Разделение фолликулярной клетки и ооцитов в фолликулах яичников зебры

Резюме

Здесь мы представляем простой метод разделения фолликулярной клетки и яйцеклетки в фолликулах яичников зебры, что облегчит исследования развития яичников у зебры.

Аннотация

Зебрафиш стала идеальной моделью для изучения развития яичников позвоночных. Фолликул является основной единицей яичника, который состоит из яйцеклеток и окружающих фолликулярных клеток. Очень важно отделить фолликулярные клетки и яйцеклетки для различных исследовательских целей, таких как первичная культура фолликулярной клетки, анализ экспрессии генов, созревание яйцеклеток и экстракорпоральное оплодотворение и т.д. Обычный метод использует типсы, чтобы отделить оба отсека, что является трудоемким, трудоемким и имеет высокий урон яйцеклетки. Здесь мы создали простой метод, чтобы отделить оба отсека с помощью вытащил стеклянный капилляр. Под стереомикроскопом, яйцеклетки и фолликулярные клетки могут быть легко разделены трубопроводов в вытащил тонкой стеклянной капиллярной (диаметр зависит от диаметра фолликула). По сравнению с обычным методом, этот новый метод имеет высокую эффективность в разделении обоих яйцеклеток и фолликулярной клетки и имеет низкий ущерб яйцеклеток. Что еще более важно, этот метод может быть применен к фолликулам на ранних стадиях, в том числе на стадии превителлогенеза. Таким образом, этот простой метод может быть использован для отдельных фолликулярных клеток и яйцеклеток зебры.

Введение

Зебрафиш является основным моделью организма для изучения развития позвоночных и физиологии. Зебрафиш может служить хорошей моделью для изучения молекулярных механизмов развития яичников^1,2,3. Многие особенности развития яичников значительно сохранены в процессе эволюции от рыбы к^{млекопитающим 1,2.} Как и у других позвоночных, у взрослых зебры асинхронные яичники, содержащие фолликулы яичников всех стадий развития^4. Фолликул является основным репродуктивным элементом яичника. Фолликул состоит из яйцеклетки, которая окружена одним или несколькими слоями соматических клеток, называемых фолликулярными клетками. Развитие фолликулов зависит от двунаправленной связи между яйцеклетками и фолликулярными клетками^5. Очень важно отделить фолликулярные клетки и яйцеклетки от фолликулов яичников для различных исследовательских целей, таких как фолликулярная клеточная первичная культура, анализ экспрессии генов, созревание яйцеклеток и экстракорпоральное оплодотворение.

Традиционные методы разделения включают механическое разделение типсами и энзиматическое пищеварение^6,7,8,9,10. Тем не менее, механическое разделение типсами является трудоемким и трудоемким. Это также приведет к высокому повреждению яйцеклетки во время разделения. Хотя метод переваривания ферментов прост в эксплуатации и требует короткого времени, время лечения и концентрация ферментов должны быть проверены, и целостность и выживаемость изолированных яйцеклеток не являются идеальными. Таким образом, мы создали простой метод, чтобы отделить оба отсека на разных стадиях развития с помощью вытащил стеклянные капиллярные трубки.

протокол

Все процедуры, выполняемые в рыбных экспериментах, соответствуют правилам Комитета по этике экспериментов на животных Северо-Западного нормального университета.

1. Подготовка

1. животные
   1. Используйте взрослую самку зебры с длиной тела 4-6 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали зебру с местного рынка.
   2. Держите зебру в циркулированную систему водоснабжения с 14 ч света и 10 ч темного цикла около 28 градусов по Цельсию.
   3. Кормите рыбу два раза в день недавно вылупившихся рассолом креветок.
2. Вытащил стеклянный капилляр
   1. Используйте 15-сантиметровый стеклянный капилляр и поместите его голову в горелку для алкоголя, чтобы нагреть его. Держите один конец стеклянной капиллярной руки и держите другой конец типсами.
   2. После нагрева через 5-10 секунд стекло при возгорании спиртовой горелки становится красным и мягким. Растянуть голову стеклянной капиллярной с типсами, чтобы капиллярное отверстие с требуемым диаметром.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр зависит от диаметров фолликула: превителлогенный (PV; около 0,30 мм в диаметре), ранний вителлогенный (EV; около 0,40 мм в диаметре), мидвителлогенный (MV; около 0,50 мм в диаметре), поздний вителлогенный (LV; около 0,60 мм в диаметре) и полностью выращенный, но незрелый (FG; около 0,65 мм в диаметре).
   3. Растянуть отверстие стеклянной капиллярной до соответствующего диаметра, который немного меньше размера разделенных фолликулов. Стеклянные капилляры с отверстием гораздо больше, чем размер фолликулов яичников не может выполнять разделение, но гораздо меньше из них будет разорвать фолликулов во время разделения. Практика растяжения стеклянной капиллярной несколько раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время нагрева зависит от размера стеклянной капиллярной. Не напрямую растягивайте стеклянную капиллярную часть на огонь спиртовой горелки. Он разбеет стеклянную капиллярную.
   4. Вырезать стеклянный капилляр с резаком ампулы и разорвать стеклянный капилляр с типсами, чтобы получить плавный разрез.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Резкое или сломанное отверстие стеклянного капилляра повредит фолликулы.
   5. Используя пластиковую трубку диаметром 30 см, вставьте наконечник пипетки 1 мл с фильтром на одном конце, вставьте вытянутую стеклянную капиллярную пленку в конце пипетки и соедините наконечник пипетки 200 йл на другом конце.

