FBS、5%ウマ血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%非必須アミノ酸、1%必須アミノ酸、1%B-27、1%インスリン-セレントランスフェリン、1%ビタミン混合物、および1%ピルビン酸ナトリウム、1μM SB431542、および0.5μmA83-01。細胞が回収されるまで、3日ごとに心臓誘導培地を交換してください。

2. 免疫染色

1. 感染後14〜15日で、細胞を2%パラホルムアルデヒドを含む24ウェルプレートに15分間固定します。
2. 固定した細胞を透過化バッファー(PBS中の0.05% Triton-X)で透過処理バッファーで5分ごとに3回洗浄し、透過処理します。
3. 細胞をユニバーサルブロッキングバッファーで45分間インキュベートします。
4. マウスのα-アクチニン(1:400希釈)およびニワトリGFP抗体(1:400希釈)と室温で1.5時間インキュベートします。
   注:約150 μLの抗体溶液で、24ウェルプレートのウェルの全領域をカバーできます。
5. 細胞を透過化バッファーで5分間3回洗浄します。
6. 抗マウスAlexa-555および抗ニワトリAlexa-488二次抗体(希釈率1:400)と室温で1時間細胞をインキュベートします
7. 細胞を透過化バッファーで5分間3回洗浄します。
8. 2.5 μLのDAPI溶液を250 μLの透過化バッファーに加えます。

3. ハイコンテントイメージング

1. イメージングシステムの電源を入れます。
2. 関連付けられたソフトウェアを開きます。
3. システムにログインします。
4. タスクバーで、[ プレートの実行] を選択します。
5. Open Door-Eject Plateをクリックして、機械のドアを開き、プレートを挿入します。プレートが正しい方向を向いていることを確認してください。Close Door-Load Plateをクリックしてドアを閉じます。
6. Load Plate Settingsをクリックします。テンプレートプロトコルを選択し、[Load From DB] をクリックします。
7. [Acquisition Setup] をクリックします。
8. 「Plate Acquisition Setup」ダイアログで、「Configure」をクリックします。
9. [対物レンズとカメラ] タブで、[10x 対物レンズ] を選択します。
10. [プレート]タブで、24ウェルプレートを選択します。
11. [Site Options] の [Sites to Visit] タブで、[Fixed number of sites] を選択し、列と行の数を選択してイメージングサイトの数を決定します。列に6つ、行に6つを選択することで、合計36のイメージングサイトが使用されます。各イメージング部位間の間隔(500μm)を選択します。
12. [Acquisition (取得)] タブで、波長の数を 3 に設定します。
13. [照明] の [波長] タブで、波長ごとに DAPI、FITC、または Texas Red を個別に選択します。
14. [実行]タブをクリックし、プレートの「フォルダ名」と「プレート名」を設定します。 プレート図のウェルをクリックしてイメージングし、次に[計算]をクリックして各波長のフォーカスオフセットを設定します。最初にDAPIのfoucsオフセットを設定します。[自動露出]をクリックして、各波長の露光時間を自動的に設定します。次に、[Acquire Plate]をクリックして、選択した部位のイメージングを開始します。

