הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להפרדת תאים זקיקיים וביצית בזקיקים השחלות זברה, אשר יקל על חקירות של התפתחות השחלות ב זברה.

Abstract

זברה-פיש הפך למודל אידיאלי לחקר התפתחות השחלות של בעלי חוליות. הזקיק הוא היחידה הבסיסית של השחלה, המורכבת ביציות ותאי זקיקים שמסביב. חיוני להפריד הן תאים זקיקיים והן ביציות למטרות מחקר שונות כגון לתרבות ראשונית של תאים זקיקיים, ניתוח ביטוי גנים, התבגרות ביציות והפריה חוץ גופית וכו '. השיטה המקובלת משתמשת במלקחיים כדי להפריד בין שני התאים, שהם מייגעים, גוזלים זמן רב ויש להם נזק גבוה לבית החרמש. כאן, הקמנו שיטה פשוטה להפריד בין שני התאים באמצעות נימי זכוכית משוכים. תחת סטריאומיקרוסקופ, ביציות ותאי זקיק ניתן להפריד בקלות על ידי pipetting נימי זכוכית דק משך (הקוטר תלוי בקוטר זקיק). בהשוואה לשיטה המקובלת, שיטה חדשה זו יש יעילות גבוהה בהפרדת ביציות ותאים זקיקים ויש לו נזק נמוך ביציות. חשוב מכך, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על זקיקים בשלב מוקדם כולל בשלב טרום vitellogenesis. לכן, שיטה פשוטה זו יכולה לשמש כדי להפריד תאים זקיקים וביציטים של זברה.

Introduction

זברהפיש הוא אורגניזם מודל מרכזי לחקר התפתחות בעלי חוליות ופיזיולוגיה. דג הזברה יכול לשמש מודל טוב לחקר המנגנונים המולקולריים של התפתחות השחלות^1,2,3. תכונות רבות של התפתחות השחלות נשמרות הרבה במהלך האבולוציה מדגים ליונקים^1,2. בדומה בעלי חוליות אחרים, מבוגרים זברה יש שחלות אסינכרוניות, המכיל זקיקי השחלות של כל השלבים ההתפתחותיים⁴. הזקיק הוא מרכיב הרבייה הבסיסי של השחלה. הזקיק מורכב מן ביצית כי הוא מוקף אחד או כמה שכבות של תאים סומטיים הנקראים תאים זקיקים. התפתחות הזקיקים תלויה בתקשורת הדו-כיוונית בין ביציות לתאים זקיקיים⁵. חיוני להפריד תאים זקיקים וביצים מזקיקים בשחלות למטרות מחקר שונות כגון תרבות ראשונית של תאים זקיקים, ניתוח ביטוי גנים, התבגרות ביציות והפריה חוץ גופית.

שיטות ההפרדה המסורתיות כוללות הפרדה מכנית על ידי מלקחיים ועיכול אנזימטי^6,7,8,9,10. עם זאת, ההפרדה המכנית על ידי מלקחיים היא זמן רב ומייגע. זה גם יגרום לנזק גבוה ביצית במהלך ההפרדה. למרות ששיטת עיכול האנזים פשוטה לתפעול ודורשת זמן קצר, יש לאמת את זמן הטיפול ואת ריכוז האנזימים, ושיעור השלמות וההישרדות של ביציות מבודדות אינם אידיאליים. לכן, הקמנו שיטה פשוטה להפריד בין שני התאים בשלבים התפתחותיים שונים באמצעות צינורות נימי זכוכית משוכים.

Protocol

כל ההליכים המבוצעים בניסויי דגים הם בהתאם לתקנות ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הנורמלית הצפון-מערבית.

