Valutazione della riprogrammazione cardiaca mediante l'analisi di imaging ad alto contenuto

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per quantificare le cellule simili ai cardiomiociti indotte (iCM) direttamente riprogrammate in vitro utilizzando l'analisi di imaging ad alto contenuto. Questo metodo ci permette di quantificare l'efficienza della riprogrammazione cardiaca in modo automatizzato e di visualizzare direttamente le iCM.

Abstract

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un metodo per quantificare le cellule indotte simili ai cardiomiociti (iCM), che vengono direttamente riprogrammate in vitro mediante una tecnica di riprogrammazione. La riprogrammazione cardiaca fornisce una strategia per generare nuovi cardiomiociti. Introducendo fattori di trascrizione cardiogeni core nei fibroblasti; i fibroblasti possono essere convertiti in iCM senza transizione attraverso lo stato di cellula staminale pluripotente. Tuttavia, il tasso di conversione dei fibroblasti in iCM rimane ancora basso. Di conseguenza, sono stati adottati numerosi approcci aggiuntivi per migliorare l'efficienza della riprogrammazione cardiaca. La maggior parte di questi studi ha valutato l'efficienza della riprogrammazione cardiaca utilizzando la citometria a flusso, mentre allo stesso tempo ha eseguito l'immunocitochimica per visualizzare le iCM. Pertanto, sono necessari almeno due set separati di esperimenti di riprogrammazione per dimostrare il successo della riprogrammazione iCM. Al contrario, l'analisi automatizzata dell'imaging ad alto contenuto fornirà sia la quantificazione che la qualificazione della riprogrammazione iCM con un numero relativamente piccolo di cellule. Con questo metodo, è possibile valutare direttamente la quantità e la qualità degli iCM con un unico esperimento di riprogrammazione. Questo approccio sarà in grado di facilitare futuri studi di riprogrammazione cardiaca che richiedono esperimenti di riprogrammazione su larga scala come lo screening di fattori genetici o farmacologici per migliorare l'efficienza della riprogrammazione. Inoltre, l'applicazione del protocollo di analisi dell'imaging ad alto contenuto non si limita alla riprogrammazione cardiaca. Può essere applicato alla riprogrammazione di altre linee cellulari e a qualsiasi esperimento di immunocolorazione che richieda sia la quantificazione che la visualizzazione di cellule immunocolorate.

Introduzione

La riprogrammazione cardiaca è stata sviluppata come approccio alternativo agli approcci mediati dalle cellule staminali per generare nuovi cardiomiociti. Dato che non passa attraverso lo stato di cellula staminale, ha un alto potenziale per aggirare alcune limitazioni ereditarie negli approcci mediati dalle cellule staminali. È stato dimostrato che l'infezione virale di almeno tre o quattro fattori di trascrizione cardiogeni nei fibroblasti può convertire i fibroblasti verso un destino cardiaco eliminando i programmi genici dei fibroblasti e ricostruendo le reti trascrizionali cardiogene nei fibroblasti 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10^, 11,12,13,14,15,16,17.

Dal primo studio di riferimento che dimostra la riprogrammazione cardiaca in vitro¹, il protocollo di riprogrammazione cardiaca è stato ottimizzato da numerosi studi 3,5,6,7,9,11,12,13,14,15,16,18 . Gli approcci tecnici comuni per valutare i fenotipi cardiaci nei fibroblasti dopo la riprogrammazione cardiaca sono stati l'analisi della citometria a flusso per quantificare le cellule che esprimono specifici marcatori cardiomiocitari e l'immunocitochimica per visualizzare tali cellule a livello di singola cellula. Sebbene entrambi gli esperimenti (ad esempio, citometria a flusso e immunocitochimica) debbano dimostrare l'espressione di marcatori cardiomiocitari utilizzando gli stessi anticorpi, devono essere eseguiti separatamente. Inoltre, la citometria a flusso richiede un numero relativamente maggiore di cellule, aumentando così la quantità di reagenti necessari per l'esperimento. In alternativa, le cellule positive ai marcatori dei cardiomiociti possono essere quantificate mediante conteggio manuale dopo immunocitochimica. Tuttavia, è molto laborioso e tende ad essere meno accurato.

Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere il metodo in grado di quantificare e visualizzare le iCM mediante un singolo esperimento di immunocolorazione utilizzando l'analisi automatizzata di imaging ad alto contenuto. Richiede un numero relativamente piccolo di cellule di partenza perché questo protocollo viene eseguito in un pozzetto di piastra a 24 pozzetti. È possibile utilizzare fino a tre marcatori diversi contemporaneamente. Le celle singole, doppie e triple positive possono essere quantificate automaticamente. Oltre alla quantificazione delle cellule immunocolorate, l'analisi di imaging ad alto contenuto fornisce immagini oggettive di alta qualità da 2 a 100x. Se necessario, le stesse cellule immunocolorate utilizzate nell'analisi di imaging ad alto contenuto possono essere riutilizzate per ulteriori studi di imaging, come la microscopia confocale. Il vantaggio principale di questo protocollo è che fornisce non solo una quantificazione imparziale di iCM con un numero molto più piccolo di cellule, ma anche la visualizzazione di iCM. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per valutare la riprogrammazione del lignaggio non cardiaco (ad esempio, iPSC, riprogrammazione di neuroni ed epatociti).

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali del Vanderbilt University Medical Center.

1. Generazione di retrovirus e riprogrammazione cardiaca in vitro

1. Colture di cellule E di platino in DMEM integrate con il 10% di FBS, l'1% di penicillina/streptomicina, 1 μg/mL di puromicina e 10 μg/mL di blasticidina fino a quando la confluenza delle cellule E di platino raggiunge il 70%-80%.
2. Il giorno 1, seminare ~0,55 x 10⁶ cellule (primo pozzetto) e ~0,18 x 10⁶ cellule (secondo pozzetto) in due pozzetti separati di piastra a 12 pozzetti con 1 mL di DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina un giorno prima della prima trasfezione.
   NOTA: È possibile utilizzare piastre di coltura di diverse dimensioni a seconda della quantità di terreno virale necessaria per gli esperimenti. Fare riferimento alla Tabella 1 per altre scale di esperimenti.
3. Il giorno 2, trasfettare il costrutto retrovirale quad-cistronico M-G-T-H codificante Mef2c, Gata4, Tbx5 e Hand2 descritto nel precedente studio⁹ o il vettore vuoto nelle cellule E di platino del primo pozzetto. Aggiungere 3 μL di reagente di trasfezione a 30 μL di terreno sierico ridotto. Cinque minuti dopo, aggiungere 1 μg di costrutto retrovirale o il vettore vuoto nella miscela di reagente di trasfezione e terreno sierico ridotto. Dopo 20 minuti di incubazione a temperatura ambiente, aggiungere la miscela alle cellule Platinum E.
4. Il giorno 3, 16-20 ore dopo la trasfezione, rimuovere il terreno e reintegrare il DMEM fresco integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina.
5. Il giorno 3, 24 ore dopo la prima trasfezione, eseguire la seconda trasfezione nel secondo pozzetto in cui le cellule di platino E sono state piastrate il giorno 1 come descritto al punto 1.3).
6. Il giorno 3, seminare ~5 x 10⁴ fibroblasti embrionali di topo congelati (MEF) isolati da topi reporter Titin-GFP knock-in¹⁹ in un pozzetto di piastra a 24 pozzetti. Sono necessari un totale di due pozzetti di piastra a 24 pozzetti (cioè controllo non infetto e infezione da MGT-H).
   NOTA: potrebbe essere necessario regolare il numero di MEF placcati, poiché il tasso di recupero dei MEF congelati può variare a seconda delle condizioni di congelamento delle cellule. Circa il 10% di confluenza al giorno dopo la semina delle cellule è sufficiente per la riprogrammazione. L'efficienza della riprogrammazione potrebbe essere migliorata utilizzando MEF freschi e non congelati.
7. Il giorno 4, 16-20 ore dopo la seconda trasfezione, rimuovere il terreno e reintegrare il DMEM fresco integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina.
8. Il giorno 4, 48 ore dopo la prima trasfezione, raccogliere i terreni virali nel primo pozzetto di cellule E di platino utilizzando una siringa da 5 ml e filtrarli attraverso un filtro a membrana in polietersulfone (PES) da 0,45 μm. Rimuovere i terreni di crescita dei fibroblasti sui MEF e sostituirli con i terreni virali integrati con polibrene a 6 μg/mL (prima infezione).
9. Il giorno 5, 48 ore dopo la seconda trasfezione, eseguire la seconda infezione utilizzando il terreno virale nel secondo pozzetto come descritto nella fase 1.8).
10. Il giorno 6, 24 ore dopo la seconda infezione, i terreni virali vengono sostituiti con terreni di induzione cardiaca composti da DMEM/199 (4:1), 10% FBS, 5% siero di cavallo, 1% penicillina/streptomicina, 1% aminoacidi non essenziali, 1% aminoacidi essenziali, 1% B-27, 1% insulina-selenio-transferrina, 1% miscela vitaminica e 1% piruvato di sodio, 1 μM SB431542 e 0,5 μm A83-01. Cambiare il terreno di induzione cardiaca ogni tre giorni fino a quando le cellule non vengono raccolte.

