Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish

Riepilogo

Qui presentiamo un metodo semplice per separare le cellule follicolari e gli ovociti nei follicoli ovarici di zebrafish, che faciliterà le indagini sullo sviluppo ovarico nel pesce zebra.

Abstract

Zebrafish è diventato un modello ideale per studiare lo sviluppo ovarico dei vertebrati. Il follicolo è l'unità di base dell'ovaio, che consiste di ovociti e cellule follicolari circostanti. È fondamentale separare sia le cellule follicolari che gli ovociti per vari scopi di ricerca come per la coltura primaria di cellule follicolari, l'analisi dell'espressione genica, la maturazione degli ovociti e la fecondazione in vitro, ecc. Il metodo convenzionale utilizza le forcep per separare entrambi i compartimenti, il che è laborioso, richiede molto tempo e ha alti danni all'ovocita. Qui, abbiamo stabilito un metodo semplice per separare entrambi i compartimenti utilizzando un capillare in vetro tirato. Sotto uno stereomicroscopio, gli ovociti e le cellule follicolari possono essere facilmente separati mediante pipettazione in un capillare di vetro fine tirato (il diametro dipende dal diametro del follicolo). Rispetto al metodo convenzionale, questo nuovo metodo ha un'alta efficienza nella separazione sia degli ovociti che delle cellule follicolari e ha bassi danni agli ovociti. Ancora più importante, questo metodo può essere applicato ai follicoli in fase iniziale anche nella fase pre-vitellogenesi. Pertanto, questo semplice metodo può essere utilizzato per separare le cellule follicolari e gli ovociti del pesce zebra.

Introduzione

Zebrafish è un importante organismo modello per lo studio dello sviluppo e della fisiologia dei vertebrati. Il pesce zebra può servire come un buon modello per lo studio dei meccanismi molecolari dello sviluppo^{ovarico 1,2,3}. Molte caratteristiche dello sviluppo ovarico sono molto conservate durante l'evoluzione dai pesci ai mammiferi^1,2. Simile agli altri vertebrati, gli adulti zebrafish hanno ovaie asincrone, contenenti follicoli ovarico di tutte le fasi di sviluppo⁴. Il follicolo è l'elemento riproduttivo fondamentale dell'ovaio. Il follicolo è costituito dall'ovocitio che è circondato da uno o più strati di cellule somatiche chiamate cellule follicolari. Lo sviluppo dei follicoli dipende dalla comunicazione bidirezionale tra ovociti e cellule follicolari⁵. È fondamentale separare le cellule follicolari e gli ovociti dai follicoli ovarici per diversi scopi di ricerca come la coltura primaria delle cellule follicolari, l'analisi dell'espressione genica, la maturazione degli ovociti e la fecondazione in vitro.

I metodi di separazione tradizionali includono la separazione meccanica mediante forcep e digestione^{enzimatica 6,7,8,9,10}. Tuttavia, la separazione meccanica per forcep è dispendiosa in termini di tempo e laboriosa. Causerà anche l'alto danno all'ovocita durante la separazione. Sebbene il metodo di digestione enzimatica sia semplice da usare e richieda un breve periodo di tempo, il tempo di trattamento e la concentrazione enzimatica devono essere convalidati e il tasso di integrità e sopravvivenza degli ovociti isolati non è l'ideale. Pertanto, abbiamo stabilito un metodo semplice per separare entrambi i compartimenti in diversi stadi di sviluppo utilizzando tubi capillari in vetro tirato.

Protocollo

Tutte le procedure eseguite negli esperimenti sui pesci sono conformi alle normative del Comitato Etico per la Sperimentazione Animale della Northwest Normal University.