1. הכנות

1. חיות
   1. השתמש זברה נקבה בוגרת עם אורך גוף של 4-6 ס"מ.
      הערה: השתמשנו בזברהפיש משוק מקומי.
   2. שמור את דג הזברה במערכת מים מופצת עם אור 14 שעות ו 10 שעות מחזור כהה על 28 מעלות צלזיוס.
   3. להאכיל דגים פעמיים ביום עם שרימפס מלח שבקע לאחרונה.
2. נימי זכוכית משוכיים
   1. השתמש נימי זכוכית 15 ס"מ ומניחים את ראשו מבער אלכוהול כדי לחמם אותו. החזק קצה אחד של נימי זכוכית ביד והחזק את הקצה השני עם מלקחיים.
   2. לאחר חימום 5-10 שניות, הזכוכית על האש של מבער אלכוהול להיות אדום ורך. למתוח את הראש של נימי זכוכית עם מלקחיים כדי להפוך את הפתיחה נימי עם קוטר נדרש.
      הערה: הקוטר תלוי קטרים זקיק: previtellogenic (PV; קוטר של כ-0.30 מ"מ), ויטלוגני מוקדם (EV; קוטר של כ-0.40 מ"מ), מידוויטלוגני (MV; קוטר של כ-0.50 מ"מ), ויטלוגני מאוחר (קוטר של כ-0.60 מ"מ) וקוטרו מלא אך לא בוגר (FG; קוטר של כ-0.65 מ"מ).
   3. למתוח את הפתיחה של נימי זכוכית לקוטר המתאים, שהוא מעט קטן יותר בגודל של זקיקים מופרדים. נימי הזכוכית עם פתח גדול בהרבה מגודל זקיקי השחלות אינם יכולים לבצע הפרדה, אך הקטנים בהרבה ישברו את הזקיקים במהלך ההפרדה. תרגול מתיחה של נימי זכוכית מספר פעמים.
      הערה: זמן החימום תלוי בגודל נימי הזכוכית. אין למתוח ישירות את נימי הזכוכית על האש של מבער אלכוהול. זה ישבור את נימי הזכוכית.
   4. חותכים את נימי הזכוכית עם חותך אמפולה ולשבור את נימי זכוכית עם מלקחיים כדי לקבל חתך חלק.
      הערה: פתח חד או שבור של נימי הזכוכית יפגע בזקיקים.
   5. באמצעות צינור פלסטיק 30 ס"מ, להכניס קצה פיפטה 1 מ"ל עם אלמנט מסנן בקצה אחד, להכניס את נימי זכוכית משך בסוף פיפטה, ולחבר קצה פיפטה 200 μL בקצה אחר.