2. Immunocolorazione

1. A 14-15 giorni dall'infezione, fissare le cellule su una piastra a 24 pozzetti con paraformaldeide al 2% per 15 minuti.
2. Permeabilizzare le cellule fissate con un tampone di permeabilizzazione (0,05% Triton-X in PBS) lavando le cellule tre volte con un tampone di permeabilizzazione ogni 5 minuti.
3. Incubare le cellule con il tampone bloccante universale per 45 minuti.
4. Incubare le cellule con α-actinina di topo (diluizione 1:400) e anticorpi GFP di pollo (diluizione 1:400) per 1,5 ore a temperatura ambiente.
   NOTA: Circa 150 μL di soluzione anticorpale possono coprire l'intera area di un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
5. Lavare le celle con tampone di permeabilizzazione per 5 minuti tre volte.
6. Incubare le cellule con anticorpi secondari anti-topo Alexa-555 e anti-pollo Alexa-488 (diluizione 1:400) per 1 ora a temperatura ambiente
7. Lavare le celle con tampone di permeabilizzazione per 5 minuti tre volte.
8. Aggiungere 2,5 μl di soluzione DAPI in 250 μl di tampone di permeabilizzazione.

3. Imaging ad alto contenuto

1. Accendere il sistema di imaging.
2. Aprire il software associato.
3. Accedere al sistema.
4. Sulla barra delle applicazioni, seleziona Esegui una piastra.
5. Fare clic su Apri piastra di espulsione porta per aprire la porta sulla macchina e inserire la piastra. Assicurati che la piastra sia nella giusta direzione. Fare clic su Chiudi porta-Piastra di carico per chiudere la porta.
6. Fare clic su Impostazioni piastra di carico. Selezionare un protocollo modello, quindi fare clic su Carica da DB.
7. Fare clic su Configurazione acquisizione.
8. Nella finestra di dialogo Configurazione acquisizione lastre , fare clic su Configura.
9. Nella scheda Obiettivo e fotocamera , seleziona l'obiettivo 10x.
10. Nella scheda Piastra selezionare una piastra a 24 pozzetti.
11. Nella scheda Siti da visitare in Opzioni sito, scegliere "Numero fisso di siti" per determinare il numero di siti di imaging scegliendo il numero in colonne e righe. Vengono utilizzati un totale di 36 siti di imaging selezionandone 6 in colonne e 6 in righe. Selezionare la spaziatura tra ciascun sito di imaging (ad esempio, 500 μm).
12. Nella scheda Acquisizione , impostare il numero di lunghezze d'onda su 3.
13. Nella scheda Lunghezze d'onda su Illuminazione, selezionare DAPI, FITC o Texas Red per ciascuna lunghezza d'onda separatamente.
14. Fare clic sulla scheda Esegui e quindi impostare il "Nome cartella" e il "Nome piastra" per la targa.  Fare clic sui pozzetti sul diagramma della piastra per l'imaging e quindi su Calcola per impostare l'offset di messa a fuoco per ciascuna lunghezza d'onda. Impostare prima l'offset foucs per DAPI. Fare clic su Esposizione automatica per impostare automaticamente il tempo di esposizione per ciascuna lunghezza d'onda. Quindi, fare clic su Acquisisci piastra per avviare l'imaging dei siti selezionati.