1. Preparativi

1. animali
   1. Usa il pesce zebra femmina adulto con una lunghezza del corpo di 4-6 cm.
      NOTA: Abbiamo usato il pesce zebra di un mercato locale.
   2. Mantenere il pesce zebra in un sistema idrico circolato con una luce di 14 ore e un ciclo buio di 10 ore a circa 28 °C.
   3. Nutrire il pesce due volte al giorno con gamberetti salamoia appena nati.
2. Capillare in vetro tirato
   1. Utilizzare un capillare di vetro di 15 cm e posizionare la testa in un bruciatore di alcol per riscaldarlo. Tenere un'estremità del vetro capillare a mano e tenere l'altra estremità con le forcep.
   2. Dopo aver riscaldato 5-10 secondi, il vetro sul fuoco del bruciatore di alcol diventa rosso e morbido. Allungare la testa del capillare di vetro con le forcep per rendere l'apertura capillare con il diametro richiesto.
      NOTA: Il diametro dipende dai diametri del follicolo: previtellogenico (PV; circa 0,30 mm di diametro), vitellogenico precoce (EV; circa 0,40 mm di diametro), midvitellogenico (MV; circa 0,50 mm di diametro), vitellogenico tardivo (LV; circa 0,60 mm di diametro) e pieno ma immaturo (FG; circa 0,65 mm di diametro).
   3. Allungare l'apertura del capillare di vetro al diametro appropriato, che è leggermente più piccolo delle dimensioni dei follicoli separati. Il capillare di vetro con un'apertura molto più grande delle dimensioni dei follicoli ovarico non può eseguire la separazione, ma quelli molto più piccoli romperebbero i follicoli durante la separazione. Praticare più volte lo stiramento del capillare di vetro.
      NOTA: Il tempo di riscaldamento dipende dalle dimensioni del capillare di vetro. Non allungare direttamente il capillare di vetro sul fuoco del bruciatore di alcol. Romperà il capillare di vetro.
   4. Tagliare il capillare in vetro con una fresa ad ampolla e rompere il capillare di vetro con le forcep per ottenere un'incisione liscia.
      NOTA: Un'apertura affilata o rotta del capillare di vetro danneggerebbe i follicoli.
   5. Utilizzando un tubo di plastica da 30 cm, inserire una punta della pipetta da 1 ml con un elemento filtrante ad un'estremità, inserire il capillare di vetro tirato all'estremità della pipetta e collegare una punta della pipetta da 200 μL su un'altra estremità.