2. הפרדת ביציות זברה ותאי זקיק בשלבים שונים

1. ניתוח השחלה של דג הזברה
   1. ממלאים דלי קרח עד 4/5 מלא בקרח תרחיף ומוסיפים מספיק מי דגים כדי לאפשר לקרח תרחיף לצוף. המתן 2-5 דקות, בדוק את טמפרטורת המים, וודא שהטמפרטורה היא בין 2-4 מעלות צלזיוס.
   2. יש להנשים נקבות בוגרות על ידי הנחת דגים במי הקרח למשך 2-5 דקות לפחות, עד שהדגים יפסיקו את תנועת הזימים. ערפו את ראשם של הדגים על ידי ניתוק חוט השדרה באמצעות מספריים חדים כדי להבטיח את המוות.
   3. מניחים את הדג על צלחת הניתוח עם מלקחיים.
   4. השתמש בניתוח מספריים כדי לחתוך כדלקמן. לנתח מן הקלואקה לזימים לאורך קו האמצע של הבטן. חתוך מהחלק האחורי של הקלואקה. חותכים מהקצה הצדדי לצד הגבי. הסר בעדינות את העור והשרירים בצד אחד של הגוף. לחשוף את האיברים הפנימיים ולהוציא את השחלה כולה עם מלקחיים.
   5. מיד, מניחים את השחלות בעדינות לתוך צלחת תרבות 100 מ"מ המכיל 60% L-15 של ליבוביץ (L-15) בינוני.
2. בידוד זקיקי השחלות
   הערה: מערכת ההיערכות שאימצנו מבוססת על ההגדרה המקורית של סלמן ואח '⁴.
   1. באופן ידני לבודד זקיקים של שלבים שונים באמצעות זוג מלקחיים עדינים כמתואר בעבר⁸.
   2. קבץ את זקיקי השחלות לשלבים הבאים: שלבי PV, EV, MV, LV ו- FG.
3. הפרדת תאים זקיקיים וביצית מזקיקים בשחלות
   1. שים את זקיקי השחלות בשלבים שונים לתוך צלחת פטרי נקי המכיל 60% L-15 בינוני.
   2. באמצעות נימי זכוכית משך משלב 1.2, למצוץ את הזקיקים לתוך נימי זכוכית 2-3 ס"מ ולפוצץ אותם.
      הערה: כאשר קוטר הפתיחה של נימי הזכוכית מתאים, ניתן להפריד את הזקיק מן ביצית על ידי שאיפה פעם אחת.
      1. אם שכבת התא הזקיקית מחוברת לביצית בחוזקה, חזור 2-3 פעמים כדי להשיג הפרדה מלאה. הימנע ניסיונות מרובים לכפות זקיק דרך נימי קטן יותר, אשר יפגע זקיק.
         הערה: בתהליך של שאיפה ופיצוץ, השכבה הזקיקית נופלת ונפרדת מהביצית, ולבסוף, תאים זקיקיים וביציתות מקושטות מופרדים (איור 1).
   3. בריכה ביציות משופעת אך שלם ולאסוף את ביציות denuded ששרדו עבור מבחנים נוספים.
   4. כדי לחקור אם התאים הזקיקיים הופרדו מזקיקים שלמים, הכתימו את הזקיקים השלמים והפרידו ביציות עם 4',6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI).
      1. לתקן את הדגימות ב 4% paraformaldehyde אגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 1 שעה. לשטוף מספר פעמים על ידי PBS.
      2. כתם על ידי DAPI ב RT במשך 30 דקות. נשטף מספר פעמים עם PBS. הצג וצלם במיקרוסקופ פלואורסצנטי (למשל, לייקה DFC7000 T).
   5. כדי לאשר את ההפרדה הושלמה, לתקן את הזקיקים שלמים ואת ביציות מופרדות ב 4% paraformaldehyde אגירה לילה ב 4 °C (69 °F), ולהטביע בינוני הקפאת intissue (למשל, לייקה) ב -25 °C (69 °F).
      1. חותכים את הרקמות הקבועות על מיקרוטום, ועולים על מגלשות זכוכית.
      2. שטפו את המקטעים ב- PBS והמחישו את גרעיני התא באמצעות DAPI. הצג וצלם במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

3. הפריה חוץ גופית (IVM) והפריה חוץ גופית (הפריה חוץ גופית)

הערה: ההליך של IVM של IVF היה אחריו כמתואר קודם לכן עם שינוי מינורי ^11,12,13.