4. Analisi dell'imaging ad alto contenuto

1. Una volta completato l'imaging ad alto contenuto, fare clic sul menu Screening e selezionare Rivedi dati piastra per selezionare una piastra per l'analisi.
2. Fare clic su Seleziona piastra. Nella finestra di dialogo Seleziona targa per revisione , aprire la cartella e selezionare la targa salvata nel database, quindi fare clic su Seleziona.
   NOTA: Per visualizzare le immagini, selezionare DAPI, FITC e Texas Red nel campo Lunghezze d'onda . Nel campo Siti , seleziona Tutti i siti. Fare clic su un sito tra i 36 siti selezionati per visualizzarlo in ciascuna finestra dell'immagine della lunghezza d'onda, quindi fare clic su Tabella di ricerca per selezionare un colore per la lunghezza d'onda. Usa il tasto Stampa schermo sulla tastiera e incolla l'immagine in un software di fotoritocco (ad esempio, Paint e Photoshop) per salvarla.
3. Fare clic su Esegui analisi e selezionare un'impostazione del modello.
4. Fare clic su Configura impostazioni e quindi su Numero di lunghezze d'onda. Selezionare tre lunghezze d'onda (ad esempio, DAPI per la colorazione dei nuclei, Teaxs Red per la α-actinina e FITC per Titin-GFP).
5. Utilizzando lo strumento Linea nella barra degli strumenti, misurare la larghezza lungo l'asse corto di una cella. In base alle larghezze misurate delle celle, impostare "Larghezza minima approssimativa" e "Larghezza massima approssimativa" per includere la maggior parte delle celle nel sito di imaging selezionato.
6. Fare clic su Anteprima per verificare se sono selezionati quasi tutti i nuclei. I nuclei selezionati mostrano un colore bianco, mentre i nuclei non selezionati rimangono blu (colorati DAPI). Se necessario, effettuare le regolazioni per "Larghezza minima approssimativa" e "Larghezza massima approssimativa".
7. Per impostare l'intensità sopra lo sfondo locale, posizionare il cursore del mouse all'interno e all'esterno di una cella. Il valore dell'intensità viene visualizzato nella parte inferiore della finestra. Riduci leggermente l'intensità di una cella oscura per mostrare uniformemente l'intensità in tutta l'area di ciascuna cella. Definire questo valore di intensità come Intensità sopra lo sfondo locale . Questo valore deve essere impostato separatamente per ciascun canale.
8. Fare clic sul menu Screening e selezionare Utilità dati targhe. Nella finestra di dialogo Utilità dati targa , fare clic su Esegui analisi per selezionare la piastra.
9. Nel campo Impostazioni , selezionare l'impostazione salvata per l'analisi; selezionare Aggiungi all'elenco di esecuzione automatica, quindi fare clic su OK per eseguire l'analisi.
10. Al termine dell'analisi, fare clic sul menu Screening e selezionare Utilità dati targa. Quindi, nella finestra di dialogo Utilità dati targhe , fare clic su Esporta misurazioni per esportare i risultati dell'analisi.
11. Fare clic su Misure cella e immagine e quindi su OK.
12. Nella pagina Esportazione guidata misure - Passaggio 1 , selezionare la piastra e fare clic su Avanti.
13. Nella pagina Esportazione guidata misure - Passaggio 2 , fare clic su Fine.
14. Nella pagina Configura esportazione dati, selezionare i tipi di dati (ad esempio, nome del pozzo, numero totale totale delle celle, numero parziale delle celle per DAPI⁺, numero parziale delle celle per Texas Red⁺, numero parziale delle celle per FITC⁺, totale parziale delle celle per DAPI⁺Texas Red⁺, totale parziale delle celle per DAPI⁺FITC⁺, numero parziale delle celle DAPI⁺FITC⁺Texas Red⁺, percentuale di celle DAPI⁺, percentuale di celle DAPI⁺Texas Red⁺, percentuale di celle DAPI⁺FITC⁺ e percentuale di celle DAPI⁺Texas Red⁺FITC⁺) e quindi fare clic su OK.
15. Nella pagina Esporta come file di testo , selezionare la destinazione in cui salvare il file e fare clic su OK.
16. Apri il file in Microsoft Excel. I risultati saranno presentati da ciascun sito (Tabella 2). Ci sono 36 siti per pozzo. Utilizzando lo strumento di analisi, Tabella pivot, riepiloga i dati dei 36 siti (cioè le somme dei numeri di celle e le medie della percentuale di celle indicata in tutti i 36 siti) (Tabella 3).

Risultati

Dopo esperimenti di riprogrammazione, abbiamo quantificato gli iCM utilizzando l'analisi dell'imaging ad alto contenuto come descritto sopra. Nella Figura 1 sono state mostrate le immagini composite di 36 siti di imaging utilizzati per l'analisi di imaging ad alto contenuto. Le iCM sono definite come cellule doppie positive (α-actinina⁺Titina-eGFP⁺) in questi esperimenti. L'analisi dell'imaging ad alto contenuto mostra che ~26% delle c...

Discussione

I precedenti studi di riprogrammazione hanno valutato l'efficienza della riprogrammazione utilizzando la citometria a flusso e hanno dimostrato la qualità strutturale delle iCM utilizzando l'immunocitochimica in due esperimenti separati. L'analisi della citometria a flusso richiede un numero molto maggiore di cellule iniziali, aumentando così la scala degli esperimenti. Al contrario, l'analisi dell'imaging ad alto contenuto può valutare sia la qualità che la quantità della riprogram...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
anti-chicken Alexa 488	Thermofisher	A11039
anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262
anti-mouse Alexa 555	Thermofisher	A21422
anti-α-actinin antibody	Sigma	A7811
DAPI solution	Vector labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Insulin-Transferrin-SeleniumG supplement	Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM vitamin solution	Invitrogen	11120-052
MetaXpress software	Molecular device
Micro XL automated cell imagining system	Molecular device
Minimal essential amino acid solution	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
PES filter (0.45 µm)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E cells	Cell Biolabs	RV-101
Polybrene	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Universal blocking buffer	BiogeneX	HK083-50K