2. Separazione degli ovociti zebrafish e delle cellule follicolari in diverse fasi

1. Dissezione dell'ovaio zebrafish
   1. Riempire un secchio di ghiaccio a 4/5 pieno di ghiaccio liquame e aggiungere acqua di pesce sufficiente per far galleggiare il ghiaccio liquame. Attendere 2-5 minuti, controllare la temperatura dell'acqua e assicurarsi che la temperatura sia compresa tra 2-4 °C.
   2. Anestetizza le femmine adulte posizionando i pesci nell'acqua ghiacciata per almeno 2-5 minuti, fino a quando i pesci non interrompo il movimento delle branchie. Decapitare il pesce tagliando il midollo spinale usando forbici affilate per garantire la morte.
   3. Posizionare il pesce sulla piastra di sezionazione con le forcep.
   4. Utilizzare le forbici sezionanti per tagliare come segue. Sezionare dalla cloaca alle branchie lungo la linea mediana dell'addome. Tagliato dal retro della cloaca. Tagliare dalla punta anteriore al lato dorsale. Rimuovere delicatamente la pelle e i muscoli su un lato del corpo. Esporre gli organi interni ed esegnare l'intera ovaia con le forcep.
   5. Immediatamente, posizionare delicatamente le ovaie in un piatto di coltura da 100 mm contenente il mezzo L-15 (L-15) di Leibovitz al 60%.
2. Isolamento dei follicoli ovarico
   NOTA: Il sistema di staging che abbiamo adottato si basa sulla definizione originale di Selman et^al.
   1. Isolare manualmente follicoli di stadi diversi utilizzando una coppia di forcep fini come descritto in precedenza⁸.
   2. Raggruppare i follicoli ovarico nelle seguenti fasi: stadi PV, EV, MV, LV e FG.
3. Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti dai follicoli ovarici
   1. Mettere i follicoli ovarico in diverse fasi in una piastra di Petri pulita contenente il 60% di mezzo L-15.
   2. Utilizzando il capillare di vetro tirato dal passo 1.2, succhiare i follicoli nel capillare di vetro di 2-3 cm e soffiarli fuori.
      NOTA: Quando il diametro di apertura dei capillari di vetro è appropriato, il follicolo può essere separato dall'ovocita per inalazione una volta.
      1. Se lo strato cellulare follicolare è attaccato saldamente all'ovocita, ripetere 2-3 volte per eseguire una separazione completa. Evitare molteplici tentativi di forzare un follicolo attraverso un capillare più piccolo, che danneggerebbe il follicolo.
         NOTA: Nel processo di inalazione e soffiatura, lo strato follicolare cade e si separa dall'ovociti e, infine, le cellule follicolari e gli ovociti denudati sono separati(Figura 1).
   3. Mettere in comune gli ovociti denudati ma intatti e raccogliere gli ovociti denudati sopravvissuti per ulteriori saggi.
   4. Per verificare se le cellule follicolari sono state separate da follicoli intatti, macchiare i follicoli intatti e separare gli ovociti con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
      1. Fissare i campioni in paraformaldeide tamponata al 4% a temperatura ambiente (RT) per 1 h. Lavare più volte da PBS.
      2. Macchia da DAPI a RT per 30 min. Lavato più volte con PBS. Visualizza e fotografa con un microscopio a fluorescenza (ad esempio, Leica DFC7000 T).
   5. Per confermare la separazione completata, fissare i follicoli intatti e gli ovociti separati in paraformaldeide tamponata al 4% durante la notte a 4 °C e incorporare il mezzo di congelamento dell'intissue (ad esempio, Leica) a -25 °C.
      1. Tagliare i tessuti fissi su un microtomo e montare su scivoli di vetro.
      2. Lavare le sezioni in PBS e visualizzare i nuclei cellulari con DAPI. Visualizza e fotografa su un microscopio a fluorescenza.

3. Maturazione in vitro (IVM) e fecondazione in vitro (FIV)

NOTA: La procedura di IVM di fecondazione in vitro è stata seguita come descritto in precedenza con modifica ^{minore 11,12,13}.

1. Preparare il mezzo di maturazione fresco (+DHP medium) prima della dissezione dell'ovaio dalla femmina adulta di zebrafish. Per preparare il mezzo di maturazione fresco, aggiungere 9 ml del mezzo L-15 di Leibovitz, pH 9,0, a tubi conici da 15 ml. Aggiungere 10 μL di 17α-20β-diidrossi-4 pregnen-3-one (DHP) (5 mg/mL), 490 μL di dH₂O e 500 μL di albumina sierica bovina al 10% (BSA).
2. Preparare in anticipo la soluzione Hank e la soluzione E3. Preparare la soluzione di Hanks come descritto da Baars et^al. Preparare mezzo E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄e 1-5% Methylene Blu.
3. Eseguire la dissezione dell'ovaio di zebrafish e l'isolamento dei follicoli ovarico come nei passaggi 2.
4. Raccogli follicoli da stadio adulti e usalo come ovociti immaturi. Per ogni femmina adulta di zebrafish, almeno 150-200 follicoli a stadio adulto possono essere isolati. Selezionare i follicoli integri e sani per IVM.
5. Incubare i follicoli da stadio adulti in mezzo +DHP in piastre da 12 po ', controllando periodicamente per garantire che gli ovociti rimangano intatti. Rimuovere eventuali ovociti di lysing con una pipetta Pasteur.
   NOTA: Durante la maturazione degli ovociti, gli ovociti diventeranno progressivamente traslucidi. La maggior parte degli ovociti diventa traslucida dopo il trattamento del DHP per 2 ore. Questo può essere osservato al microscopio sezionato con ottica a luce trasmessa.
6. Rimuovere le cellule follicolari più ose da ogni ovociti maturato come descritto nel passaggio 2.3.
7. Trasferire gli ovociti denudati in una piastra di Petri con alcune gocce di mezzo di coltura e procedere alla fecondazione.
8. Preparare la soluzione di sperma fresco utilizzando teste sezionate da almeno tre maschi in 500 μL della soluzione di Hanks. Metti la soluzione di sperma sul ghiaccio, dove può mantenere la sua potenza di fecondazione fino a 2-3 ore.
9. Aggiungere 100 μL di soluzione spermatica agli ovociti denudati e maturati su una piastra di Petri. Aggiungere delicatamente la soluzione di spermatozoi tra le uova e ruotare lo sperma e le uova insieme usando una punta di pipetta.
10. Aggiungere immediatamente 1 mL di soluzione media E3 per attivare le uova e di nuovo ruotare delicatamente uova e spermatozoi utilizzando una punta di pipetta.
11. Dopo circa 1 minuto di post-fecondazione (mpf), inondare la piastra con soluzione media E3. L'espansione completa del corrione può essere osservata entro 10-15 mpf.
12. Tra 35-45 mpf, selezionare gli embrioni che sono sottoposti a scissione simmetrica nello stadio a 2 cellule e che vengono quindi fecondati. Rimuovere gli embrioni che non sono sottoposti a scissione cellulare.
13. Consentire agli embrioni di svilupparsi nella piastra di Petri a 28 °C, con un limite di 80 embrioni per piastra di 10 cm. Visualizza e fotografa lo sviluppo dell'embrione.