1. הכינו מדיום התבגרות טרי (+מדיום DHP) לפני ניתוח השחלות של נקבת דג הזברה הבוגרת. להכנת מדיום ההבשלה הטרי, הוסיפו 9 מ"ל של מדיום L-15 של ליבוביץ, pH 9.0, ל-15 מ"ל צינורות חרוטים. הוסף 10 μL של 17α-20β-dihydroxy-4 פרגנן-3-אחד (DHP) (5 מ"ג / מ"ל), 490 μL של dH₂O, ו 500 μL של 10% סרום שור אלבומין (BSA).
2. הכינו את הפתרון של האנק ופתרון E3 מראש. הכן את הפתרון של הנקס כמתואר על ידי Baars ואח^'14. הכן E3 בינוני: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄, ו 1-5% מתילן כחול.
3. בצע ניתוח של שחלת זברה-דג ובידוד של זקיקי השחלות כמו בשלבים 2.
4. לאסוף זקיקי במה בוגרים ולהשתמש כמו ביציות לא בוגרות. עבור כל נקבה בוגרת זברה, לפחות 150-200 זקיקי במה בוגרים יכולים להיות מבודדים. בחר את הזקיקים שלמים ובריאים עבור IVM.
5. דגירה זקיקי שלב בוגרים ב +DHP בינוני בצלחות 12-באר, בדיקה מעת לעת כדי להבטיח כי ביציות להישאר שלם. הסר את כל ביציות lysing עם פיפטה פסטר.
   הערה: במהלך התבגרות ביצית, ביציות יהפכו בהדרגה שקוף. רוב ביציות להיות שקוף לאחר טיפול DHP במשך 2 שעות. ניתן לראות זאת תחת מיקרוסקופ מנתח עם אופטיקת אור משודרת.
6. הסר את התאים הזקיקיים החיצוניים ביותר מכל ביצית בוגרת כמתואר בשלב 2.3.
7. מעבירים את הביציות המנוקדות לצלחת פטרי עם כמה טיפות של מדיום תרבותי וממשיכים להפריה.
8. הכינו את תמיסת הזרע הטרי באמצעות אשכים שנותחו מלפחות שלושה זכרים ב-500 μL של הפתרון של הנקס. שים את תמיסת הזרע על קרח, שם הוא יכול לשמור על העוצמה של הפריה עד 2-3 שעות.
9. הוסיפו 100 μL של תמיסת זרע ליציטים מנומרים והתבגרו על צלחת פטרי. מוסיפים בעדינות את תמיסת הזרע בין הביציות, ומסחררים את הזרע והביצים יחד בעזרת קצה פיפטה.
10. מיד להוסיף 1 מ"ל של פתרון בינוני E3 כדי להפעיל את הביציות ושוב בעדינות מערבולת ביצים וזרע באמצעות קצה פיפטה.
11. לאחר כדקה לאחר ההפריה (mpf), להציף את הצלחת עם פתרון בינוני E3. הרחבת chorion מלא ניתן לראות בתוך 10-15 mpf.
12. בין 35-45 mpf, בחר את העוברים העוברים מחשוף סימטרי לשלב 2 תאים, אשר מופרים ולכן מופרים. הסר עוברים שאינם עוברים מחשוף תאים.
13. אפשר לעוברים להתפתח בצלחת פטרי ב 28 מעלות צלזיוס, עם מגבלה של 80 עוברים לכל צלחת 10 ס"מ. הצג וצלם את התפתחות העובר.

תוצאות

שיטה זו יכולה לשמש כדי להפריד תאים זקיקים ביציות בשלבים שונים של התפתחות זקיק השחלות ב zebrafish. איור 1 מראה את ההפרדה בין ביציות זברה ותאי זקיקים מזקיקים בשחלות באמצעות צינור זכוכית נימי(איור 1). כדי לחקור אם התאים הזקיקיים הופרדו מזקיקים שלמים, הזקיקים שלמים ו...

Discussion

אנו מתארים כאן שיטה חדשנית להפרדה פשוטה ומהירה של תאים זקיקים וביציטים מזקיקים בשחלות זברה. לשיטה זו מספר יתרונות על פני השיטה המקובלת. העיקרי ביניהם הוא הקלות המוגברת מאוד של הפרדה עם יעילות ויעילות גבוהה, כמו רק מניפולציה אחת וחיצונית נדרשת. נקודה זו מגבירה את הישימות לחוקרים שאינם טובי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α,20β-DHP	Cayman	16146-5 (5 mg)
24-well plate	Corning	3524
Ampoule cutter	AS ONE	5-124-22 1 bag (100 pieces)
Anhydrous Na2HPO4	Kaixin Chemical	500 g
Brine shrimp	Hongjie	250 g
CaCl2	Beichen Fangzheng	500 g
Culture dish	Biosharp	BS-90-D (10PCS/PK)
DAPI	Solarbio	S2110 (25mL)
Dissecting Microscope	ZEISS	Stemi 305
Dissection forcep	VETUS	HRC30
Dissection scissor	Kefu	160 mm
Fluorescence Stereomicroscope	Leica	M205C
Glass capillary	IWAKI	IK-PAS-5P (200 pcs/PACK)
Hoechst 33342	Solarbio	C0031 (1 mg)
KCl	Beichen Fangzheng	500 g
KH2PO4	Kaixin Chemical	500 g
Leibovitz’s L-15 medium	Gibco	41300-039 (10×1L)
MgSO4•7H2O	Beichen Fangzheng	500 g
Micropipette tips	Axygen	MCT-150-C
NaCl	Beichen Fangzheng	500 g
NaHCO3	Beichen Fangzheng	500 g
Penicilia-streptomycia	Gibco	#15140122 (100 mL)
Stereomicroscope	ZEISS	Discover.v20