2. Разделение яйцеклеток зебры и фолликулярной клетки на разных стадиях

1. Рассечение яичников зебры
   1. Заполните ведро со льдом до 4/5 полный со льдом суспензии и добавить достаточное количество рыбной воды, чтобы суспензии льда плавать. Подождите 2-5 минут, проверьте температуру воды, и убедитесь, что температура между 2-4 градусов по Цельсию.
   2. Обезботь взрослых самок, поместив рыбу в ледяную воду, по крайней мере 2-5 минут, пока рыба остановить жаберное движение. Обезглавить рыбу, разодровив спинной мозг с помощью острых ножниц для обеспечения смерти.
   3. Поместите рыбу на вскрытии пластины с типсами.
   4. Используйте рассечение ножницами, чтобы сократить следующим образом. Рассекаете от клоаки до жабры вдоль средней линии живота. Вырезать из задней части клоака. Отрежьте от переднего кончика к спинной стороне. Аккуратно удалите кожу и мышцы с одной стороны тела. Разоблачить внутренние органы и вытащить весь яичник с типсами.
   5. Немедленно аккуратно поместите яичники в 100-мм культурную тарелку, содержащую 60% L-15 (L-15) среды Лейбовица.
2. Изоляция фолликулов яичников
   ПРИМЕЧАНИЕ: Постановочная система, которую мы приняли, основана на первоначальном определении Selman et al.⁴.
   1. Вручную изолировать фолликулы различных стадий, используя пару тонких типсов, как описано^{ранее 8}.
   2. Сгруппив фолликулы яичников на следующие этапы: П.В., EV, MV, LV и FG этапов.
3. Отделение фолликулярной клетки и яйцеклетки от фолликулов яичников
   1. Положите фолликулы яичников на разных стадиях в чистую чашку Петри, содержащую 60% L-15 среды.
   2. Используя вытащил стеклянный капилляр из шага 1.2, сосать фолликулы в стеклянный капилляр 2-3 см и выдуть их.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда открытие диаметр стеклянных капилляров является целесообразным, фолликул может быть отделен от яйцеклетки путем вдыхания один раз.
      1. Если фолликулярный слой клеток крепится к яйцеклетке твердо, повторите 2-3 раза, чтобы выполнить полное разделение. Избегайте многочисленных попыток заставить фолликул через меньший капилляр, который повредит фолликул.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе вдыхания и выдувания фолликулярный слой отпадает и отделяется от яйцеклетки, и, наконец, фолликулярные клетки и огорные ооциты отделяются(рисунок 1).
   3. Бассейн оголглые, но нетронутые яйцеклетки и собирать выживших оголдовавших яйцеклеток для дальнейших анализов.
   4. Чтобы выяснить, были ли фолликулярные клетки отделены от нетронутых фолликулов, окрашивать нетронутые фолликулы и отделять яйцеклетки 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI).
      1. Исправить образцы в 4% буферных параформальдегид при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч. Вымойте несколько раз PBS.
      2. Пятно от DAPI на RT в течение 30 мин. Промывают несколько раз с PBS. Просмотр и фотографирование с помощью флуоресцентной микроскопа (например, Leica DFC7000 T).
   5. Чтобы подтвердить завершенное разделение, зафиксировать нетронутые фолликулы и разделенные яйцеклетки в 4% буферизированных параформальдегида на ночь при 4 градусов по Цельсию, и вставлять intissue замораживания среды (например, Leica) при -25 градусов по Цельсию.
      1. Вырезать фиксированные ткани на микротоме, и установить на стеклянные горки.
      2. Вымойте секции в PBS и визуализировать ядра клеток с DAPI. Просмотр и фотографирование на флуоресцентный микроскоп.

3. Созревание in vitro (IVM) и экстракорпоральное оплодотворение (IVF)

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура IVM ЭКО последовала, как описано ранее с незначительной ^{модификацией 11,12,13}.