Risultati

Questo metodo può essere utilizzato per separare cellule follicolari e ovociti in diverse fasi dello sviluppo del follicolo ovarico nel pesce zebra. La figura 1 mostra la separazione degli ovociti zebrafish e delle cellule follicolari dai follicoli ovarici utilizzando un tubo di vetro capillare (Figura 1). Per verificare se le cellule follicolari fossero separate da follicoli intatti, i follicoli intatti e gli ovociti separati da diversi stadi dei follicoli dal...

Discussione

Descriviamo qui un nuovo metodo per la semplice e rapida separazione delle cellule follicolari e degli ovociti dai follicoli ovarici di zebrafish. Questo metodo ha diversi vantaggi rispetto al metodo convenzionale. Il principale di questi è la facilità di separazione notevolmente aumentata con alta efficienza ed efficacia, in quanto è necessaria una sola manipolazione esterna. Questo punto aumenta l'applicabilità ai ricercatori che non sono bravi nell'anatomia microscopica. Secondo la nostra esperienza, si possono se...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α,20β-DHP	Cayman	16146-5 (5 mg)
24-well plate	Corning	3524
Ampoule cutter	AS ONE	5-124-22 1 bag (100 pieces)
Anhydrous Na2HPO4	Kaixin Chemical	500 g
Brine shrimp	Hongjie	250 g
CaCl2	Beichen Fangzheng	500 g
Culture dish	Biosharp	BS-90-D (10PCS/PK)
DAPI	Solarbio	S2110 (25mL)
Dissecting Microscope	ZEISS	Stemi 305
Dissection forcep	VETUS	HRC30
Dissection scissor	Kefu	160 mm
Fluorescence Stereomicroscope	Leica	M205C
Glass capillary	IWAKI	IK-PAS-5P (200 pcs/PACK)
Hoechst 33342	Solarbio	C0031 (1 mg)
KCl	Beichen Fangzheng	500 g
KH2PO4	Kaixin Chemical	500 g
Leibovitz’s L-15 medium	Gibco	41300-039 (10×1L)
MgSO4•7H2O	Beichen Fangzheng	500 g
Micropipette tips	Axygen	MCT-150-C
NaCl	Beichen Fangzheng	500 g
NaHCO3	Beichen Fangzheng	500 g
Penicilia-streptomycia	Gibco	#15140122 (100 mL)
Stereomicroscope	ZEISS	Discover.v20