4. ハイコンテントイメージングの解析

1. ハイコンテントイメージングが完了したら、 スクリーニング メニューをクリックし、 Review Plate Data を選択して解析用のプレートを選択します。
2. Select Plateをクリックします。Select Plate for Reviewダイアログで、フォルダを開き、データベースに保存されているプレートを選択してから、Selectをクリックします。
   注:画像を表示するには、[波長]フィールドで[DAPI]、[FITC]、および[Texas Red]を選択します。[サイト] フィールドで、[すべてのサイト] を選択します。選択した36サイトの中からサイトをクリックして各波長画像ウィンドウに表示し、ルックアップテーブルをクリックして波長の色を選択します。キーボードのPrintScreenキーを使用し、画像を写真編集ソフトウェア(ペイントやPhotoshopなど)に貼り付けて保存します。
3. [分析の実行] をクリックし、テンプレート設定を選択します。
4. [Configure Settings] をクリックし、[Number of Wavelengths] をクリックします。3つの波長を選択します(核染色にはDAPI、α-アクチニンにはTeaxs Red、Titin-GFPにはFITC)。
5. ツールバーの 線 ツールを使用して、セルの短軸の幅を測定します。測定した細胞の幅に基づいて、「Approximate min width」と「Approximate max width」を設定して、選択したイメージング部位のほとんどの細胞を含めます。
6. 「プレビュー」をクリックして、ほぼすべての原子核が選択されているかどうかを確認します。選択された核は白色を示しますが、選択されなかった核は青色のままです(DAPI染色)。必要に応じて、「最小幅の概算」と「最大幅の概算」を調整してください。
7. [ローカル背景の上の強度] を設定するには、セルの内側と外側にマウス カーソルを置きます。強度値はウィンドウの下部に表示されます。薄暗いセルの強度をわずかに下げて、各セルの全領域にわたって強度を均等に示します。この強度値を[ローカル背景の上の強度]の値として定義します。この値は、チャネルごとに個別に設定する必要があります。
8. スクリーニングメニューをクリックし、プレートデータユーティリティを選択します。[プレートデータユーティリティ]ダイアログで、[解析の実行]をクリックしてプレートを選択します。
9. [設定] フィールドで、分析用に保存した設定を選択します。[自動実行リストに追加]を選択し、[OK]をクリックして解析を実行します。
10. 分析が完了したら、 スクリーニング メニューをクリックし、 プレートデータユーティリティを選択します。次に、[ プレートデータユーティリティ ]ダイアログで、[ 測定値のエクスポート ]をクリックして解析結果をエクスポートします。
11. 「Cell and Image Measurements」をクリックし、「OK」をクリックします。
12. Export Measurements Wizard - Step 1 ページで、プレートを選択し、Next をクリックします。
13. 「Export Measurements Wizard - Step 2」ページで、「Finish」をクリックします。
14. [ データ エクスポートの構成 ] ページで、データ タイプ (ウェル名、合計セル番号、DAPI⁺ の小計セル番号、Texas Red⁺ の小計セル番号、FITC⁺ の小計セル番号、DAPI⁺Texas Red⁺ の小計セル番号、DAPI⁺FITC⁺ の小計セル番号、DAPI⁺FITC⁺Texas Red⁺ の小計セル番号、DAPI⁺ セルの割合) を選択します。 DAPI ⁺ Texas Red ⁺ セルの割合、DAPI ⁺ FIT ⁺ セルの割合、およびDAPI ⁺ Texas Red ⁺ FITC⁺ セルの割合)をクリックし、[ OK]をクリックします。
15. [ テキストファイルとしてエクスポート ]ページで、ファイルの保存先を選択し、[ OK]をクリックします。
16. Microsoft Excel でファイルを開きます。結果は各施設ごとに発表されます(表2)。井戸ごとに36のサイトがあります。分析ツールである ピボットテーブルを使用して、36のサイトのデータ(つまり、36のサイトすべてのセル番号と指定されたセルパーセンテージの平均の合計)を要約します(表3)。

結果

リプログラミング実験に続いて、上記のようにハイコンテントイメージング分析を使用してiCMを定量しました。ハイコンテントイメージング解析に使用した36のイメージング部位の合成画像を 図1に示します。これらの実験では、iCMはダブルポジティブ細胞(α-アクチニン⁺Titin-eGFP⁺)と定義されています。ハイコンテントイメージ?...

ディスカッション

これまでのリプログラミング研究では、フローサイトメトリーを用いてリプログラミング効率を評価し、免疫細胞化学を用いて2つの別々の実験でiCMの構造品質を実証しました。フローサイトメトリー解析では、はるかに多くの開始細胞が必要になるため、実験の規模が大きくなります。これに対し、ハイコンテントイメージング解析では、比較的少数の細胞を用い?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
anti-chicken Alexa 488	Thermofisher	A11039
anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262
anti-mouse Alexa 555	Thermofisher	A21422
anti-α-actinin antibody	Sigma	A7811
DAPI solution	Vector labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Insulin-Transferrin-SeleniumG supplement	Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM vitamin solution	Invitrogen	11120-052
MetaXpress software	Molecular device
Micro XL automated cell imagining system	Molecular device
Minimal essential amino acid solution	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
PES filter (0.45 µm)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E cells	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Universal blocking buffer	BiogeneX	HK083-50K