1. Приготовьте свежую среду созревания (среды DHP) перед вскрытием яичников у взрослой самки зебры. Для приготовления свежей среды созревания добавьте 9 мл L-15 среды Лейбовица, рН 9,0, до 15 мл конических трубок. Добавьте 10 л 17'-20'-дигидрокси-4 прегнен-3-один (DHP) (5 мг/мл), 490 л dH₂O и 500 л 10% бычьего альбумин сыворотки (BSA).
2. Подготовь решение Хэнка и решение E3 заранее. Подготовь решение Хэнкса, как описано Baars et al.¹⁴. Подготовка E3 средний: 5 мм NaCl, 0,17 мм ККл, 0,33 мМ CaCl₂, 0,33 мМ_{МгСО 4}, и 1-5% метиленовый синий.
3. Выполните вскрытие яичников зебры и изоляции фолликулов яичников, как в шагах шаг 2.
4. Соберите полноценные выращенные сценические фолликулы и используйте в качестве незрелых яйцеклеток. Для каждой взрослой самки зебры, по крайней мере 150-200 полных выращенных фолликулов стадии могут быть изолированы. Выберите нетронутые и здоровые фолликулы для IVM.
5. Инкубировать полную стадию фолликулов в среде DHP в 12-хорошо пластин, периодически проверяя, чтобы убедиться, что яйцеклетки остаются нетронутыми. Удалите любые лизные яйцеклетки с пипеткой Pasteur.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время созревания яйцеклеток, яйцеклетки станут постепенно полупрозрачными. Большинство яйцеклеток становятся полупрозрачными после лечения DHP в течение 2 ч. Это можно наблюдать под рассеченным микроскопом с передаваемой световой оптикой.
6. Удалите внешние фолликулярные клетки из каждого созреваемого яйцеклетки, как описано в шаге 2.3.
7. Перенесите оголглые яйцеклетки в чашку Петри с несколькими каплями среды культуры и приступайте к оплодотворению.
8. Подготовь свежий раствор спермы с помощью яитесов, расчлененных по крайней мере у трех самцов в 500 МКЛ раствора Хэнкса. Положите раствор спермы на лед, где он может сохранить свою потенцию оплодотворения на срок до 2-3 ч.
9. Добавьте 100 мкл раствора спермы в оголглые и созреваемые яйцеклетки на чашке Петри. Аккуратно добавьте раствор спермы среди яйцеклеток, и закружить сперму и яйца вместе с помощью наконечника пипетки.
10. Немедленно добавьте 1 мл среднего раствора E3, чтобы активировать яйца и снова аккуратно закружить яйца и сперму с помощью наконечника пипетки.
11. Примерно через 1 минуту после оплодотворения (mpf), затопить пластину со средним раствором E3. Полное расширение хориона можно наблюдать в пределах 10-15 mpf.
12. Между 35-45 mpf, выберите эмбрионы, которые проходят симметричное расщепление в 2-клеточной стадии, и которые поэтому оплодотворены. Удалите эмбрионы, которые не подвергаются расщеплению клеток.
13. Разрешить эмбрионы развиваться в чашке Петри при 28 градусов по Цельсию, с ограничением 80 эмбрионов на 10 см пластины. Просмотр и фотографирование развития эмбриона.

Результаты

Этот метод может быть использован для отдельных фолликулярных клеток и яйцеклеток на разных стадиях развития фолликула яичников у зебры. На рисунке 1 показано отделение яйцеклеток зебры и фолликулярной клетки от фолликулов яичников с помощью капиллярной стеклянной тр...

Обсуждение

Мы описываем здесь новый метод для простого и быстрого отделения фолликулярной клетки и яйцеклетки от фолликулов яичников зебры. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с обычным методом. Главным из них является значительно возросшей легкостью разделения с высокой эффективност...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α,20β-DHP	Cayman	16146-5 (5 mg)
24-well plate	Corning	3524
Ampoule cutter	AS ONE	5-124-22 1 bag (100 pieces)
Anhydrous Na2HPO4	Kaixin Chemical	500 g
Brine shrimp	Hongjie	250 g
CaCl2	Beichen Fangzheng	500 g
Culture dish	Biosharp	BS-90-D (10PCS/PK)
DAPI	Solarbio	S2110 (25mL)
Dissecting Microscope	ZEISS	Stemi 305
Dissection forcep	VETUS	HRC30
Dissection scissor	Kefu	160 mm
Fluorescence Stereomicroscope	Leica	M205C
Glass capillary	IWAKI	IK-PAS-5P (200 pcs/PACK)
Hoechst 33342	Solarbio	C0031 (1 mg)
KCl	Beichen Fangzheng	500 g
KH2PO4	Kaixin Chemical	500 g
Leibovitz’s L-15 medium	Gibco	41300-039 (10×1L)
MgSO4•7H2O	Beichen Fangzheng	500 g
Micropipette tips	Axygen	MCT-150-C
NaCl	Beichen Fangzheng	500 g
NaHCO3	Beichen Fangzheng	500 g
Penicilia-streptomycia	Gibco	#15140122 (100 mL)
Stereomicroscope	ZEISS	Discover.v20